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【關鍵詞】結核分枝桿菌ImmuneresponsesandprotectiveefficacyinducedinmicebyMycobacteriumtuberculosisMPT64ESAT6fusionprotein【Abstract】AIM:ToevaluatehumoralandcellmediatedimmuneresponsesbyMPT64andESAT6fusionproteinsandtotestprotectiveefficacyagainstMycobacteriumtuberculosis(MTB)challenge.METHODS:BALB/cmicewereimmunized3timesat2weekintervalsubcutaneouslyonthebackwithfusionproteinMPT64ESAT6.Inthespleenlymphocytesofimmunizedmicestimulationindex(SI)wasmeasuredbyMTTmethodandthelevelofsecretedIFNγwasdetectedbyELISA.SomeofvaccinatedBALB/cmicebyfusionproteinswereintravenouslyinfectedwith1×105CFUMTBstrainH37Rv.Fourweekslater，bacterialloadinspleenswasdetermined.RESULTS:ThetiterofseraspecificantibodyinBALB/cmiceimmunizedwithfusionexpressionproteinMPT64ESAT6was1∶1500.TheSIoflymphocytesinfusionproteinimmunizedgroupwas2.23,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup(0.88).TheIFNγlevelinculturesupernatantofspleenlymphocytesfromthemiceimmunizedwithfusionproteinswere(4.28±0.27)μg/L,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup［(0.48±0.17)μg/L,P<0.05］,butlowerthanthatofBacillusCalmetteGuerin(BCG)immunizedgroup［(5.18±0.31)μg/L］.Comparedwithsalineimmunizedmice（bacterialloadwas6.45±0.17）,dramaticreductionswereobservedforMTBreplicationinthespleenfromBALB/cmiceimmunizedwithfusionproteins(bacterialoadwas5.04±0.11)followingasubsequentchallenge,buttheprotectiveefficacyinmiceimmunizedwithMPT64ESAT6wasnotasgoodasthatofBCGimmunizedgroup(bacterialloadwas4.38±0.22).CONCLUSION:MPT64andESAT6fusionproteinscouldbeusedasanovelcomponentofthenewTBvaccine.【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis；vaccine；MPT64；ESAT6；fusionexpression【摘要】目的：測定MPT64與ESAT6融合蛋白在小鼠體內誘導的免疫應答及保護力.方法：將MPT64與ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次，每次間隔2wk，ELISA測定免疫小鼠血清特異性抗體的滴度.最后一次免疫完成后4wk，分離部分免疫小鼠脾淋巴細胞，MTT法檢測淋巴細胞刺激指數，ELISA檢測懸液中IFNγ水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠經尾靜脈感染MTB毒株H37Rv，4wk后計數脾臟細菌負荷數.結果：MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特異性抗體滴度1∶1500，免疫小鼠后淋巴細胞刺激增殖指數為2.23，而生理鹽水免疫組只有0.88；脾淋巴細胞懸液中誘發的IFNγ為（4.28±0.27）μg/L，顯著高于生理鹽水免疫組［（0.48±0.17）μg/L，P<0.05］，但不及BCG免疫組［（5.18±0.31）μg/L］.與生理鹽水免疫組（細菌負荷6.45±0.17）相比較，融合蛋白免疫的小鼠，對攻擊感染后抗MTB在脾臟中增殖有顯著作用，細菌負荷為5.04±0.11，但與BCG免疫組相比脾臟細菌負荷減少甚微（細菌負荷4.38±0.22）.結論：MPT64與ESAT6融合蛋白可作為新型結核疫苗的候選組分.【關鍵詞】結核分枝桿菌；疫苗；MPT64；ESAT6；融合表達0引言ESAT6（Mr6000的早期分泌蛋白）和MPT64是結核分支桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）中重要的保護性抗原,編碼這兩種蛋白的基因只存在于MTB毒株中而卡介苗（BacillusCalmetteGuerin,BCG）中缺失［1］，研究發現重組的MPT64和ESAT6蛋白免疫小鼠后均可有效抵抗MTB感染.本研究在成功獲得MPT64與ESAT6融合蛋白的基礎上［2］，研究該融合蛋白在小鼠體內誘導的免疫應答水平和對MTB毒株H37Rv攻擊的保護力.1材料和方法1.1材料MTB毒株H37Rv由陜西省結核病防治研究所王瑞副主任技師惠贈；卡介苗疫苗株由蘭州生物制品研究所出品（國藥準字SF20010035，批號20011201）；鼠IFNγ和ELISA檢測試劑盒購自晶美公司；潮霉素（GIBCOBRL公司）.BCG培養增強劑（albumindextrosecatalaseADC）和RPMI1640培養基均購自GIBCO公司.7H9液體培養基購自美國Difco公司；改良羅氏培養基由本室自制，MTB的培養濾液蛋白(culturefiltrateproteins,CFP)由本室制備.羊抗鼠IgGHRP購自華美生物公司.6~8周齡BALB/c小鼠，雌性，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，飼養于第四軍醫大學動物中心感染實驗室.1.2方法1.2.1MTB毒株H37Rv的培養和定量取羅氏培養基中保存的MTB毒株H37Rv接種到7H9培養基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），37℃振搖培養3wk，5000r/min離心10min，收集細菌，保存于-20℃備用.用7H9液體培養基系列稀釋濃縮液，接種于羅氏培養基37℃培養2wk，計數濃縮液細菌的CFU.1.2.2BCG的培養和定量取BCG疫苗株接種到7H9液體培養基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），相同方法培養、收集BCG，并計數細菌的菌落形成單位（colonyformingunits,CFU）.1.2.3融合蛋白的大量制備取MPT64pProEXHTESAT6陽性克隆［2］，活化后分別接種到1000mLLB培養液中，37℃振搖培養至對數生長期，IPTG誘導，集菌，先進行SDSPAGE，采用Invitrogen的NiNTA純化試劑盒純化目的蛋白，分光光度法測定蛋白濃度.1.2.4免疫動物實驗隨機分為3組，每組10只小鼠，一組用MPT64ESAT6融合蛋白免疫BALB/c小鼠；免疫劑量均為1mg/只，共免疫3次，第一次和第二次免疫加有不完全福氏佐劑，第三次單純免疫融合蛋白，每次間隔2wk，免疫結束后，收集小鼠血清，用CFP作為抗原，ELISA測定免疫小鼠血清特異性抗體滴度,其余兩組分別為BCG和生理鹽水對照組.最后一次免疫結束后4wk，進行以下實驗：每組取5只小鼠，用于測定淋巴細胞刺激指數(stimulationindex,SI)和IFNγ水平；其余5只用于毒株攻擊實驗.1.2.5脾臟淋巴細胞的分離與制備將免疫的小鼠斷頸處死，無菌取脾臟，置于平皿內200目的鋼網上，用注射器針芯研磨，并加入RPMI1640培養液沖洗.將上述細胞懸液轉入2倍體積的淋巴細胞分離液，1000r/min離心20min.吸取中間單核細胞層，用RPIM1640液洗滌兩次后計數.1.2.6特異性淋巴細胞增殖實驗將分離的淋巴細胞濃度調整至5×108/L，在96孔板中用100mL/LFCS的RPMI1640完全培養液培養，200μL/孔，同時實驗組每孔加入25μLMTBCFP（25mg/L溶于PBS，本室制備），對照組不加CFP，調零孔不加脾細胞，37℃50mL/LCO2孵箱培養68h后，每孔加20μLMTT（5g/L，溶于PBS，pH7.2，過濾除菌），繼續培養4h后棄上清，加DMSO150μL/孔，振蕩10min，測定A490nm值.結果用刺激指數SI=實驗組A值/對照組A值表示.1.2.7IFNγ的誘生及含量的測定5×109/L脾細胞在24孔板用含10mL/LFCS的RPMI1640完全培養液中培養，800μL/孔，同時加入MTBCFP100μL/孔，37℃50mL/LCO2孵箱培養72h，收集培養液，5000r/min離心5min，取上清，-20℃凍存備檢.參照試劑盒說明（夾心ELISA法）測定各標本所含IFNγ濃度.1.2.8MTB毒株H37Rv的攻擊實驗最后一次免疫完成后4wk，用MTB毒株H37Rv經尾靜脈感染小鼠，劑量為105CFU/只，4[1][2]wk后，斷頸處死小鼠，脾臟勻漿，計數細菌CFU.統計學處理：實驗數據以x±s表示,統計分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗,P<0.05有統計學意義.2結果2.1小鼠體內特異性抗體滴度MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠三次后血清特異性抗體滴度平均值為1∶1500.2.2抗原特異性脾臟淋巴細胞增殖實驗分離免疫小鼠的脾臟淋巴細胞，在體外用CFP抗原刺激，測定了淋巴細胞的增殖反應，與生理鹽水對照組（SI為0.88）相比較融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠的脾淋巴細胞增殖明顯，SI為2.23，BCG免疫組SI為3.58，高于融合蛋白免疫組.2.3脾臟淋巴細胞中誘生的IFNγ水平MPT64ESAT6免疫的小鼠的脾淋巴細胞懸液，體外用CFP刺激，其懸液IFNγ含量分別為（4.28±0.27）μg/L，與生理鹽水對照組（0.48±0.17)μg/L相比較有明顯增加（P<0.05），但不及BCG免疫組［（5.18±0.31）μg/L,P<0.05］（圖1）.2.4免疫小鼠對MTB毒株攻擊時的抵抗作用免疫完成后4wk，H37Rv經尾靜脈感染BALB/c小鼠，4wk后計數脾臟細菌負荷數，與生理鹽水免疫組（細菌負荷數6.45±0.17）相比較，融合蛋白MPT64ESAT6免疫的BALB/c小鼠，對攻擊感染后抗MTB在脾臟中增殖有顯著作用（細菌負荷數分別為5.04±0.11），但與BCG免疫組（細菌負荷數為4.38±0.22）相比較脾臟細菌負荷減少甚微.aP<0.05vs生理鹽水.n=5.圖1融合蛋白在小鼠脾臟淋巴細胞中誘生的IFNγ水平（略）3討論卡介苗（BCG）是目前唯一的預防結核病疫苗，但其對成年人結核病的預防效果不穩定，保護力常發生變化（0~80%）［3］，因此，研制全面有效的新疫苗是控制結核病的重要途徑.融合亞單位疫苗具有成分明確，使用安全，可減少純化步驟等優點而受到國內外的重視.目前已知的保護性抗原有MTB早期分泌蛋白Ag85B復合物、ESAT6和MPT64［4］等，選擇這幾種抗原制備的亞單位疫苗可誘導強烈的特異性免疫應答，并不受先前接觸分枝桿菌的影響.單個蛋白構成的亞單位疫苗產生的特異性體液和細胞免疫應答是針對每一組分抗原的，機體獲得的免疫保護力有限，因此新型TB疫苗著重于融合多個免疫表位［5］.本研究中將純化的MPT64與ESAT6融合蛋白，免疫小鼠，特異性抗體滴度可達到1∶1500，顯著高于已報道文獻［6］中抗體的滴度，融合蛋白免疫三次后，小鼠特異性淋巴細胞增殖指數顯著升高，說明淋巴細胞被有效活化.IFNγ常被認為是抵抗MTB感染的一個關鍵性細胞因子，也是Th1型細胞免疫反應的重要指標，TB的保護性效應與分泌IFNγ的淋巴細胞的產生密切相關.融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠誘生的IFNγ水平顯著高于生理鹽水對照組（P<0.05），提示這兩種融合基因可能是TB疫苗中理想的候選基因.MTB毒株攻擊實驗中，與生理鹽水組相比較，MPT64ESAT6免疫組使得細菌數由6.45±0.17降為5.04±0.11，有效控制了MTB的感染，但與BCG免疫組相比免疫保護力還是有一定差距.研究發現，單獨使用結核桿菌短期培養液中分離純化的分泌型蛋白免疫動物，只會產生很弱的免疫應答，亞單位疫苗必須配以適宜的佐劑多次接種才能達到效果［7］，在本研究中，采用不完全福氏佐劑具有很強的免疫調節作用，可刺激產生IL2，IFNγ和IL12，是本室較常用的一種免疫策略.MPT64ESAT6融合蛋白誘導的保護力有限，分析原因可能是因為保護性抗原種類不多，難以誘導產生廣泛而全面的細胞免疫應答；同時蛋白質在體內的滯留時間短并且其產生的免疫應答的持續時間也較短，需選擇合適的劑量［8］，多次免疫才能達到有效的保護水平.【參考文獻】［1］KamathAT,FengCG,MacdonaldM,etal.DifferentialprotectiveefficacyofDNAvaccinesexpressingsecretedproteinsofMycobacteriumtuberculosis［J］.InfectImmun,1999,67(4):1702-1707.［2］師長宏,王曉武,生,等.結核分枝桿菌差異蛋白MPT64與ESAT6的融合表達與純化［J］.第四軍醫大學學報,2005,26(20):1840-1842.［3］范雄林,徐志凱,李元,等.結核分枝桿菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］.第四軍醫大學學報,2001,22(14):1283-1287.［4］DohertyTM,AndersenP.Tuberculosisvaccinedevelopment［J］.CurrOpinPulmMed,2002,8(3):183-187.［5］師長宏,范雄林,徐志凱,等.結核分枝桿菌分泌蛋白Ag85BESAT6的融合表達及純化［J］.中華結核和呼吸雜志,2004,(2):89-92.［6］薛瑩,李元,史皆然,等.結核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B的免疫學特性［J］.第四軍醫大學學報,2002,23(13):1203-1205.［7］LangermansJA,DohertyTM,VervenneRA,etal.ProtectionofmacaquesagainstMycobacteriumtuberculosisinfectionbyasubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85BandESAT6［J］.Vaccine,2005,23(21):2740-2750.［8］DietrichJ,AagaardC,LeahR,etal.ExchangingESAT6withTB10.4inanAg85Bfusionmoleculebasedtuberculosissubunitvaccine:EfficientprotectionandESAT6basedsensitivemonitoringofvaccineefficacy［J］.JImmunol,2005,174(10):6332-6339