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篇1

【摘要】 目的：探討白細胞介素10（interleukin10， IL10）基因的單核苷酸多態性（singlenucleotide polymorphism， SNP）與乙型病毒性肝炎（乙肝）后肝硬化中醫證候的關聯。方法：運用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism， PCRRFLP）和聚合酶鏈反應連接酶檢測（polymerase chain reactionligase detection reaction， PCRLDR）相結合的測序方法，檢測226例乙肝后肝硬化患者IL10592 A/C、819 C/T和1082 G/A位點的多態性，分析其基因型和等位基因頻率的分布，以及這3個SNP位點與乙肝后肝硬化中醫證候之間的關系。結果：IL10819位點C等位基因在脾虛濕盛證出現的頻率明顯高于非脾虛濕盛證（P＜0.001），TT基因型在肝氣郁結證出現的頻率明顯高于非肝氣郁結證（P＜0.05）。IL10592 A/C和1082 G/A位點的多態性與乙肝后肝硬化中醫證候之間未發現有顯著的關聯（P>0.05）。結論：IL10819位點C等位基因可能與乙肝后肝硬化患者形成脾虛濕盛證相關，而其TT基因型可能與肝硬化患者形成肝氣郁結證相關。

【關鍵詞】 乙型肝炎; 肝硬化; 多態性， 單核苷酸; 證候

Methods: The genotypes of IL10592 A/C， 819 C/T and 1082 G/A sites were determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP)， and polymerase chain reactionligase detection reaction (PCRLDR) combined with the sequencing analysis in 226 cases of posthepatitis B cirrhosis. The genotype and allele frequency distribution， and the relationship between the SNPs and TCM syndromes were analyzed.

Results: The frequency of allele C at IL10819 point in spleen deficiency with overabundance of dampness syndrome was significantly higher than that in nonspleen deficiency with overabundance of dampness (P＜0.01) syndrome， and genotype TT in liver stagnation syndrome was significantly higher than that in nonliver stagnation syndrome (P＜0.05). There was no significant relationship between the polymorphisms of IL10592 A/C， 1082 G/A and the TCM syndromes in posthepatitis B cirrhosis (P>0.05).

Conclusion: In patients with posthepatitis B cirrhosis， allele C in IL10819 locus may be related to spleen deficiency with overabundance of dampness syndrome， and TT genotype in IL10819 locus may be related to liver stagnation syndrome.

Keywords: hepatitis B; liver cirrhosis; polymorphism， single nucleotide; syndrome

肝硬化是我國臨床最常見的慢性進行性肝病，乙型病毒性肝炎（乙肝）是引起肝硬化的主要原因之一。中醫對乙肝后肝硬化的診療具有整體動態調整和個體化治療的特點，辨證施治不但能改善臨床癥狀及肝功能，提高患者生活質量，而且可抑制肝臟炎癥反應及纖維組織增生，促進肝纖維化的逆轉［1］。闡明中醫藥個體化診療有效性的機制，為中醫辨證論治尋找客觀的物質基礎，對中醫臨床有效診治肝硬化意義重大。本研究基于中醫體質學說和病證結合的研究思路，從基因多態性角度出發，探討白細胞介素10（interleukin10， IL10）基因的單核苷酸多態性（singlenucleotide polymorphism， SNP）與乙肝后肝硬化中醫證候的關聯。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 自2007年1月到2008年12月，從上海中醫藥大學附屬龍華醫院、曙光醫院、普陀醫院和岳陽中西醫結合醫院收集了226例乙肝后肝硬化病例，年齡為18～65歲，其中男性153例，女性73例。

1.1.2 診斷標準 乙肝后肝硬化診斷標準參考《病毒性肝炎防治方案》［2］。肝硬化中醫辨證標準參照《肝硬化臨床診斷、中醫辨證和療效評定標準（試行方案）》［3］診斷為肝氣郁結證（42例）、脾虛濕盛證（38例）、濕熱內蘊證（39例）、血瘀證（52例）、肝腎陰虛證（46例）和脾腎陽虛證（9例）共6個肝硬化中醫證型，由3位副主任或主任醫師分別根據226例乙肝后肝硬化中醫臨床資料進行辨證分型，對辨證分型不一致的病例經討論后確定其中醫證型。

1.1.3 排除標準 所有乙肝后肝硬化病例均排除由其他肝炎病毒感染或酒精、藥物等其他因素引起的肝硬化。

1.2 研究方法

1.2.1 血液標本采集和處理 取病人空腹靜脈血1 mL，置于含有乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid， EDTA）的2 mL凍存管內（血液∶EDTA=10∶1），蓋好混勻。3 000 r/min，4 ℃離心5 min，分離上清液，沉淀物即血細胞，置于－80 ℃冰箱內保存，以備DNA提取用。

1.2.2 DNA提取 采用DNA提取試劑盒（TIANGEN），用以上血細胞來提取DNA，具體操作參照TIANGEN公司人全血DNA提取試劑盒說明書。

1.2.3 基因型檢測

1.2.3.1 聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性檢測 IL10592位點的基因多態性分析采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism， PCRRFLP）方法。IL10592的上游引物是5'GGT GAG CAC TAC CTG ACT AGC3'；下游引物是5'CCT AGG TCA CAG TGA CGT GG3';產物片段：412 bp。PCR擴增反應體系為基因組DNA 2 μL、上下游引物各1 μL（10 μmol/L）、Taq酶（寶生物工程大連有限公司）1 U、10×PCR 緩沖液 2 μL、MgCl2 2 μL（25 mmol/L）和dNTPs 2 μL（2.5 mmol/L），加去離子水補至20 μL。使用DNA循環合成儀（Ampgene 9700），先94 ℃預變性5 min，再94 ℃變性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共進行40個循環，最后72 ℃ 10 min。將10 μL PCR產物、0.5 μL Afai（寶生物大連工程有限公司）、3 μL去離子水和1.5 μL 10×緩沖液加入同一EP管中，于37 ℃水浴箱中消化2 h。酶切產物加3 μL 6×上樣緩沖液混勻后于3%瓊脂糖凝膠中電泳，90 V水平電泳（Tanon EPs 300）1.5 h。于凝膠成像系統（Alpha Innotech）下拍照，與分子量標記物比較各片段大小。純合子AA基因型為176 bp和236 bp片斷，純合子CC基因型為412 bp片斷，雜合子AC基因型為176 bp、236 bp 和412 bp片斷。

1.2.3.2 聚合酶鏈反應連接酶檢測 IL101082G/A和819C/T位點多態性采用聚合酶鏈反應連接酶檢測（polymerase chain reactionligase detection reaction， PCRLDR）技術分析。PCR擴增反應體系為基因組DNA 1 μL、上下游引物各0.25 μL（10 μmol/L）、Taq酶0.2 μL、10×PCR 緩沖液 2 μL和 dNTPs 0.3 μL（2.5 mmol/L），加去離子水補至15 μL。先94 ℃預變性2 min，再94 ℃變性20 s，62 ℃退火 20 s，72 ℃延伸40 s，共進行40個循環，最后72 ℃ 3 min。以上PCR產物2 μL，10×Taq DNA 連接酶緩沖液1 μL，Taq DNA 連接酶（40 U/μL）0.125 μL，每條探針（10 bp）0.01 μL，加去離子水補至10 μL。先94 ℃ 30 s，再60 ℃ 3 min，共進行20個循環。取1 μL連接產物，加2 μL上樣loading Dye 95 ℃變性3 min，立即冰水浴，然后上測序儀（ABI 377型）檢測。上下游引物、探針和產物大小見表1。該實驗過程和基因型分析在上海捷瑞生物工程有限公司實驗室實施。

表1 PCRLDR法所用引物、探針和產物大小（略）

Table 1 Sequences of primers， probes and size of products in PCRLDR

1.2.3.3 測序 為驗證檢測方法的準確性，每一個位點均從所有樣本中隨機抽取5%的樣本進行測序檢驗。測序委托生物芯片上海國家工程研究中心實驗室實施。測序結果與以上方法的檢測結果一致。

1.3 統計學方法 計數資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 IL10592 A/C位點的基因型與乙肝后肝硬化中醫證型的關系 乙肝后肝硬化患者的中醫證型與基因型的統計分析表明，各中醫證型的AA、AC+CC與中醫證候基因型總例數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 IL10819 C/T位點的基因型與乙肝后肝硬化中醫證型的關系 乙肝后肝硬化患者的中醫證型與IL10819 C/T位點基因型的統計分析表明，6個中醫證型間的差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。將CT和CC基因型合并后，分析各中醫證型的TT、CT+CC與中醫證候基因型總數之間的差異，在乙肝后肝硬化患者中，CT+CC基因型在脾虛濕盛證中出現的頻率［94.73%（36/38）］明顯高于非脾虛濕盛證［5.26%（2/38）］，差異有統計學意義（P＜0.05）；CT+CC基因型在脾虛濕盛證中出現的優勢比和95%可信區間為10.055 ［2.360，42.849］，而在非脾虛濕盛證中出現的優勢比和95%可信區間為0.771 ［0.518，1.147］。另外，TT基因型在肝氣郁結證中出現的頻率［52.387%（22/42）］明顯高于非肝氣郁結證［32.07%（59/184）］，差異有統計學意義（P＜0.05）；TT基因型在肝氣郁結證出現的優勢比和95%可信區間為1.969 ［1.014，3.824］，而在非肝氣郁結證出現的優勢比和95%可信區間為0.845 ［0.560，1.276］。

2.3 IL101082 A/G位點的基因型與乙肝后肝硬化中醫證型的關系 乙肝后肝硬化患者中醫證型與基因型的統計分析表明，各中醫證型的AA、AG+GG與中醫證候基因型總數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表2 乙肝后肝硬化中醫證型與IL10592 A/C位點的基因型（略）

Table 2 Genotypes of IL10592 A/C and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

表3 乙肝后肝硬化中醫證型與IL10819 C/T位點的基因型（略）

Table 3 Genotypes of IL10819 C/T and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

表4 乙肝后肝硬化中醫證型與IL101082A/G位點的基因型（略）

Table 4 Genotypes of IL101082A/G and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

3 討論

證候的研究是中醫科研的重點、難點和熱點，中醫的整體觀念和辨證論治往往通過這一環節來體現。中醫證候是一種對患者癥狀和體征的歸納，反映了疾病過程中機體某一階段的病因、病位以及病機等整體病理狀態。中醫學認為“有諸內必形諸外”，疾病證候既然是有規律的病理表現，就必然有其規律性的物質基礎。中醫體質學說認為體質與疾病的發生有著密切的關系，表現為病理性體質是其相關疾病發生的主要物質基礎［4］。研究證明，人類基因多態性在闡明人體對疾病和毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現的多樣性以及對藥物治療的反應性上都起著重要的作用。由此可見，中醫的體質學說與基因多態性可能存在內在聯系。

人體的DNA序列及其變異，反映了人類的進化過程。研究不同人群和不同個體的DNA序列變異，即多態性，有助于了解人類疾病的發生、發展以及對藥物治療的反應。現已知，至少93％的人類基因都存在SNP［5］，而且SNP已成為遺傳易感性研究的主要生物學標記之一，并與感染性疾病的進展有關［6， 7］。研究表明，中醫的證型與SNP存在著密切的關聯。例如，尤勁松等［8］發現5HTTLPR多態性SS型個體可能是肝火上炎證和肝陽上亢證的易感人群，吳依芬等［9］發現ABCA1基因K等位基因可能是冠心病痰濁證、血瘀證的保護因素。而且，基因的多態性在很大程度上還影響疾病的不同證型以及藥物的療效［10］。但迄今為止尚未見有基因多態性與乙肝后肝硬化證候研究的相關報道。

IL10主要由巨噬細胞分泌，它能下調Th1型細胞因子的表達，是一種強有力的免疫抑制因子和協調刺激分子［11］，從而影響機體對乙型肝炎病毒的清除。Miyazoe等［12］的研究提示IL10啟動子的多態性與乙肝的進展有關。

本研究探討了IL10592、819和1082共3個SNP位點與226例乙肝后肝硬化中醫證候的關系。在IL10819位點，脾虛濕盛證C等位基因出現的頻率明顯高于非脾虛濕盛證（P＜0.001），其優勢比約為10，推測IL10819位點含有C等位基因的肝硬化患者更容易形成脾虛濕盛證。TT基因型在肝氣郁結證中出現的頻率明顯高于非肝氣郁結證（P＜0.05），其優勢比約為2，推測IL10819位點是TT基因型肝硬化患者更容易形成肝氣郁結證的物質基礎。其余兩個SNP位點（IL10592、1082）基因型與肝硬化的肝氣郁結證、脾虛濕盛證、濕熱內蘊證、血瘀證、肝腎陰虛證和脾腎陽虛證比較，差異均無統計學意義，它們的多態性可能不影響肝硬化患者中醫證候的形成。

從虛、實分類的角度，將肝氣郁結證、濕熱內蘊證和血瘀證歸為實證，肝腎陰虛證和脾腎陽虛證歸為虛證，脾虛濕盛證歸為虛實夾雜證，探討了乙肝后肝硬化實證、虛證和虛實夾雜證與IL10592、819和1082共3個SNP位點基因多態性的關聯，統計結果未發現有顯著的相關性（結果未顯示）。

本研究發現IL10819 C/T位點的多態性可能是乙肝后肝硬化患者產生某一特定證候的物質基礎，且能為肝硬化證候藥物基因組學研究提供參考。然而，影響肝硬化證候形成的SNP可能會有許多，仍有大量篩選SNP的工作要做。而且，基因多態性對個體而言是恒定的，證候在肝硬化的發展過程中會出現動態變化，具有不確定性。因此，我們需要進一步探討肝硬化相關基因型與證候變化的關聯，以期闡明證候的變化規律。

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