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>> 成癮相關記憶的表觀遺傳學機制 愈肝顆粒對大鼠肝癌的抵制作用及其表觀遺傳學機制 自身免疫疾病的表觀遺傳學 表觀遺傳學的研究進展 表觀遺傳學與人類健康 表觀遺傳學研究進展 表觀遺傳學與食管癌相關性研究進展 表觀遺傳學調控的研究現狀及其存在的問題 表觀遺傳學在抗腫瘤領域的研究現狀及前景 研究生《表觀遺傳學》課程的教學改革與探索 表觀遺傳學在中醫藥研究中的應用 表觀遺傳學標記在急性白血病微小殘留病檢測中的臨床意義 急性髓細胞白血病表觀遺傳學的靶向性和個體化治療策略 淺析表觀遺傳學在高中生物課程中的教育價值及其實現 神奇的遺傳學 遺傳學的未來 表觀遺傳學有助解釋妊娠高血壓 關于遺傳學教學的思考 遺傳學中的數學思想 遺傳學的概率計算 常見問題解答 當前所在位置：l）。有很多基于亞硫酸氫鹽（bisulfite）處理DNA的檢測啟動子甲基化的方法，其原理是亞硫酸氫鹽修飾將去甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，但留下甲基化的胞嘧啶不變。在隨后通過聚合酶鏈反應（PCR）擴增CpG區域時，尿嘧啶被轉化到胸腺嘧啶，而從甲基化的胞嘧啶則在此過程之中保持不變。甲基化和去甲基化的胞嘧啶之間的區別可能是胞嘧啶和胸腺嘧啶之間的區別，最初甲基化的程度可以由Pyrosequencing TM技術計算。最近亞硫酸氫鹽測序、（定量）甲基化特異性PCR（MSP， methylation-specific PCR）、甲基化敏感單克隆核苷酸引物延伸（Ms-SNuPE，methylation-sensitive single nucleotide primer extension）等技術也普遍用于基因的甲基化測定。另有一些技術可以用于研究全基因組染色質結構的改變。例如利用特異性識別甲基化胞嘧啶的抗體進行免疫沉淀實驗，后進行質譜測定；另一方面也利用DNA結合蛋白抗體或組蛋白的特異性修飾抗體，進行染色質免疫沉淀（ChIP，chromatin immunoprecipitation）測定，后進行DNA測序。更新的技術可以結合芯片，進行高通量的實驗設定。

迄今為止，有關于神經性疼痛模型的表觀遺傳學研究數量并不是很多。從以往的研究報道來看，DNA甲基化、組蛋白乙酰化和非編碼RNA的調控模式在神經性疼痛的發生、發展及其維持的各個環節都有發生非常明顯的改變并發揮著極其重要的作用。在未來的研究中，我們將進一步的探索表觀遺傳學參與神經性疼痛的調控的分子機制，研究相關的修飾程序是如何帶來了持久而長期的痛覺異常和痛覺過敏的，并為以后進一步的深入研究神經慢性病理性疼痛是如何發生、發展與維持打下基礎，并為其后續的控制、治療提供新的作用靶點。

*通訊作者：陳恒玲

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基因組印記

基因組印記是一種不遵循傳統孟德爾遺傳規律的表觀遺傳現象。這是由于來源于某一親本的等位基因或其所在的染色體發生了表觀遺傳修飾，導致不同親本來源的兩個等位基因在子代細胞中表達不同。受印記機制調控而差異表達的基因稱之為印記基因（imprintedgene）。目前在植物、昆蟲和哺乳動物中均發現了基因組印記現象，而在鳥類、魚類、爬行類和兩棲類動物普遍認為不存在印記現象。1991年Bartolomei等采用基因敲除技術在小鼠中首次確認了類胰島素生長因子2型受體和非編碼RNAH19基因兩個母源印記基因及一個類胰島素生長因子2型父源印記基因。2007年，杜克大學的研究人員用機器學習的人工智能形式發現了156個新的印記基因，并以此為基礎創造了第一張人類基因組印記基因圖譜。

X染色體失活

X染色體失活是指雌性哺乳類細胞中兩條X染色體的其中之一失去活性的現象，X染色體會被包裝成異染色質，進而因功能受抑制而沉默化，這種現象也稱為X染色體的劑量補償（dosagecompensation）。X染色體失活的起始和選擇發生在胚胎發育的早期，這個過程被X染色體失活中心（X-inactivationcenter，XIC）所控制，是一種反義轉錄的調控模式。這個失活中心存在著X染色體失活的特異性轉錄基因，當失活命令下達時，這個基因產生1個17kb不翻譯的RNA與X染色體結合，介導DNA甲基化和組蛋白修飾，引發并維持X染色體的失活。X染色體失活中心還有“記數”功能，即保持每個二倍體中僅有1條X染色體有活性，其余全部失活。X染色體的失活狀態需要表觀遺傳修飾來維持，可以通過有絲或減數分裂遺傳給后代。

非編碼RNA

非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白質的功能性RNA分子，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA等多種已知功能的RNA以及未知功能的RNA。按照它們的大小可分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA，前者在基因簇以至于整個染色體水平發揮順式調節作用，后者在基因組水平調控基因表達并介導mRNA的降解，誘導染色質結構改變，決定細胞的分化命運，還對外源的核酸序列有降解作用以保護本身的基因組。microRNA是一類內源產生的長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA分子，廣泛存在于真核生物甚至病毒中，通過調節編碼蛋白的基因的表達或翻譯來發揮調控作用。microRNA的功能十分廣泛并且滲入到了生理病理學的各種調控途徑中，包括發育周期、細胞增殖和分化、細胞凋亡、新陳代謝、神經調控、腫瘤發生以及病毒和宿主的相互作用等。在法醫學應用中，由于降解后的片段長度過小，不能進行有效的PCR擴增，然而microRNA就能滿足降解檢材的PCR擴增，開始成為關注的熱點。

表觀遺傳學在法醫學中的應用

1表觀遺傳學與親權鑒定

自1985年英國遺傳學家AlecJeffreys教授首次報道DNA指紋圖技術應用于法醫DNA分析以來，DNA分析技術已經在多起重大的刑事犯罪偵破和民事訴訟中發揮重要的作用。目前主要是以熒光標記STR與SNP等傳統遺傳標記進行個體識別和親權鑒定。但在法醫學親子鑒定中，尤其是子代為雜合子或者父（母）和子代為相同的雜合子的單親鑒定中，親代的必需等位基因可能無法確定，使基因座的鑒別能力下降。但通過使用親緣特異性甲基化遺傳標記可以直接判定等位基因的親源，從而確定親代的必需等位基因。Zhao等應用甲基化特異性PCR對被甲基化標記的母系SNP位點rs220028進行檢測證明了這一觀點。另外，Poon等報道，采用DNA甲基化標記可有效識別孕婦外周血中的胎兒DNA，這也為產前的親權鑒定提供了一種非侵入性的檢測方法。

2表觀遺傳學與年齡推斷鑒定

個體年齡推斷一直是法醫學研究的重要內容。目前實際工作中，個體年齡推斷主要依據人類學方法，通過測量與年齡相關的骨骼、牙齒標志等，根據相關模型進行推算。近年來，許多研究者發現表觀遺傳學為個體年齡推斷的研究提供了一種新的思路。DNA甲基化隨年齡變化的特點為利用甲基化標記進行年齡推斷提供了可能。陳培利等利用人胚肺二倍體成纖維細胞（humanembryoniclungdiploidfibroblast，2BS）進行體外培養，發現其p16基因啟動子區及外顯子Ⅰ處的DNA甲基化水平隨個體細胞代齡的增加而降低。Tra等用限制性標記基因組掃描（restrictionlandmarkgenomescanning，RLGS）技術對T淋巴細胞2000個基因座的甲基化年齡變化情況進行了調查，發現29個基因座有變化，其中23個增加，6個降低。由于甲基化標記數目眾多，從中可以篩選出一組適合于法醫學應用的、年齡變化有規律的座位，應用于微量檢材的年齡推斷。尹慧等用高效液相色譜（HPLC）法對94個健康個體DNA甲基化水平的檢測發現，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）含量隨年齡增加而降低，50歲以上與50歲以下年齡組5mC含量差異具有統計學意義。2010年，Teschendorff等通過對261個絕經后婦女全血樣本約14000個基因啟動子區超過27000個CpG的甲基化狀態進行分析，證實干細胞多梳蛋白家族（polycombgroup，PcG）靶基因比非靶基因更容易隨年齡發生甲基化，并且變化不依賴于組織類型、疾病狀態和甲基化水平。

Bocklandt等通過分析唾液中的DNA甲基化標記，可以預測一個樣本組成員的年齡，結果與實際年齡相差大約在5歲范圍內。這項技術如果被確證，可能會成為法醫取證方面很有用的一種工具。同時，它還表明了一種可能性：DNA甲基化修飾或許可以提供一種比計算生日更具醫學相關性的年齡測定方法。

2010年，NorenHooten等在外周血單核細胞中的800個microRNA標記中篩選出9個與年齡相關的基因，但發現其中5個與疾病有關，該研究表明microRNA可以作為推斷年齡以及和年齡相關疾病的診斷指標。

2011年，國內Jin等首次報道了通過體細胞發揮功能的組蛋白修飾基因對衰老這一重要生物學過程的調控作用。這項研究通過生物化學、分子生物學、遺傳學和系統生物學相結合的方法，發現組蛋白H3K27me2/3去甲基酶UTX-1/UTX對衰老發揮了重要的調控作用。在秀麗線蟲中，該基因的雜合突變體及野生型的RNAi敲降后都能極大地延長線蟲壽命，使其抗逆性也大大加強。遺傳學分析發現其功能依賴于胰島素樣信號通路。這種通過重新建立組蛋白修飾模式的方式，揭示了細胞的重編程在抑制衰老過程中的重要作用，并提示其作用機制在哺乳動物細胞中同樣存在。

3表觀遺傳學與雙生子的鑒別

同卵雙生子（monozygotictwins，MZ）是由一個受精卵經過卵裂產生兩個單獨的細胞，并發育為完全獨立的個體，因此同卵雙生兩個個體的遺傳背景完全相同，享有共同的DNA序列。在法醫DNA分析領域，現有的DNA分析手段尚不能有效鑒別同卵雙生個體。

但是近年來，眾多研究都已證實，同卵雙生子的表觀遺傳學水平存在一定的差異。Fraga等對西班牙的40對同卵雙生子個體進行研究，發現他們在DNA甲基化、X染色體失活、組蛋白位點特異性乙酰化上存在差異，并且這種差異會隨年齡增長而增加。Kaminsky等對114對同卵雙生子個體的DNA甲基化的研究顯示，血白細胞、口腔黏膜上皮細胞和腸道組織中的甲基化狀態均存在差異。

此外，Ollikainen等對新生兒不同組織相關的4個差異甲基化區域的甲基化狀態進行了研究，發現甲基化水平存在顯著差異。從上述研究成果中可以看出，研究人員已經把目光投入到了法醫DNA分析的全新領域，尤其是DNA甲基化在同卵雙生子中的研究。這些都為采用DNA甲基化這一表觀遺傳學標記進行同卵雙生子個體甄別的可能性提供了強有力的理論支撐。

4表觀遺傳學與組織來源鑒定

在常見的法醫學案件中，有時需要對生物檢材的組織來源進行鑒定。傳統的形態和生化方法信息含量少，容易受各種條件的影響，因此常常受到限制。隨著分子生物技術的發展，以表觀遺傳學為基礎的組織鑒定方法存在明顯優勢，越來越為人們所關注。

例如，富含CpG的Alu重復序列，在體細胞中是甲基化的，在生殖細胞中卻是低甲基化的，有一個在進化上比較年輕的Alu亞族在中幾乎是完全沒有甲基化的。通過對這一Alu亞族甲基化的分析，就可以判斷檢材是否含有。范光耀應用聯合亞硫酸氫鹽的限制酶法，調查、常見體液、分泌液和組織的DEAD盒多肽4［DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）boxpolypeptide4，DDX4）］基因啟動子甲基化水平，發現中的甲基化水平顯著高于非組織。因此，選擇一個合適的界值，可以根據DDX4甲基化水平有效地鑒別（斑）的種屬來源。

Hanson等運用RT-PCR技術，根據microRNA的細胞組織特異性對血液、、唾液、陰道分泌液和經血進行來源鑒別，并通過與21種人體組織比對驗證了各種斑痕microRNA表達的特異性，用于檢測RNA的模板量最低可達50pg。Zubakov等運用微陣列和Taqman定量PCR技術確證了一些能運用于法醫學實踐識別血痕和精斑的穩定的microRNA標記。該項研究不僅將靈敏度提高到相當于單細胞水平的0.1pgRNA模板量，而且在新鮮與陳舊樣本的比對中發現其microRNA分子絕對含量未發生明顯變化。

5其他

近年來，隨著學者們對RNA在法庭科學領域的研究逐漸廣泛和深入，發現microRNA在法醫學領域的應用價值也日益重要。2007年王芬等發現有6個microRNA分子在H2O2誘導PC12細胞凋亡后表達顯著下調，這一結果為法醫病理學者研究腦缺血再灌注損傷中神經細胞凋亡的機制提供了理論依據。2010年李文燦等在研究大鼠心肌組織microRNA降解與死亡時間的相關性時發現，其含量在機體死后120h內保持相對穩定的水平，可作為內參指標反映其他生物指標的變化水平。

隨著分子生物學技術的飛速發展，法醫工作者又面臨一項新的挑戰，即如何在日常的親緣鑒定和個體識別工作中有效甄別偽造DNA。用于偽造DNA常使用PCR擴增的方法，因此使用親緣特異性甲基化遺傳標記，可以在進行親子鑒定和個體識別的同時，檢測樣本的甲基化狀態，從而鑒別樣本是否為人工偽造DNA。因此DNA甲基化遺傳標記在鑒定DNA是否人工偽造中發揮著重要的作用。

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關鍵詞 硒 表觀遺傳修飾 表觀標志物抑制劑 抗癌藥 開發

中圖分類號：R979.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）03-0075-04

Selenium compounds ― looking forward to be developed as epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs*

ZHU Huiqiu1**， HUA Yan1， WANG Mingli2***

（1. Anhui Huaxin Pharmaceutical Co. Ltd.， Hefei 230000， China； 2. Anhui Medical University， HeFei 230032， China）

ABSTRACT Selenium compounds can produce an intervention effect on the abnormality of epigenetic modification and then repress the occurrence and metastasis of tumor. They can be used as the inhibitors of some tumor specific epigenetic markers and expected to be developed as a new type of epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs.

KEy WORDS selenium； epigenetic modification； inhibitors of epigenetic markers； anti-cancer drugs； development

硒最重要的生物學功能是抗癌，并以多種機制發揮其抗癌作用。近年來的研究發現，硒又可對表觀遺傳學調控機制異化產生干預影響，特別是對在腫瘤發生機制中的特異性靶點進行干預，進而阻抑腫瘤的發生及轉移。硒化物是某些腫瘤特異性表觀標志物有效的抑制劑。硒的這個功能不僅對臨床腫瘤診斷、治療、預防具有現實意義，更為“含硒表觀靶向抗癌藥物”開發提供了科學依據。“含硒表觀靶向抗癌藥物”是期待開發的新型抗癌藥。現就近些年在這些方面的相關研究作一簡要介紹。

1 表觀遺傳學

什么是表觀遺傳學？從孟德爾遺傳規律講，親代（一代）把遺傳信息傳遞給子代（二代），主要由攜帶遺傳信息的脫氧核糖核酸（DNA）分子中堿基的排列順序（即堿基序列）來決定，并在細胞核內遺傳。但人們在研究中發現，在DNA堿基序列以外還有一套調控機制，包括 DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑以及非編碼RNA等，它們在不涉及改變DNA堿基序列的情況下，影響轉錄活性并調控基因的表達，改變機體的性狀，并且是一種可以預和逆轉的遺傳機制。這種非孟德爾遺傳現象，稱作表觀遺傳學[1-2]。

2 硒對表觀遺傳修飾異常產生干預及逆D作用

腫瘤發生發展的主要生物學原因是原癌基因活化和抑癌基因失活[3]。研究顯示，DNA甲基化水平同這些基因的表達密切相關。通常情況下，甲基化水平同基因表達呈負相關，甲基化程度越高，基因表達活性越低，甲基化程度越低，基因表達越活躍[4]。

DNA甲基化主要表現為基因組整體甲基化水平降低和局部CpG島[在哺乳動物中富含胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）二核苷酸的一段DNA稱為CpG島]甲基化程度的異常升高，人類基因組的甲基化主要發生在CpG島[5]。

研究表明，實體瘤普遍存在基因組廣泛低甲基化現象，低甲基化使原癌基因活化，癌細胞異常增殖；低甲基化還使腫瘤轉移增加，例如胃癌的甲基化水平越低，癌細胞浸潤、轉移的傾向越明顯[6]。

CpG島的甲基化程度異常升高，會導致某些抑癌基因表達沉默，進而參與腫瘤的發生發展。在正常情況下，CpG島為非甲基化。當腫瘤抑癌基因的啟動子區域（CpG島）過度甲基化，就會使抑癌基因的表達沉默。其間DNA甲基轉移酶（DNMT）家族中的DNMT1發揮著重要的調控作用，它的高表達導致抑癌基因在CpG島失活。所以，CpG島高甲基化成了多種腫瘤特異性表觀標志物，已成為臨床多種腫瘤早期診斷的依據和指標[7]。

近年來，作為表觀遺傳學調控機制之一的組蛋白修飾在腫瘤研究領域受到越來越多的關注。組蛋白乙酰化由組蛋白乙酰轉移酶（HAT）和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同調控，而編碼HAT或HDAC的基因如果發生染色體易位、擴增等突變會導致某些腫瘤的發生。

可見，DNA甲基化和組蛋白乙酰化等表觀遺傳修飾異常是腫瘤發生的另外一個機制。而近年研究發現，硒通過靶向干預可逆轉甲基化和乙酰化異常的過程，從而抑制腫瘤的發生及轉移。硒化物成了潛在的治癌新藥物，是亟待開發、臨床應用前景可觀的“含硒表觀靶向抗癌藥物”。

2.1 硒對DNA甲基化產生干預作用

研究表明，膳食硒通過干預表觀遺傳過程顯示出其抗癌潛力，膳食缺硒時組織呈現整體低甲基化[8]。Davis等[9]早些時候研究發現，給大鼠喂食缺硒膳食，其肝臟和結腸都出現顯著DNA低甲基化，而經硒處理的人結腸癌細胞株Caco-2 DNA甲基化水平顯著高于未經硒處理的對照組，據此研究者認為，膳食缺硒會增加肝臟和結腸腫瘤的發生。Remely等[8]研究表明，膳食硒營養缺乏會引起動物組織和人體結腸癌DNA低甲基化。我國學者徐世文等[4]通過實驗也發現，飼料硒缺乏可導致雞肌肉組織 DNA甲基化水平降低。硒對DNMT有抑制作用，缺硒會導致DNMT活性增加，使原癌基因活化，引起結腸癌等多種腫瘤發生。保持硒等營養素均衡攝入，有利于維持DNA甲基化正常水平及抑制DNMT活性[6]。

CpG島DNMT1的高表達是使抑癌基因失活的重要機制。抑制DNMT1靶酶活性，使失活的抑癌基因復活，是腫瘤治療中探索的新途徑。硒在多種腫瘤中有去甲基化的生物學功能，能誘導失活的抑癌基因重新活化和表達[3]。研究發現，硒可以直接干預DNA甲基化，抑制腺癌細胞株DNMT的高表達[8]。膳食硒干預DNA甲基化的方式之一是通過去甲基化過程來調節DNMT1活性的；研究還證實，亞硒酸鈉和苯甲基氰酸硒（BSC）、1，4-苯雙（亞甲基）氰酸硒（p-XSC）兩種合成硒化物對人大腸癌細胞核提取物中DNMT的活性都有抑制作用[10]。

各方面的研究驗證，硒對DNA甲基化產生干預影響，是靶酶DNMT有效的抑制劑。

2.2 硒干預影響組蛋白的乙酰化

近年來，國內外學者研究發現，組蛋白去乙酰化酶與腫瘤的發生密切相關。HDACs家族中的HDAC1高表達可明顯增加腫瘤細胞的增殖能力。在食管鱗癌、前列腺癌等多種腫瘤中均發現HDAC的高表達，靶酶HDAC已成為首選的攻擊靶點。

目前，人們通過體內、體外的研究鑒定出了硒、丁酸鹽、曲古抑菌素A（TSA）等一些HDAC的抑制劑，這些抑制劑可在體外誘導多種腫瘤細胞的生長停滯、分化或凋亡[2]。Somech等[11]通過臨床試驗表明，HDAC抑制劑對人體白血病及實體瘤進行治療，表現出明顯的抗腫瘤增殖效果，研究者認為，各類HDAC抑制劑是另一類新型抗癌藥物、“癌癥治療的新工具”。

Xiang等[12]的研究證明，硒可以通過下調DNMT和抑制HDAC活性，活化人前列腺癌LNCaP細胞系中因高甲基化沉默的基因GSTP1， APC和CSR1。這些基因是具有保護免受氧化損傷的抗癌活性物質、化學致癌物解毒劑或腫瘤抑制劑。

甲基硒酸（MSA）是近年來新研制成的一種人工低分子量有機硒化合物，是很具潛力的抗癌制劑。Kassam等[13]通過對彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞系（DLBCL）w外研究首次發現，MSA可以抑制該細胞系HDAC的活性。研究者認為，有關MSA抑制HDAC活性的作用以前從未報道過，從而為人們提供了硒元素一種新的機制，MSA是日后臨床試驗中可以使用的硒化物。

我國科研人員胡琛霏[2]通過蛋白質免疫印跡的方法，檢測到MSA可抑制食管鱗癌細胞系HDAC的活性，降低HDACl和HDAC2的蛋白表達，引起細胞內組蛋白乙酰化水平顯著升高；同時，還檢測到硒甲硫氨酸（SLM）對食管鱗癌細胞系KYSEl50細胞和MCF7細胞的作用，在SLM處理細胞24 h后，細胞中組蛋白去乙酰化酶的活性也顯著降低。

這些年，越來越多的含硒組蛋白去乙酰化酶抑制劑被發現和驗證。亞硒酸鈉、酮C甲基硒丁酸鹽（KMSB）、甲基硒代半胱氨酸（MSC）、甲基硒丙酮酸（MSP）等硒化物都可以抑制HDAC活性，提高組蛋白乙酰化水平，作為潛在的HDAC抑制劑，發揮其抗腫瘤的作用[14]。Fernandes 等[15]介紹，KMSB 和 MSP在體外作為HDAC的競爭性抑制劑發揮抗癌作用；還報道，合成的SAHA含硒類似物（5-苯甲酰戊氰硒）二硒醚和5-苯甲酰戊氰硒對不同肺癌細胞株HDAC抑制效果比SAHA更好。SAHA是氧肟酸類HDAC抑制劑，是目前在臨床上以皮膚T淋巴細胞瘤（CTCL）為適應癥而廣泛應用的表觀靶向抗癌藥物。這也提示，含硒類抑制劑對靶酶HDAC抑制效果優于無硒類抑制劑。

為何上述各種硒化物都可靶向抑制DNMT和HDAC活性，研究發現不管其結構如何改變，硒都是這些化合物生物活性的中心元素，發揮著關鍵作用，硒的這一生物學功能對含硒抗癌藥物的開發具有重要的指導意義[16]。

2.3 硒對非編碼RNA調控機制產生干預效應

表觀遺傳學的一個重要調控機制是非編碼RNA。非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白質的RNA分子。近年來，非編碼RNA一族中的微小RNA-200（miR-200）受到人們的高度關注。研究發現，miR-200家族中的成員微小RNA-200a（miR-200a）與腫瘤的發生發展關系密切，miR-200a在腫瘤組織中呈現明顯低表達。因此，miR-200a的表達下調是腫瘤發生的重要因素之一，miR-200a也成了腫瘤特異性表觀標志物[17]。

胡琛霏[2]通過TaqMan芯片，檢測了MSA處理食管鱗癌細胞后細胞中微小RNA（miRNA）的變化情況，發現MSA可以上調細胞中miR-200a 的表達水平，miR-200a 表達升高后，負性調控Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）的表達，使Keap1蛋白水平下降，上調轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）蛋白水平并提高其轉錄活性（Nrf2活性受其細胞質接頭蛋白Keap1的調控），從而活化Keap1-Nrf2信號通路。而Keap1-Nrf2信號通路在抗氧化、預防腫瘤發生等諸多方面有重要作用[18]。

體外研究顯示[19] ，人腦膜瘤組織中miR-200a表達明顯低于正常組織，β-循環蛋白（β-catenin）和其下游靶基因細胞周期蛋白D1表達顯著增高，二者和miR-200a呈現負相關，上調miR-200a可降低β-catenin的表達，進而阻斷Wnt/β-catenin信號傳導通路來抑制腦膜瘤的生長。胡琛霏課題組前期研究也發現MSA可以抑制食管鱗癌細胞系中β-catenin的表達[2] 。研究已證實，Wnt/β-catenin信號通路的激活和高表達可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及抑制腫瘤細胞的凋亡[20]。

由此可見，MSA可能介導、調控著miR-200a表達及參與復雜的分子調控網絡，從而抑制腫瘤發生及轉移。

3 展望

加強硒與表觀遺傳學之間關聯的研究，有著重要的生物醫學意義。它有可能解釋硒化學抗腫瘤的新機制，從理論上證明硒元素可能具有表觀遺傳學的效應[21] 。綜上所述，硒在腫瘤形成中對表觀遺傳修飾異常產生干預影響，靶向抑制腫瘤特異性表觀標志物，逆轉表觀遺傳修飾發生異化過程，使我們認識了硒化學抗癌的新機制、新作用，硒化物是潛在開發的新型靶向抗癌藥物。Fernandes 等[15]指出，硒化物都是癌癥治療藥。目前，非表觀類含硒靶向抗癌藥如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉等早已進入臨床研究[16]，展示出很有希望的臨床應用前景。而含硒表觀靶向抗癌藥物是亟待開發的抗癌藥“富礦”，加快開發含硒表觀靶向抗癌藥物，可為臨床腫瘤治療增加一種“新的工具”，為癌癥患者戰勝病魔增添一份新的希望。人們熱切期盼“含硒表觀分子靶向抗癌藥物”早日問世。

致謝：本課題研究得到華中科技大學徐輝碧、黃開勛兩位教授和安徽醫科大學張文昌碩士的支持，在此表示衷心感謝。

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篇4

[關鍵詞]　表觀遺傳學；抑癌基因；DNA甲基化；胃癌

[中圖分類號]　R735.2 [文獻標識碼]　A [文章編號]　1673-9701（2012）36-0012-02

腫瘤的發生發展是一個多因素參與的復雜過程。眾所周知，腫瘤發生發展的主要原因為原癌基因的激活和抑癌基因的失活，目前越來越多的證據表明，其發生機制除遺傳學改變外，表觀遺傳學改變也占有非常重要的地位。目前在表觀遺傳學機制中研究最多的是DNA甲基化。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病機制與DNA甲基化狀態的改變密切相關。

1　表觀遺傳學與胃癌

表觀遺傳學（Epigenetics）是指基于非基因序列改變所致的基因表達水平變化，主要包括DNA甲基化、染色質構象改變和組蛋白修飾等[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到胞嘧啶5位碳原子上[2]。

腫瘤中的表觀遺傳學改變是由Feinberg和Vogelstein兩位科學家于1983年首次描述的，他們發現在腫瘤中同時存在兩個互相矛盾的表觀遺傳現象，即全基因組低甲基化和局部高甲基化[3]。研究表明，全基因組的低甲基化可以導致ras、c-myc等原癌基因激活，而DNA啟動子區CpG島的高甲基化可以導致p16、APC等抑癌基因失活，兩者協同作用，從而促使腫瘤的發生。

胃癌（gastric　cancer，GC）由于其患病率高、預后差、有限的治療選擇等，仍然是全球范圍內一個重要的臨床挑戰。雖然胃癌的發病率逐年下降，但它仍然是癌癥死亡的第二大原因和四個最常見的惡性腫瘤之一[4]。研究表明，相比其他類型的癌癥（如大腸癌），胃癌中基因突變的頻率相對較低，而以DNA甲基化為主的表觀遺傳改變卻發揮了關鍵作用。

2　抑癌基因甲基化與胃癌

目前，DNA甲基化研究最深入的方向是抑癌基因（tumor　suppressor　genes，TSGs）的異常甲基化。Bird等研究發現DNA啟動子區CpG島甲基化可導致腫瘤細胞抑癌基因失活。從此，表觀遺傳改變在腫瘤發生和發展中的作用受到了人們的高度重視，并成為了研究的熱點[4]。人類基因組中，約有50%基因的啟動子區5'端富含CpG，這種區域稱為CpG島（CpG　island），其長度不小于500　bp、GC含量不少于55%。CpG島在正常情況下一般處于非甲基化狀態，當其發生甲基化時，基因的空間結構也隨之改變，表達受到抑制。

越來越多的研究證實，胃癌的發生與抑癌基因啟動子區CpG島的異常高甲基化密切相關[5，6]。目前已知胃癌中，包括p16、APC、CDH1、RASSF1A、CHFR、DAPK、PTEN和RUNX3等數十個抑癌基因，均是由于高甲基化而失活的[7]。這些基因參與DNA修復、調節細胞周期、信號轉導等多個細胞生理過程，與胃癌的發生發展具有密切關系。以下是幾個近年來研究較熱門且具有代表性的抑癌基因。

2.1　PTEN基因

PTEN基因定位于人染色體10q23.3，由9個外顯子組成，編碼由403個氨基酸組成的蛋白質，具有磷酸酯酶的活性。PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發生發展。研究顯示，PTEN基因在多系統惡性腫瘤中均表達下降，均與DNA異常高甲基化有關。Liu　S等[8]對56例胃癌標本中PTEN基因mRNA表達及啟動子區CpG島甲基化狀態進行檢測，結果顯示胃癌組織PTEN基因表達較癌旁正常組織明顯下降（P　＜　0.01），甲基化率48.2%明顯高于癌旁正常組織3.6%（P　＜　0.01），說明PTEN基因甲基化可能是其低表達的原因。

2.2　RASSF1A基因

RASSF1A基因位于人染色體3p21.3區域位點，內含編碼340個氨基酸的開放閱讀框，編碼相對分子質量38　800　Da的蛋白多肽，通過參與抑制Ras/RASSF1/ERK通路的信號轉導調控細胞的凋亡、維持微血管穩定性[9]。其表達失活，可以使胃黏膜細胞凋亡受抑，并向惡性細胞轉化。研究證實，RASSF1A基因在肺癌、胃癌、乳腺癌等多種實體瘤中均存在甲基化導致的表達失活。林海等[10]檢測出RASSF1A基因在62例胃癌標本較56例正常組織中的mRNA表達明顯下降（P　＜　0.01），甲基化率分別為66.1%和23.2%，癌組織甲基化率是正常組織的2.80倍，差異有統計學意義（P　＜　0.01），表明RASSF1A基因高甲基化可能是導致其表達降低的原因。

2.3　RUNX3基因

RUNX3基因定位于人染色體1p36區域位點，屬于RUNX基因家族，在哺乳動物發育和腫瘤中發揮重要作用，并已被證實與胃上皮細胞穩態和胃癌的發生相關[11]。研究發現，有相當比例的胃癌組織中由于RUNX3基因啟動子區CpG島異常甲基化而不表達RUNX3。何小兵等[12]分別對9種胃癌細胞系和35例胃癌患者手術切除腫瘤組織及其癌旁組織RUNX3基因啟動子區域甲基化進行檢測，結果顯示在7種胃癌細胞系中RUNX3基因啟動子區域過度甲基化，RUNX3基因在35例胃癌及其癌旁組織中甲基化率分別為40.0%和8.6%。因此，RUNX3基因啟動子區CpG島甲基化可能是導致基因轉錄失活及其表達下調的主要原因。

3　CpG島甲基化表型與胃癌

腫瘤細胞中多個基因或DNA位點甲基化的狀態稱為CpG島甲基化表型（CpG　island　methylation　phenotype，CIMP）。如果有3個以上基因CpG島處于甲基化狀態稱為甲基化表型陽性（CIMP+），反之則稱為甲基化表型陰性（CIMP-）。多項研究表明，胃癌中存在甲基化表型陽性。例如Tahara　T等[13]檢測了146例胃癌標本中p14、p16、DAPK、E-cadherin　4個抑癌基因的甲基化狀態，結果顯示43.2%的病例表型為CIMP+。Kim等[14]檢測了40例早期胃癌中hMLH1、TIMP3、THBS1、DAP2K、GSTP1、APC和MINT2的甲基化狀態，結果顯示40%病例表型為CIMP+。這表明，甲基化表型陽性在胃癌的早期就已經發生，可以作為早期胃癌的診斷指標之一。

此外，有研究表明，CIMP+與胃癌的分期和侵襲轉移無關，而與胃癌Borrmamm分型和預后相關。Park等[15]對196例胃癌標本中16個腫瘤相關的CpG島或位點進行了分析，結果顯示CIMP+的胃癌患者預后較差。這表明甲基化表型陽性也可以作為胃癌預后判斷的一項指標。

4　抑癌基因甲基化臨床應用前景

檢測腫瘤抑癌基因的甲基化狀態可以用于癌癥的篩選、風險的預測和治療的選擇。研究發現，抑癌基因的異常高甲基化在胃癌癌前病變階段（如慢性胃炎和腸上皮化生）也經常檢測到，說明DNA甲基化的發生往往早于各類癌癥的腫瘤形成，這使得它尤其適用于癌癥風險預測[16]。此外，若干報道指出，癌特異的、甲基化的DNA可以在微量的生物體液中被檢出[17]，這表明它可能是一個靈敏的非侵入性診斷的標記物。

目前研究者認為，DNA甲基化在一定程度上是一個可逆的過程。DNA甲基化需要DNMT的催化，因此應用甲基轉移酶抑制劑抑制DNMT的活性后，可使DNA甲基化逆轉，稱為去甲基化。目前研究較深入的甲基轉移酶抑制劑為5-氮雜-2-脫氧胞苷，大量體外研究證實，應用5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后，抑癌基因表達缺失的胃癌細胞株均重新表達該基因[18]。故通過去甲基化恢復抑癌基因表達可恢復基因正常功能，有可能達到治療癌癥的目的。

綜上所述，抑癌基因甲基化是胃癌發生發展的重要機制之一，多基因甲基化狀態的檢測及去甲基化藥物的研究對胃癌的預防、診斷和治療均具有長遠意義。而如何根據不同患者的實際情況選擇進行檢測的抑癌基因從而提高早期胃癌檢出率，以及去甲基化藥物的選擇和臨床應用還有待進一步的研究。期待更加深入的科學實驗為臨床診療提供日趨完善的理論基礎，使得日漸成熟的甲基化檢測技術及去甲基化藥物早日廣泛應用于惡性腫瘤的診治。

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篇5

[關鍵詞] Beckwith-Wiedemann綜合征；表觀遺傳學；DNA甲基化；印記基因；Wilms腫瘤

[中圖分類號] R726.5 [文獻標識碼] C [文章編號] 1673-9701（2016）26-0155-03

表觀遺傳學是近年來醫學研究的新熱點，而Beckwith-Wiedemann 綜合征（BWS）是研究表觀遺傳學的代表性疾病之一。本病是一種罕見的先天性印記基因表達異常綜合征，印記基因最具特征的標志是DNA 獲得甲基化和去甲基化，其致病基因位于第11 號的染色體短臂15.5 區域，以臍膨出、巨大舌和身體的一側生長過剩為主要表現，臨床上還可見短暫性低血糖、面部鮮紅斑痣、內臟肥大、腫瘤等其他表現。本文通過介紹我院收治的1例Beckwith-Wiedemann 綜合征患兒情況，以提高臨床醫生對本病臨床表現、診斷、發病機制的認識，現報道如下。

1 病例資料

患兒，女，36+1周早產，于2014年9月25日9：35于我院產科出生，患兒系第1胎第1產，順產，其母胎膜早破5 h，產前無宮內窘迫，生后Apgar評分1 min、5 min均為10分，出生體重3600 g，羊水、臍帶未見異常，胎盤大，生后發現患兒舌大伴吐舌，為進一步治療轉入我科。

母孕史：其母孕期規律產檢，孕29周時宮內B超提示胎兒雙腎增大，孕34周時宮內B超提示胎兒巨舌癥？家族史：父母體健，非近親結婚，否認家族遺傳病病史及中毒、外傷史。

入院查體：體重：3550 g，身長：50 cm，頭圍：33 cm，神清，精神反應可，眼裂稍小，鼻梁低平，舌大，吐舌，哭聲響亮，婉轉有調，顏面可見紅斑，前囟平軟約1.5 cm×1.5 cm，左頂部可觸及2 cm×2 cm×3 cm血腫，心音有力，律齊，心前區未聞及雜音，兩肺呼吸音清，腹軟，腹正中劍突下至臍部可見一條狀隆起，哭鬧時明顯，臍根部粗大，肝肋下2 cm，質軟邊銳，脾肋下未及，雙側肢體對稱，無偏身肥大，四肢肌張力正常。

輔助檢查：血尿便常規無異常，血生化無異常，TORCH（-），血胰島素（空腹）3.35 μIU/L（3.3～19.5 μIU/L），超聲心動圖：房間隔缺損3 mm，繼發孔型。腹部B超：肝臟增大，雙腎增大，雙側腎盂分離。

小兒外科：臍疝，腹白線疝。皮膚科：面部鮮紅斑痣。口腔科：舌體良性肥大。

診治經過：入院第2天出現血糖偏低（2.5 mmol/L），經喂養糖水及奶、靜脈輸入葡萄糖，血糖恢復正常。住院期間每天均在空腹喂奶前有1～2次血糖偏低，經加強喂養后血糖正常。

出院后隨訪：出生后40 d，混合喂養，血糖監測正常。右側肢體較左側偏大（右上肢、下肢較左側長0.5 cm，右下肢較左側粗0.5 cm），活動好，肌張力正常，用力時腹中線部位膨隆。血AFP 257.6 ng/mL（

MS-MLPA結果：母源KvDMR去甲基化，母源H19甲基化或父源的單親二倍體。

2 討論

2.1 發病率及病因

篇6

【關鍵詞】胃癌；分型；進展

胃癌是消化系統的常見惡性腫瘤，為全世界范圍內發病率最高的癌癥之一，根據世界衛生組織癌癥研究中心2002年的統計，我國胃癌發病率僅次于日本，位于全球第2位。2007年中國腫瘤登記提示：我國胃癌的發病居第二位，僅次于肺癌，死亡據第三位，僅次于肺癌、肝癌。胃癌在演進過程中隨著附加的基因突變會產生不同的亞克隆，使其不斷異質化導致其侵襲和轉移能力不斷加強，而這是胃癌治療困難和致死的主要原因。國內外學者都在尋求能指導臨床方案選擇及判斷預后的胃癌分型，傳統的癌癥診斷對病理學依賴性較大，有時會因為腫瘤的不典型或臨床信息的不完整而造成診斷困難。應用基因分析技術所產生的信息，特別是應用高通量芯片技術所產生的信息可以為胃癌分型提供更多的參考，因此對目前胃癌相關的分型予以綜述。

1 胃癌的傳統分型

胃癌病理分型是以組織形態結構和細胞生物學特性為基礎，不同類型的胃癌，其形態結構和生物學行為各異，流行病學和分子機制亦不同，以致現有的胃癌分型系統眾多。目前，常用的是WHO型、Lauren分型，大體分型主要使用Borrmann分型。

1.1 WHO胃癌包括以下常見組織學類型

狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌、腺鱗癌、鱗癌、小細胞癌、未分化癌。此外，胃內還可以發生類癌。WHO分型將Lauren分型的腸型、彌漫型納入腺癌之下。其管狀腺癌還可進一步分成高分化、中分化與低分化腺癌。少見類型或特殊類型胃癌有：實體型變異、肉瘤樣變異等。

1.2 1923年德國病理學家Borrmann提出的一種胃癌大體形態分型方法，此分型主要根據癌瘤在黏膜面的形態特征和在胃壁內的浸潤方式進行分類，將胃癌分為4型：Ⅰ型（結節型），II型（潰瘍局限型），III型（浸潤潰瘍型），是最常見的類型，約占50%。Ⅳ型（彌漫浸潤型），由于癌細胞彌漫浸潤及纖維組織增生，胃壁呈廣泛增厚變硬，稱“革囊胃”。Borrmann分型是胃癌經典的分型方法，既能反映胃癌的生物學行為，又簡潔實用，國際上廣泛采用。

1.3 Lauren分型將胃癌分成兩大主要類型，即腸型與彌漫型，當腫瘤內兩種類型成分相當時就稱為混合型。胃癌發生是一個多步驟的過程，彌漫型和腸型在腫瘤發生各個階段會產生多種基因及表觀遺傳學方面的變異。常見的包括抑癌基因的點突變和雜合性丟失，常見的表觀遺傳學異常包括CPG島的甲基化引起的腫瘤抑制基因沉默和腫瘤促進基因轉錄水平的增高。

2 胃癌分型與分子病理學

胃癌分型研究的意義在于探索其是否對判斷預后有價值或者對于今后的治療有指導意義。當前，國內張樹華采用組織病理與組織化學和免疫組織化學技術相結合的方法，兼顧宿主的免疫防御反應，把胃癌分為兩型：限制生長型和促進生長型。限制生長型預后較促進生長型好。

根據黏蛋白標記的差異，胃癌組織被分為4型：1）胃型：胃型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；2）胃腸型：胃型黏蛋白標記的胃癌細胞> 10%且腸型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；3）腸型：腸型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；4）未分類：胃腸黏蛋白標記的細胃癌細胞

Solcia等對對294例平均隨訪時間長達150個月的胃癌進行研究顯示，如果將胃癌的組織學結構、細胞異型性程度、p53基因突變、18q雜合性缺失、微衛星不穩定性以及有無脈管神經浸潤等因素與預后綜合分析，可以將胃癌惡性程度分成三級。胃癌I級（預后良好型）包括：大量腫瘤內/旁淋巴樣細胞反應型、高分化管狀腺癌、黏液結節型和促纖維結締組織增生性彌漫型胃癌，I級胃癌約占全部胃癌病例的37%。胃癌III級（預后不良型）包括：高度異型性胃癌、浸潤型黏液腺癌、腫瘤細胞異型性中等但具有p53基因的第7或第8外顯子突變、伴有血管淋巴管浸潤以及神經浸潤者，III級胃癌占全部胃癌病例的19%。其他胃癌則歸屬于預后中等的胃癌Ⅱ級，占全部胃癌的44%。這一關于胃癌惡性程度評價體系雖然是不依賴于臨床分期的胃癌預后判斷新標準，但實際操作中涉及到微衛星不穩定性的分子遺傳學檢測、p53基因突變檢測以及EB病毒原位雜交檢測等實驗技術，在臨床普及以及操作流程標準化控制等方面均有待統一。

3 微衛星不穩定性與胃癌分型

微衛星不穩定性[MSI]是胃癌發生過程中的一個常見事件，反應了腫瘤潛在DNA錯配修復缺陷，常常由Hmlh1啟動子區甲基化引起，胃癌合并MSI者其臨床病理因素特別，預后相對良好，胃腸道腫瘤中MSI的測定是最先被廣泛利用的預后分子檢測之一。MSI的檢測常采用熒光定量多重PCR進行，費用相對低，適用性廣。以往的很多觀察表明，胃癌中MSI的存在不僅僅是與已知的與組織病理特征強關聯的分子分型標志，同時MSI能能區分預后良好好亞組。因此Simpson等建議將MSI作為一個有效的分子分型工具。葡萄牙的一項研究表明，胃癌患者并低度MSI五年生產率為30%相比，而高度MSI者則為70%。韓國的一項大型研究也表明在胃癌分期為II、III期的患者MSI與預后良好有關。

4 胃癌的分子分型

以分子特征為基礎的新型分類體系即分子分型。高通量的基因分析可以是DNA水平的基因多態性分析、DNA甲基化分析和基因拷貝數分析.也可以是RNA水平的基因表達譜分析、微小RNA表達譜分析和蛋白表達水平的蛋白芯片分析等。

腫瘤分子分型的基礎：目前可以在DNA、RNA和蛋白質水平上進行腫瘤分子分型的研究。在DNA水平，可以依據基因突變、基因組的細胞遺傳學改變或甲基化差異進行分型。根據基因表達譜（RNA水平）的差異實施分型，是目前分子分型的研究主體，以表達譜芯片為基礎的分子分型研究數據處理分二類：一是，unsupervised analysis；二是，supervised analysis。在蛋白質水平，可以根據蛋白質表達譜的差異，亞細胞結構蛋白組成的不同或蛋白質翻譯后修飾的改變來進行分型。

分子分型的研究方法主要有：基因表達譜芯片技術：它可以同時觀察成千上萬個基因在不同個體、不同組織、不同發育階段的表達狀況。它的原理是在已建立的cDNA或寡核苷酸組成的芯片或微陳列上，用不同顏色熒光標記的cDNA制備的探針與之雜交，掃描及計算機處理所得的信號就代表了樣品中基因的轉錄表達情況。基因芯片技術在腫瘤的分子分型、基因功能、信號通路及代謝與調控途徑研究等方面有顯著的優勢；比較基因組雜交（CGH）技術：是在染色體熒光原位雜交基礎上發展起來的一種新的分子細胞遺傳學研究技術。它主要是用不同的熒光體系來標記腫瘤組織DNA和正常對照DNA，與正常中期分裂象染色體進行競爭性抑制雜交，熒光信號攝取及軟件分析所得的比值可判斷染色體區段的擴增、缺失還是正常。它僅需少量腫瘤組織DNA即可在整個基因組水平研究不同基因組間DNA拷貝數差異，并將這些異常定位在染色體上。CGH與微芯片技術結合的芯片CGH，以cDNA作為雜交靶，可使得基因組水平遺傳物質異常的分辨率達到幾十個kb，并可對關鍵基因改變進行精細定位；蛋白芯片技術：基因突變和基因表達差異不一定導致相應的蛋白表達，而且蛋白質還存在磷酸化，乙酰化等復雜的翻譯后修飾過程，這些改變在轉錄水平上是無法檢測的。以高通量結合生物信息學為特點的蛋白質組學分析技術可以從細胞整體水平上檢測到這種變化，為腫瘤分子分型以及治療標志物的篩選帶來巨大的便利與可能。蛋白芯片技術主要包括雙向凝膠電泳技術、質譜技術以及生物信息學技術。

篇7

【關鍵詞】組合數學 教學方法 生物醫學 生物信息學

【中圖分類號】G64 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2015）09-0132-02

伴隨著信息時代的來臨，特別是生物醫學科學研究的迅猛發展，尤其是生物信息學這門科學的出現使得原來的生物醫學研究向低通量的臨床數據轉向高通量分子生物學數據。組合數學作為一門應用性較強的數學分支，在生物醫學中的應用廣泛，面對多因素高通量的生物醫學問題，增加高等學校，特別是生物信息學專業學生的組合數學知識，培養他們運用組合數學方法分析和解決生物醫藥科學問題的能力已經成為必要。如何在教學過程中提高學生學習組合數學的興趣，建立組合數學的邏輯思維用于解決醫學問題是我們教育工作者需要思考的問題。

一、高等學校組合數學的特點及教學現狀

組合數學是一門研究離散對象的科學，在計算機科學、信息科學中具有重要的地位，是理科及工科院校的一門必修課，隨著現代生物醫學的日益發展，組合數學的重要性也日漸凸顯。組合數學對于生物醫學專業基礎課有著直接的衍射作用。目前，部分開設組合數學課程的生物高等學校的主要面向生物信息學、統計學等等專業開設，講授學時30到60學時。在大部分生物高等學校并沒有該類課程的設置，也是導致高等學校組合數學教師隊伍的匱乏的主要原因。而且目前組合數學授課考核形式也比較單一。組合數學主要是以理論授課形式為主的教學方式，考試成績是考核學生的唯一標準，忽視了學生在學習過程中的考核。信息時代學科的交叉發展體現在組合數學在各個學科中不可替代的作用，因此提高生物高等學校學生的組合數學學習興趣，培養他們運用組合數學的能力是目前迫切需要解決的問題。

二、改進組合數學教學措施，提高學生興趣

（一）更新教學內容，改進教學方法

目前的組合數學內容主要有： 鴿巢原理、排列與組合、容斥原理、遞推關系、生成函數等基本的組合數學知識及其在數學中的應用。為了讓學生在有限的學時內學完必要的知識，更新和精選教學內容顯得尤為必要，將以組合數學內容為主導的教學模式改進成以生物醫學問題為導向的教學模式。由于面向醫學專業的特殊性，從內容上應著重選擇與醫學知識聯系緊密的內容，采取精講和略講相結合的方式。根據不同專業背景更新組合數學的教學內容往往能夠起到事半功倍的效果。以下是我們在講解排列與組合一章時的一個教學實例：“生物遺傳信息是由DNA分子中4個堿基核苷酸就像電報密碼似的以不同的排列順序記錄下來，它載著人類的全部基因或全部遺傳信息，人的DNA約有30億（3×109） 堿基對，按照排列的思想可知人類基因組可能的排列方式有N=4■=（4■）■≈（1.52）■種，然而人類僅從這無窮多的方式中選了一種作為全人類共同的遺傳密碼，可見我們的基因組是祖先們留給人類的最寶貴的財富！”。這樣的實例教學不僅可以讓學生熟悉課堂知識，還能讓學生對所學的知識進行綜合的運用，更重要的與生物醫學問題的結合提高了學生的學習興趣。通過興趣小組討論學習提高學生自主學習的主動性，變被動學習為主動學習，充分調動學生學習組合數學的興趣，從而充分發揮學生學習的主觀能動性。

（二）加強多媒體輔助教學，提高學生學習興趣

組合數學傳統的授課方式是在黑板上將定義、定理的內容進行逐步嚴密的推導證明，這在一定程度上讓學生緊跟授課教師的思維和建立學生的邏輯思考能力。然而隨著多媒體技術的不斷進步，利用多媒體和板書相結合的策略成為下一階段組合數學教學模式的主要教學手段。對于繁瑣的定理公式例如容斥原理避免推導證明，結合多媒體的幾何圖形使學生更加直觀的理解和應用。以我們在教授容斥原理時的一個實例，容斥原理的根本思想是將難的問題分解成若干簡單問題，通過間接計數來解決直接計數不容易解決的問題，我們用多媒體幻燈片分別展示兩集合和三集合的容斥原理（圖1A和B），并按照容斥原理的邏輯順序利用多媒體動畫技術控制每一部分的出現順序，不僅避免了大量繁重枯燥的板書推導，最重要的是圖形式教學可以幫助學生對容斥原理建立更直觀的理解。可見在組合數學的教學過程多媒體的充分利用可以起到事半功倍的效果。

圖1 多媒體在組合數學教學中的應用――容斥原理實例

（三）增設組合數學實驗課，培養學生創新性思維

組合數學除了基本理論課之外還應該開設適當的實驗課，在實驗課上讓學生自己動手解決一些與生物醫學有關的實際問題。通過讓學生自己編程實現排列組合的算法，不僅可以增進學生對排列與組合的深入認識，也能夠培養學生利用排列組合思想解決實際問題的能力。以下是我們的一個實驗教學實例：“任選一種排列生成算法，編程實現自動生成n個（如n=6）不同元素中取r個元素的排列，并輸出指定任意n和r的所有排列。”，不僅讓學生掌握了課堂上講解的排列原理，還鍛煉了編程能力，初步體驗了科研的樂趣，由消極的被動學習升級為積極的主動學習。可見通過組合數學實驗課更能培養學生自己動手自己學習的能力，進一步激發學生的創新性思維。

（四）精挑細選課后練習，培養學生獨立解決問題的能力

組合數學作為一門應用性較強的數學課，需要學生掌握其在生物醫學領域的應用，這就必須加強組合數學課堂后練習。因此習題是組合數學課程重要的教學環節，也是理論教學必不可少的補充。然而習題課并不意味著單純地大量做題，教師應根據課堂內容，精挑細選出質量比較高的少量題目，供學生課余時間認真研究，要在習題中體現組合數學的知識點，激發學生獨立給出解決問題的新觀點和新方法。設置習題時，應以問題為導向，即給定一個實際的有興趣的問題，讓學生利用所學的組合數學理論進行解決，進一步加強學生對知識細節的理解和掌握，并讓學生舉一反三熟練掌握所學內容，使學生的理解更加深刻。如我們在教學過程中的一個課后習題實例：“一位國際象棋大師有11周的時間備戰一場錦標賽，他決定每天至少下一盤棋，但是為了使自己不過分疲勞他還決定在每周不能下棋超過12盤。證明存在連續若干天，期間這位大師恰好下了21盤棋。”，該實例引起了學生在課余時間學習組合數學的一個熱潮。

總之，面對高等學校生物信息學學生的專業特點，傳統的單一的純理論的組合數學教學方法已經不再適用。應該考慮改進教學內容和方法，發揮學生學習的主觀能動性，使學生在快樂進取的氛圍里學習組合數學，具體的教學內容和教學方法的改進仍有待教學工作者進一步探討和研究。

參考文獻：

[1]盧開澄，盧華明.組合數學[M].北京：清華大學出版社，2002.

[2]蘇建忠，張巖，劉洪波，王芳，崔穎.組合數學在生物信息學教學中的應用[J]. 科技創新導報，2012，6，142-143.

作者簡介：

劉洪波（1983-），男，漢族，山東德州人，博士，講師，主要研究方向：生物信息學，計算表觀遺傳學。

王芳（1982-），女，漢族，吉林松原人，博士，副教授，主要研究方向：生物信息學，計算表觀遺傳學。

篇8

[關鍵詞] DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（b）-0016-06

Effect of 5-Aza-dC on mRNA expression， protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer

GE Chang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine （5-Aza-dC）， a methylation inhibitor， on the mRNA expression， protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC （0.5， 1.0， 1.5 μmol/L）. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. Results Methylight detection showed that the Wif-1 gene methylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC. Moreover， the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[（1.000±0.000）， （1.207±0.052）， （1.790±0.033）， （2.016±0.123）]， and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line [（1.000±0.000）， （1.294±0.048）， （1.893±0.061）， （2.204±0.041）]. Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover the Wif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line [（0.456±0.040）， （0.511±0.025）， （0.857±0.031）， （0.934±0.047）]， and the protein expression was （0.842±0.032）， （0.844±0.044）， （0.854±0.037）， （0.856±0.034）， respectively in LoVo Colorectal cell line. The Wif-1 gene mRNA effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=144.823， P=0.000） and LoVo Colorectal cancer line （F=476.195， P=0.000）， and the Wif-1 protein effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=129.674， P=0.000）， but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line （F=0.117， P=0.948）. Conclusion The methylation of promoter region is a main cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. 5-Aza-dC may effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.

[Key words] DNA methylation； 5-Aza-dC； HT-29； LoVo； Wif-1 gene

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為最常見惡性腫瘤之一，其發病率僅位于肺癌和前列腺癌（女性為乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率約占全部惡性腫瘤死亡總人數的8%，在惡性腫瘤死因中居第4位[1]。CRC的發生與發展與癌基因和抑癌基因的缺失、擴增或突變有關。有些基因在染色質水平上發生表型遺傳修飾改變也會導致表達下調。表型遺傳修飾最多見的是CpG島（CpG island）的甲基化改變。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人類染色體12q14.3上，由10個外顯子組成，全長約200 kb。Wnt/β-catenin信號傳導通路是調控細胞生長增殖的重要途徑之一，其異常激活已發現與多種人類腫瘤密切相關[2]。Wif-1基因是這條通路的下游區基因也是這條通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多種腫瘤中都已證實是存在的，它作為一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其啟動子的高甲基化參與了腫瘤的發生發展。本實驗通過研究5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-CdR）對HT-29和LoVo細胞株作用后Wif-1基因的DNA層面、mRNA層面和蛋白層面的改變，探討腫瘤發生發展過程中Wif-1基因失活的甲基化機制及藥物恢復Wif-1基因表達的可能性，以期尋找CRC的腫瘤標志物及新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

結直腸癌細胞株HT-29和LoVo（北京大學醫學部107實驗室）；DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；核酸蛋白質濃度測量儀B-500（上海創萌生物科技有限公司），DNA甲基化修飾試劑盒及甲基化陽性/陰性對照（美國ZYMO公司）；qPCR反應試劑ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海輝睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR擴增儀（美國Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美國Sigma公司），以DMSO溶劑充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分裝后-80℃保存；Wif-1和內參β-actin（美國Santa Cruz公司），Western blot相關試劑（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 細胞培養和干預

結直腸癌細胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μ/mL青霉素、鏈霉素的RPMI1640的培養基中常規培養，胰酶消化傳代。取貼壁生長良好的細胞以RPMI1640調整細胞密度至2×106/mL，接種于六孔培養板。干預的LoVo和HT-29細胞分別加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR混合培養液，每24小時更換新鮮培養基，連續作用72 h；以HT-29和LoVo分別加入等量DMSO溶劑培養作為對照（0 μmol/L）。

1.3 Methylight方法

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）說明提取上述兩種細胞不同濃度梯度的細胞DNA，用紫外分光光度儀（上海創萌生物科技有限公司）測DNA濃度，以DNA濃度在25 ng/μL為最低濃度，使用DNA修飾試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾，按照試劑盒說明書操作，Wif-1基因甲基化引物和探針設計：Wif-1基因序列參照GenBank。甲基化引物和探針由Beacon Designer 7.9軟件設計，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'- TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探針：FAM 5'- CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3' BHQ1，內參β-actin基因甲基化按文獻[3]設計，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探針：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反應總體系為20 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修飾后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探針FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，共50個循環；72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。經亞硫酸氫鹽修飾的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作為陽性、陰性對照，水為空白對照。

1.4 實時熒光定量PCR分析結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表達情況

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞，胰酶消化后抽提細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，行實時熒光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0軟件設計，上游引物：5'- GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；內參基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20 Μl PCR反應體系含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10 μmol/L）各1、0.3 μL ROX Reference Dye（50×）、4.0 μL DNA模板、3.7 μL dH2O。反應條件為95℃預變性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40個循環；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。實驗重復3次，取均值。擴增完畢后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1 mRNA表達。ΔΔCt=（Ct處理組目的基因-Ct處理組內參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因）。

1.5 Western blot分析結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白的表達情況

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞，在上述兩種細胞株各個濃度梯度的每管細胞中加入80 μL蛋白裂解和1 μL蛋白酶抑制劑PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃離心，10 min后取上清液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。總蛋白100℃變性5 min后，配制濃度為12%的SDS-PAGE凝膠，進行蛋白質電泳，蛋白電泳分離后經電轉移槽轉移至PVDF膜。BSA室溫封閉2 h后，PVDF膜置于1∶200稀釋的Wif-1單克隆抗體稀釋液中4℃冰箱內培養過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG稀釋液中37℃培養2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL發光液顯影，采集并分析處理圖像。凝膠成像系統攝像并分析各條帶吸光度值，以0.5 μmol/L 5'-Aza-CdR條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）為基準，設置為1。以目的基因條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）作為Wif-1蛋白的相對表達強度。實驗重復3次，取其平均值。

1.6 MethyLight結果判斷標準

同時擴增目的基因（Wif-1）和內參基因（β-actin），根據標準曲線得到兩者的原始拷貝數，計算標準甲基化指數（the normalized index of methylation，NIM）。其定義為：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數，Wif-1 positive指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數，β-actin sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數，β-actin positve指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數。NIM≥4為甲基化，NIM

1.7 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），行配對t檢驗，并設定P值為雙側分布，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化狀況

將陽性對照按10的倍數稀釋成1×100～1×10-6 7個濃度梯度制作標準曲線（其拷貝數為103～109/mL）。各濃度梯度反應均做復孔。MethyLight的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.907。實時熒光定量PCR得出數據按MethyLight結果判斷標準，在DMSO對照組、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀態分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。見表1、圖1。

表1 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀況

2.2 結直腸癌細胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表達狀況

實時熒光定量PCR得出的數據檢驗擴增效率（E）通過公式E=2-1/斜率-1計算，Wif-1基因mRNA為0.945，GAPDH基因mRNA為0.977，兩個基因的擴增效率相差

表2 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因mRNA表達狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.3結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白表達狀況

Western blot結果運用Image J軟件進行條帶圖像分析，獲得HT-29和LoVo細胞株各條帶光密度值，并計算出兩種細胞在各組中的平均光密度比值，進行半定量分析及統計學分析，并以各實驗分組為橫坐標，將測出相應的平均光密度比值為縱坐標，繪出柱狀圖后發現0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1蛋白表達水平較DMSO對照組上調，并且有藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統計學意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細胞株中Wif-1基因的蛋白表達水平較DMSO對照組略微上調，并且有藥物濃度依賴性但差異無統計學意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統計學意義（t = 19.414，P = 0.003；t = 30.468，P = 0.001；t = 102.233，P = 0.000）。見表3、圖3。

表3 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1蛋白表達狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

A：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；B：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細胞株Wif-1蛋白柱狀圖；C：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；D：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細胞株Wif-1蛋白柱狀圖

圖3 各組HT-29細胞株及LoVo細胞株Wif-1蛋白表達

3討論

CRC是最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年全球新發病例達123萬，病死率約為發病率的1/2。我國CRC發病率雖低于西方發達國家，但近20年來CRC的發病率仍在逐漸上升，同時，其發病年齡有增高趨勢。近年研究表明CRC的發病是多因素、多階段、多基因連續累積發生的過程，除遺傳學改變外，表觀遺傳學改變亦參與CRC的發生、發展過程。表觀遺傳學是指不涉及DNA序列改變，但基因表達卻發生可遺傳的改變，DNA甲基化、組蛋白修飾、MicroRNA等是表觀遺傳學的主要形式。與腫瘤發生關系最密切的是DNA甲基化修飾異常，其中包括基因組去甲基化及部分區域高度甲基化兩種形式。DNA甲基化可以導致癌相關基因沉默，病變迅速進展為癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能認識CRC中基因異常DNA甲基化，將可能獲得CRC診斷的腫瘤標志物及新的治療靶點[5-7]。

經典Wnt/β-catenin信號通路發現迄今已數十年，作為一條高度保守的信號通路在動物胚胎的器官發育各個階段均發揮異常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信號傳導通路的拮抗基因之一，屬SFRP拮抗家族，在種族間高度保守，最早在人類視網膜中發現[8]。它主要通過捆綁Wnt信號蛋白，阻止其與Frizzled受體相互作用，從而抑制通路的異常激活。Nosho等[9]的研究發現，在早期CRC中伴有Wif-1表達的下調，可能通過引起經典Wnt/β-catenin信號通路的激活，導致通路下游靶基因的過度表達，伴隨細胞過度的增殖和失控的分化從而引起腫瘤的發生。表觀遺傳學改變如基因5′端CpG島甲基化是Wif-1基因失活的重要機制。已有一系列研究證實在各系統腫瘤中，啟動子區甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究顯示，Wif-1啟動子區的甲基化率都很高，分別為82.0%和74%。齊健等[15]的研究結果與國外基本一致，Wif-1甲基化率為84.7%。Wif-1基因的啟動子中存在T細胞相關因子（T cell factor，TCF）的反應元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核內靶因子，Wnt信號活化可使β-catenin在胞漿內累積并進入核內識別淋巴結增強因子/T細胞相關因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等轉錄因子，激活Wnt信號的靶基因，控制胚胎發育及細胞生長、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究結果顯示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在細胞質中的積聚及經典Wnt/β-catenin信號通路的激活。

本實驗研究中筆者采用去甲基化藥物5'-Aza-CdR處理兩個結直腸癌細胞株：MSS細胞株HT-29和MSI細胞株LoVo后通過實時熒光定量PCR檢測，筆者發現DNA層面上DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29細胞株中Wif-1基因甲基化狀態分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀態都為未甲基化，說明去甲基化藥物5′-Aza-CdR能夠逆轉Wif-1基因甲基化狀態，同時在mRNA層面上筆者發現在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統計學意義（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統計學意義（t=10.656，P=0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通過Western blot在蛋白層面上發現在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1蛋白表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統計學意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細胞株中Wif-1基因的蛋白表達水平較DMSO對照組略微上調，并且有藥物濃度依賴性但差異無統計學意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統計學意義（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。

本實驗研究顯示甲基化酶抑制劑5′-aza-dC可通過啟動子甲基化而失活的Wif-1基因的異常甲基化狀態得到逆轉，而使該抑癌基因恢復其轉錄活性，以使該基因在腫瘤的發生發展中發揮可能的抑制腫瘤的作用。腫瘤的發生發展涉及多種途徑和多種基因的改變，其中表觀遺傳學的變化逐漸受到醫學研究的重視。異常甲基化是表觀遺傳學研究的一個重要內容，往往是導致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通過對異常甲基化的進一步研究，來尋求結直腸腫瘤診斷的新標志物和治療的新靶點。

[參考文獻]

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篇9

宋慧慧，鮑文，陸祖宏

【摘要】 目的：研究p16基因在K562/A02細胞株的表達情況及其與耐藥的關系。方法：用PCR法對慢性髓系白血病細胞株K562及其耐藥細胞株K562/A02進行p16基因缺失檢測。結果：K562及K562/A02細胞株經PCR擴增后，均未擴出相應條帶。結論：K562/A02細胞株與K562細胞株一樣，均表現為p16基因缺失。

【關鍵詞】 p16基因； K562細胞株； K562/A02細胞株； 表達； 缺失

腫瘤的發生、發展是一個多步驟的過程，其中抑癌基因的失活扮演了重要角色。抑癌基因的失活可以通過多種途徑，如缺失、突變、啟動子區域的異常甲基化等。p16基因是1994年由Kamb等［1］發現的多種腫瘤抑制基因（multiple tumor suppressor gene，MTS1），在細胞增殖周期調控中發揮重要的作用。p16的失活與多種血液系統惡性疾病有著密切的關系，失活的主要方式包括基因缺失、點突變、甲基化、基因重排等。Quesnel等［2］報道了p16基因在K562細胞株中是缺失的，而p16基因在K562的耐藥細胞株K562/A02中的表達情況目前尚未見報道。本試驗擬研究p16基因在K562/A02細胞株的表達情況及其與耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

K562細胞株購自上海細胞生物研究所，用RPMI1640培養基（Gibco公司產品）加10％胎牛血清(杭州四季青公司產品)，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養箱中培養，48h傳代1次，培養中的細胞均保持在(0.1～0.5)×106 ml-1的密度。K562／A02細胞株系K562細胞株經阿霉素(ADM)逐步誘導形成，由中國醫學科學院血液學研究所提供，培養及傳代過程同K562細胞株。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 實驗用細胞為對數生長期細胞，用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，TE溶解，經紫外分光光度計定量，-20℃保存備用。

1.2.2 PCR引物 根據p16基因的核酸序列自行設計，由上海生工生物工程公司合成。引物序列:上游5′-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA-3′，下游5′-TACCTGATTCCAATTCCCCTGCAAACT-3′，β-Globin基因擴增產物為664bp。若擴增出內參照片段而無目的片段，則判為基因缺失。擴增條件:反應體系30μl，其中含10倍PCR緩沖液3μl，Mg2+1.6 mmol·L-1，dNTPs 200μmol· L-1，引物各 1μmol·L-1，模板DNA1μl，Taq DNA 聚合酶 2U。PCR在Gene Amp2400PCR 系統上進行:于95℃預變性5min;95℃變性60s，62℃退火60s，72℃延伸30s，共30 個循環。

1.2.3 電泳觀察 PCR擴增結束后取5μl PCR產物與1μl電泳上樣緩沖液混合后進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，條件為200V電泳15min，在凝膠成像系統(Syngene，Gene Genius)觀察PCR結果。

2 結

果

如圖1，從左往右（1～4）依次為對照組（正常人外周血DNA）、Marker、K562細胞株DNA、K562/A02細胞株DNA。顯示對照組可擴出內參條帶（664bp）及p16基因條帶（320bp），K562細胞株和K562/A02細胞株均擴出內參條帶而無p16基因條帶，證實K562與 K562/A02細胞株均為p16基因表達缺失。

3 討

論

p16基因位于人染色體9P21區，全長8.5kb，編碼1個含156個氨基酸殘基、相對分子質量為15800的蛋白產物，即P16蛋白，它是細胞周期依賴性激酶(CDK)的抑制蛋白。正常情況下P16蛋白與細胞周期蛋白D（Cyclin D）競爭結合CDK4、CDK6，抑制兩者的活化，未活化的CDK4、CDK6不能解除視網膜母細胞瘤蛋白(pRB)對轉錄因子的抑制，從而阻止細胞從G1期進入S期，抑制DNA的合成和細胞增殖。當P16蛋白丟失時，Cyclin D和CDK4、CDK6結合就會增多，使腫瘤細胞逃避負性調控，成為惡性生長的重要環節［3］ 。

p16抑癌基因是細胞周期調節RB途徑中重要的成分，也是該途徑受到損害時最易發生遺傳學改變的基因之一。在血液系統腫瘤中，p16基因主要在淋巴系統腫瘤中發生改變，在急性淋巴細胞白血病(ALL)特別是兒童ALL中p16基因的缺失可達26％～75％，在急性髓系白血病（AML）中缺失率很低，在慢性髓細胞白血病原始細胞危象期特別是原始淋巴細胞危象期時缺失率可達35％［4］。

目前血液系統惡性疾病的治療以化療為主，但是原發性或獲得性耐藥仍然是影響化療效果的重要因素。近年來越來越多的證據證明，腫瘤的耐藥不僅與腫瘤基因的擴增、易位、缺失、突變有關，而且與表觀遺傳學改變也有著密切的關系。表觀遺傳學最常見的改變就是啟動子區域的CpG島甲基化狀態的改變，很多抑癌基因啟動子的異常甲基化所致的基因沉默亦可以導致耐藥的產生。此外一些促進藥物外排基因的甲基化異常也可以誘導產生耐藥。

轉貼于

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是化療失敗的主要原因之一，7號染色體上MDR1編碼的P-糖蛋白表達增強是MDR的主要機制之一。MDR1基因啟動子區域因富含胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G），故根據Gardiner-Garden 的定義屬于CpG島。1997年Kusaba等［5］率先提出甲基化可能是調控MDR1基因表達的開關，他們將攜帶有人MDR1基因的酵母人工染色體轉染至小鼠細胞中，用長春新堿誘導成耐藥株，與敏感株比較，耐藥株的MDR1基因選擇性表達增高，同時該基因的5′端呈現低甲基化狀態，推測用化療藥物后MDR1基因編碼的P-糖蛋白表達增高可能與該基因的5′啟動子區或其它區域的去甲基化狀態有關。

一些藥物轉運相關基因啟動子的甲基化可以阻礙化療藥物在腫瘤細胞中聚集，從而降低腫瘤細胞中的藥物濃度。如編碼還原型葉酸轉運體基因啟動子的甲基化可以阻礙乳腺癌細胞對氨甲喋呤(MTX)的聚集［6］。Nakayama等［7］對AML的MDR1基因甲基化進行研究，發現MDR1基因表達和啟動子5′末端甲基化狀態間存在負相關。朱燕等［8］發現ALL及多發性骨髓瘤（MM）患者骨髓MDR1基因表達水平與基因轉錄起始點上游-110和150處兩個CCGG位點的甲基化程度呈負相關。

Lu等［9］在對206名卵巢癌患者MDR1表達的研究中發現，MDR1的表達與p16有著密切的關系。有文獻表明，p53基因突變后腫瘤細胞凋亡受阻，導致對化療藥物敏感性減低［10］。

本試驗采用PCR法檢測到K562阿霉素耐藥株K562/A02的p16基因表達缺失，同時檢測了K562細胞株p16基因表達情況，證實了其p16基因也表達缺失，與文獻報道［11］一致。K562和K562/A02細胞株p16基因缺失是否與其過度甲基化有關，與耐藥又是否存在關聯，值得進一步試驗和探討。

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篇10

[關鍵詞] 細胞外基質；間質毛細血管；腎纖維化；巨噬細胞；成纖維細胞

[中圖分類號] R692 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（a）-0045-04

The cellular and molecular basis of renal fibrosis

XIAO Chengcheng ZHANG Jie

Department of Urology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] The destruction of normal kidney parenchyma caused by fibrosis is a common cause of chronic kidney disease. Understanding the pathogenesis of renal interstitial fibrosis can provide a better treatment option for chronic kidney disease. Although complex， it can be mainly summarized as the following four aspects： ①Interstitial inflammatory reaction， which participates in the pathogenesis and repair process. ②Myofibroblast mainly derived from the renal interstitial cells （fibroblasts） forms a unique cell mass， which participates in the formation of extracellular matrix （ECM） and interstitial scars. ③Renal tubular epithelial cells participate in early kidney injury， and in the late kidney injury， they become the victim of fibrosis for the loss of the regenerative ability. ④The damaged integrity of interstitial capillaries results in the disruption of oxygen transport， and the incidence of a malignant cascade of hypoxia and oxidative stress aggravates renal injury and fibrosis. Due to the lack of sufficient blood vessel formation， the healthy capillary network can not be maintained. The importance of genetic and epigenetic factors has also been paid more attention. The incidence and development of cardiac syndrome is closely related to the high morbidity and mortality of renal fibrosis.

[Key words] Extracellular matrix； Interstitial capillaries； Renal fibrosis； Macrophages； Fibroblasts

慢性腎臟病的高發病率給社會和患者家庭帶來了沉重的經濟負擔。普遍認為纖維化造成的正常腎實質破壞是導致慢性腎臟病漸進性損傷的常見致病因素。盡管大量研究已發現導致纖維化的關鍵細胞和分子介質，但尚未得到臨床驗證[1-4]。目前13%～16%的慢性腎臟病患者需行血液透析治療，遠期他們可能需進行腎移植治療，而慢性腎臟病所致的心血管疾病高患病風險更使患者生存率明顯降低[5]。基礎科學研究的快速發展為研究新的治療方法提供了平臺。參與纖維化主要介質的發現，更為靶向治療的發展打下基礎。本文對腎纖維化的細胞和分子基礎進行綜述，為基礎研究及臨床工作提供參考。

1 腎纖維化的細胞與分子介質

1.1 炎性細胞

慢性腎疾病的共同特點是巨噬細胞參與的間質浸潤，其密度與移植腎存活率呈負相關[1]。在不同環境下，巨噬細胞可合成和分泌多種產物，包括生長因子和細胞因子[轉化生長因子β（TGF-β）、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、腫瘤壞死因子-α、γ-干擾素、肝細胞生長因子]，酶及其抑制劑（血管緊張素轉換酶、纖溶酶原激活因子、纖溶酶原激活物抑制物-1、膠原酶、基質金屬蛋白酶組織抑制劑），基質蛋白（膠原蛋白、纖連蛋白、凝血酶敏感蛋白）和許多其他產物（補體蛋白、凝血因子、生物活性脂質、活性氧、一氧化氮、內皮素等）[6]。已有實驗表明減少間質中巨噬細胞的數量可減輕腎纖維化程度[7]。

多功能巨噬細胞與組織潛在損傷的關系已被公認，其分子基礎在過去十年的重要科學進展中已被闡明[8]。經典活化的M1型巨噬細胞與替代激活的M2型巨噬細胞來源于局部刺激下暴露的單核細胞。誘導M1型巨噬細胞形成的主要是γ-干擾素、脂多糖、腫瘤壞死因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，主要與組織損傷相關；而白細胞介素（IL）-4、IL-13、糖皮質激素、維生素D、巨噬細胞集落刺激因子和TGF-β誘導M2型巨噬細胞形成，其可能促進組織損傷的修復。當務之急是確定兩者之間的微妙聯系。這依賴于基因、蛋白質和代謝分析研究。例如Ⅰ型甘露糖受體，精氨酸酶-1的出現將抑制M2細胞。在可逆性肝損傷模型中，巨噬細胞的功能已被闡明。損傷誘導期抑制巨噬細胞可減輕纖維化[9]。纖維化是傷口愈合的重要組成部分，但還需要進一步研究M2型巨噬細胞應答后修復形成的正常腎實質與導致慢性腎臟病的不良瘢痕的關系。這突出了體外介導巨噬細胞修復腎組織的治療潛力，有待動物實驗進一步證實[10]。

1.2 肌成纖維細胞

肌成纖維細胞是最開始出現在纖維化腎間質中的細胞群[2]，其出現是瘢痕形成必不可少的條件，已有研究表明，其數量與預后密切相關，其特征為由具有成纖維細胞形態特征的間質細胞所分泌的α-平滑肌肌動蛋白（αSMA）。有研究證實肌成纖維細胞是瘢痕中基質蛋白的主要來源，這表明肌成纖維細胞的存在是纖維化必不可少的條件。肌成纖維細胞的來源已在動物模型中被廣泛研究，但仍未達成共識。譜系追蹤研究采用了遺傳工程策略和不同的細胞追蹤方法，最終出現了相悖的結果[2，11-13]。αSMA本身可能不是促進纖維化的蛋白，據報道，αSMA遺傳缺陷的小鼠會發生更嚴重的腎纖維化[14]。最近的研究發現細胞亞群表達的甘露糖受體-2可降解細胞外基質[15]。不同細胞起源的肌成纖維細胞存在的功能異質性還有待探索。

大部分肌成纖維細胞來源于內源性腎細胞的遷移、增殖和轉化。腎成纖維細胞和微血管管周細胞是原始肌纖維母細胞的主要來源[16]。當少量基質產生時，成纖維細胞也可來源于髓質細胞，然而在腎臟嚴重損害時，腎小管上皮細胞、內皮細胞也可以轉分化為肌成纖維細胞，其總體數量較小，并持續存在至病程后期[17]。

1.3 腎小管上皮細胞

在慢性腎損傷誘導期，腎小管上皮細胞通過產生合成產物（活性氧、炎癥介質等）主動參與損傷過程。多種來源于血漿或腎小球異常過濾的尿蛋白參與損害腎小管上皮細胞[3]。尿蛋白可以通過結合其相關受體激活特定的細胞反應。替代激活途徑可被生化修飾或共軛尿白蛋白激活，包括近端小管受體介導蛋白的內吞作用和激活其受體具體信號的反應[18]。后一種途徑與刺激炎癥趨化因子（由正常T細胞表達和分泌所調節的單核細胞趨化蛋白-1、IL-8、趨化因子、TGF-β、內皮素）的合成有關。在何種程度上尿蛋白會激活腎小管上皮的細胞反應尚不清楚，但這可解釋蛋白尿的程度與慢性炎癥及纖維化密切相關這一無可爭議的事實。

隨著纖維化的進展，腎小管上皮細胞會加速凋亡和衰老，這使其失去再生能力。這一轉變可能涉及細胞周期的多種具體因素，例如自噬失敗、內質網應激、氧化應激和信號缺失等[19-21]。腎小管上皮細胞死亡是腎實質損害的重要特征，非功能性腎小管和腎小球的出現會導致嚴重的后果。腎小管上皮細胞的組織學指標與腎功能密切相關[22]。保護并再生功能性上皮細胞，維持腎單位的完整性和功能性是有效治療慢性腎疾病不可或缺的組成部分。新一代測序技術已經揭示導致人類腎性營養不良的基因突變，如無翅型MMTV整合家族成員4，其為腎功能的再生研究奠定了堅實基礎[23]。

1.4 間質毛細血管

腎臟代謝活動是高耗氧過程，已有研究對漸進性纖維化與缺氧所致的慢性腎臟病進行比較[4]。慢性腎損傷的早期，間質微血管通透性增加[24]。因此，當血漿蛋白如纖維蛋白原和白蛋白結合物漏入間質（腎毛細血管滲漏綜合征）時，會發生炎癥和纖維化反應。在慢性腎疾病中，致病的關鍵血漿蛋白尚未被確定，最可能是纖維蛋白，因為當腎間質中纖維蛋白減少時，αSMA含量會相應降低[25]。雖然許多慢性疾病的特點是血管過度增生，但慢性腎臟病卻發生相反的變化――血管生成受阻，有效間質毛細血管數量顯著下降。這使研究人員考慮使用血管生成因子或阻滯抗血管生成因子治療慢性腎臟病，但在進行性腎瘢痕形成過程中，其作用被證實為無益的[26]。

缺氧-氧化應激與腎纖維化緊密相關。腎小管細胞氧化應激是慢性腎臟損傷的普遍特征，這可能是由于活性氧過度生成和抗氧化能力不足的后果。活性氧的特異性分子靶點對腎纖維化的作用還有待被探索，在將來我們可能會對其有更多的了解，因為代謝組學研究可以確定正常及纖維化腎臟中糖、核苷酸、氨基酸和脂類的具體分布。氧作為細胞信號分子的作用已被證實，也已證實其與纖維化途徑有關[27]。高通量篩選技術的出現使通過改善受損腎臟氧化還原能力的治療藥物出現成為可能。最近有實驗表明半胱胺具有抗腎纖維化的作用，其作用機制可能與減輕氧化應激反應有關[28]。

2 纖維化反應的遺傳和表觀遺傳學調控

同類原發性腎臟病患者的長期預后存在高度差異性是公認的。毫無疑問，遺傳學起著重要的作用，最好的例子是腎臟病結局與種族的相關差異性。非裔美國人載脂蛋白L1基因型（G1和G2的風險等位基因）與腎臟病預后密切相關，這是基因影響腎纖維化嚴重程度的最新例證[29]。

通過全基因組研究，探索慢性腎臟病的風險與嚴重程度的關系，盡管無法確定其因果關系，并且基因的多態性未必導致蛋白功能改變，但人類慢性腎臟病全基因組關聯研究提供了鑒別新目標人群的無偏方法，其潛在作用值得進一步研究。在最近的幾項人全基因組關聯研究中，尿調節素（UMOD）被確定為慢性腎臟病的風險及嚴重程度的重要決定因素[30]。UMOD基因編碼一N蛋白質，在亨利髓袢升支和早期遠端小管特異表達。盡管目前UMOD的基本功能未知，但其在正常人尿液中含量很高，蛋白編碼基因突變是以慢性腎小管間質腎炎為特點的家族性腎臟病的已知誘因。隨著人類遺傳研究水平的提高，我們可以預見，在慢性腎臟病遺傳學領域將有重大突破。

非蛋白編碼基因序列的改變也可能影響纖維化過程，其機制可能包括DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA活動等。這些機制都有改變腎纖維化進程的潛能，例如，在腎纖維化的實驗模型中，使用去甲基化劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑和抗miRNA-21治療后，間質的肌成纖維細胞數目顯著減少。此外，已有研究證據表明在一些患病動物和人類組織樣本中，microRNA-21出現失調控[31-34]。反應性纖維化的表觀遺傳學調控為我們研究環境對基因調控通路的影響提供了新思路。

3 心腎綜合征

大多數慢性腎臟病患者沒有達到需要腎臟替代治療維持生命的地步，但他們中很多卻早卒于心血管疾病。慢性I臟病風險的上升與心功能衰竭的發生幾乎呈指數級關系。在DuBose等[5]的一項研究中，eGFR60 mL/（min?1.73 m2）的人群高17倍。內皮細胞功能障礙、炎癥、平滑肌細胞增殖、氧化應激、血管鈣化等多種因素都可促進心腎綜合征的發生。在減輕腎纖維化、高血壓和/或蛋白尿的同時，也應減少心血管疾病的發生率和嚴重程度，提高患者的生存率。

在過去的20年中，基礎科學研究提高了我們對纖維化細胞和分子基礎的理解，使我們了解到正常結構和功能的腎通過纖維化逐漸轉變為功能惡化的腎的過程。

盡管許多問題還有待解答，但我們必須從現在做起，將已有的研究成果轉變成有效預防、治療甚至治愈人類慢性腎疾病的策略。

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