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摘要:目前天然藥物化學實驗課程中缺少對天然產物立體構型確定的內容。在多年教學科研工作基礎上，提出以青蒿素構型和構象為主題，將實物球棍HGS分子模型和ChemOffice軟件中模擬分子模型應用到天然藥物化學實驗中，同時整合TopSpin核磁共振圖譜處理軟件和CCDC晶體數據庫網絡資源，構建“天然產物立體結構分析”互動實驗教學平臺。旨在幫助學生更好地理解相對構型、絕對構型、構象等概念，提高學生對復雜天然產物進行結構解析的能力。

關鍵詞:天然藥物化學實驗;立體化學;分子模型;青蒿素

天然藥物化學作為國內藥學和中藥學相關專業的必修專業課程，從天然產物的提取分離、理化性質和結構鑒定等方面，為未來創新天然藥物研發人才提供了重要的知識儲備。隨著2015年中國科學家屠呦呦因對青蒿素研究的貢獻獲得諾貝爾生理學或醫學獎，以及2016年國家實施《中醫藥發展戰略規劃綱要(2016－2030年)》，方興未艾的天然藥物研究也給該課程的理論和實驗教學提出了更高的要求。作為理論教學的重要輔助課程，天然藥物化學實驗給學生提供了對理論知識點加以驗證的機會，同時還可以培養學生的觀察、思考和操作能力。國內相關院校也以提高學生興趣、參與度和創新能力為目標，在教學方法上進行了大膽的改革嘗試。例如，引入慕課輔助教學模式［1］、開展自主設計性實驗［2］和發現式實驗教學［3］等。然而，目前國內天然藥物化學實驗仍局限于特定結構類型化合物的提取分離和理化鑒別反應，而缺失通過波譜學方法對復雜天然產物化學結構，尤其是立體結構確證的教學內容。眾所周知，利用波譜學方法確定化合物平面結構及立體構型一直以來是傳統天然藥物研究中必不可少的一個環節，而目前通過計算機軟件預測化合物生物學靶標之前也需要明確化合物的立體構型和構象。因此，天然產物立體化學及其相關波譜學方法和其他確定手段(包括單晶X-射線衍射、分子模型分析等)，應該成為天然藥物化學理論和實驗教學中學生必須掌握的基礎知識，并且應該通過教學改革，學校提供給學生更多可視化、可操作、可記錄的實踐機會。分子模型是天然產物立體結構確證中應用最廣泛的手段，其可以獲得最直觀的分子空間結構，并幫助學生更好地解讀核磁共振波譜數據。目前主要有兩種構建分子空間模型的方法:一種是傳統的球棍模型。例如，日本Maruzen公司的HGS分子構造模型，其可以使學生在手動搭建模型的過程中獲得更多的體驗感和直觀認識，因此這種模型在日本藥學高等院校的化學相關課程教學中得到很好的應用;另外一種為ChemOffice等化學結構繪圖軟件中包含的Chem3D組件，其可以將ChemDraw繪制的二維結構轉化為三維空間結構，并通過能量優化獲取化合物最穩定的空間構象，在目前天然產物構象的確定中應用廣泛?；谝陨戏治?，圍繞天然產物立體結構確證這一重要知識點，筆者提出將HGS分子模型引入天然藥物化學實驗教學內容，同時激活整合ChemOffice軟件包、TopSpin核磁共振圖譜處理軟件、劍橋晶體學數據中心［TheCambridgeCrystallographicDataCentre(CCDC)］網絡資源、互動教學系統等教學資源，構建“天然產物立體結構分析”的互動實驗教學平臺。在鞏固天然藥物化學理論教學效果的基礎上，提升天然藥物化學實驗課程的教學水平，進而全面促進學生對天然產物結構鑒定相關知識的學習，為他們未來就業或研究生學習提供更強的競爭力。

1基于分子模型互動教學的“天然產物立體結構分析”實驗平臺的構建

為了提高學生對該實驗教學內容的興趣，筆者以青蒿素立體結構的確定為例，以數碼互動教學系統為載體，在引入HGS分子構造模型動手操作環節的基礎上，結合計算機操作，構建起“化學結構繪制”“NMR信號分析”“分子模型搭建”和“晶體結構驗證”等相關模塊(圖1)。1.1“化學結構繪制”模塊。筆者應用ChemOffice2004軟件［4-7］中的Chem-DrawUltra8.0組件完成青蒿素結構的繪制。該模塊旨在提高學生繪制天然產物化學結構的規范性。例如，繪圖模板的選擇、鍵長鍵角的選擇、雜原子的字體大小，尤其是涉及立體構型方面手性碳的標識和楔形鍵的擺放角度等問題。結合青蒿素的結構，學生在繪制的過程中還需要注意:同一手性碳上僅標識1個基團的朝向即可。例如，C-10和C-11位上無需標識氫原子的朝向，而C-4位上無需標識甲基的朝向;所有手性碳均應明確構型。例如，C-1、C-5和C-7位等兩個環狀結構駢合的位置上應標識氫原子的朝向;應在綜合相關文獻的基礎上對結構中所有碳原子進行編號，以方便后續模塊操作中NMR信號的歸屬，以及結合分子模型和NOESY圖譜進行構象和構型的分析。1.2“NMR信號分析”模塊。應用Bruker公司面向學校和科研院免費提供的TopSpin軟件，學生在掌握軟件常規操作(例如定標、積分、標識位移等)的基礎上，對青蒿素對照品在氘代氯仿中測試得到的1HNMR、13CNMR、HSQC和HMBC圖譜進行分析，歸屬所有的1H和13CNMR信號，并整理成規范的NMR信號列表。進一步對NOESY圖譜分析，準確尋找到所有可以用于“分子模型搭建”模塊使用的相關信號。1.3“分子模型搭建”模塊此模塊操作中，學生應在NOESY相關數據的指導下，開展實物球棍模型的搭建和計算機模擬分子模型的構象優化兩方面內容。1.3.1實物球棍模型的搭建。結合國內其他院校將分子模型應用在理論教學中的工作基礎［8-10］，筆者選擇Maruzen公司的C型套裝(有機化學實驗用)HGS分子構造模型(其含有30個sp3雜化的碳原子、14個苯環碳原子以及相配套的氫原子，可以滿足絕大多數天然產物球棍模型的搭建)。每個學生使用一套模型，完成下列實驗內容:熟悉模型的基本使用方法(包括不飽和鍵，例如羰基的裝配方法)，并搭建青蒿素分子模型;根據NMR信號歸屬情況及NOESY相關信號，對化合物的相對構型進行確證，歸屬C-2、C-3、C-8和C-9位亞甲基上兩個不同朝向的質子，對結構中所有雜環的構象進行判斷。1.3.2模擬分子模型的優化。學生將在ChemDrawUltra8.0組件中繪制的青蒿素結構導入到Chem3DUltra8.0組件中，然后利用“MM2”工具欄下的“MinimizeEnergy”選項對其空間結構進行優化，獲取能量最低的構象;通過視圖放大及構象旋轉按鈕對構象進行調整，結合NOESY圖譜相關信號及實物分子模型，核對各雜環的構象，并掌握對分子構象進行調整的方法;選擇能夠看到絕大多數關鍵質子的觀察角度，調整構象大小和清晰度后，將其導入ChemDraw組件中，標識各個質子的化學位移及關鍵的NOESY相關信號后，以圖片形式進行保存。1.4“晶體結構驗證”模塊。以青蒿素的英文名“artemisinin”為關鍵詞，在AccessStructures界面檢索到存儲號為1243346的晶體結構，學生在3DViewer中通過構象旋轉選擇合適角度，與搭建的實物模型及模擬分子模型三者進行比對，驗證分子模型構建的準確性。1.5實驗平臺各操作模塊間的協調和運行。整個實驗平臺包含動手操作部分(“分子模型搭建”模塊中實物球棍模型的搭建)和上機操作部分，后者又包含四個模塊中絕大部分的操作。因此，該平臺應以數碼互動教學系統為載體來運行，從而可以使學生和教師間的信息反饋更加及時準確。四個模塊間的順序安排，一般應以“化學結構繪制”模塊起始，繪制的青蒿素結構用于Chem3D構象分析;然后，通過“NMR信號分析”模塊歸屬青蒿素的碳氫信號，并在此基礎上尋找到關鍵NOESY相關信號用于對“分子模型搭建”模塊中兩種模型構象和相對構型的校正;最后，通過“晶體結構驗證”模塊對在NOESY圖譜指導下搭建的實物和模擬分子模型進行進一步驗證。

2分子模型互動教學平臺教學內容的拓展

在上述“青蒿素立體結構確證”的實驗教學內容以外，基于分子模型互動教學平臺，筆者選擇了幾個典型的天然產物立體構型和波譜學特征相互聯系的案例，供學生選擇學習。2.1青蒿素類似物結構中的船式構象和烯丙偶合的探究。化合物HHHY-D-16(圖2)是從黃花蒿中分離得到的青蒿素類似物，學生通過測試1HNMR、13CNMR、HSQC和HMBC圖譜可確定其平面結構，進一步對NOESY圖譜進行分析確定其相對構型，同時證實了C-1/C-2/C-3/C-4/O/C-6和C-1/C-6/C-7/C-8/C-9/C-10兩個六元環均為椅式構象。根據雙氫青蒿素的晶體結構，學生可推測C-5/C-6/C-7/C-11/C-12/O所在的六元環也應為扭椅式構象。然而，在NOESY圖譜中卻沒有觀察到C-12位連氧亞甲基上任何一個質子同H-5或H-8存在相關信號，反而觀察到亞甲基上其中一個質子4.58(1H，dt，J=14.5，2.0Hz)同CH3-15(1.51，3H，s)的NOESY相關。根據上述異?，F象推測C-5/C-6/C-7/C-11/C-12/O六元環應為扭船式構象。通過搭建實物分子模型和Chem3D構象優化，證實了上述推斷，并且發現扭船式構象的能量(40.9463Kcal/mol)要略低于扭椅式構象(42.5864Kcal/mol)。上述構象同時也解釋了4.58處質子信號(朝向)的偶合裂分情況，即第二級的三重峰是由于其與C-13位兩個烯氫質子二面角均為90°，從而受到明顯的烯丙偶合影響而產生的。圖2青蒿素類似物HHHY-D-16分子模型及其構象和烯丙位偶合這項實驗內容可以讓學生結合NOESY數據，動手搭建實物分子模型，從而比較生動地理解這一特殊構象，糾正固有的“椅式構象能量一定低于船式構象”的錯誤觀念，并使學生對烯丙位偶合的強弱與二面角之間的關系建立起直觀的認識。2.2含半縮酮結構片段三萜中的質子W型偶合的探究。HJSJ-D-1(圖3)是從火炬樹中分離得到的含有六元半縮酮結構的羽扇豆烷型五環三萜類化合物。在其1HNMR中給出4.25(1H，dd，J=8.7，2.7Hz)和3.73(1H，dd，J=8.7，1.6Hz)兩個連氧亞甲基上質子信號，歸屬為結構中CH2-25。其中兩個質子的第一級偶合(偶合常數為8.7Hz)為同碳偕偶，但考慮到CH2-25鄰位的C-10為季碳，研究者對其各自第二級偶合是無法解釋的，推測可能存在質子間遠程偶合。圖3含半縮酮結構三萜HJSJ-D-1分子模型及質子間W型偶合通過Chem3D模擬和搭建實物分子模型，學生可以很容易地觀察到CH2-25兩個質子分別和處于直立鍵且為朝下的H-5和H-1間表現出非常典型的W型偶合，從而可以解釋各自第二級偶合的產生。同時，學生通過HJSJ-D-1實物分子模型，可以很好地掌握天然藥物化學第七章(三萜及其苷類)和第八章(甾體及其苷類)教學內容中環系駢合方式的判斷。2.3二氫黃酮H-2/H-3偶合裂分情況分析。天然藥物化學第五章中二氫黃酮和二氫黃酮醇的1HNMR特征和立體化學一直以來都是教學中的難點。學生通過平面結構或者教材中給出的構象很難準確地理解其H-2/H-3之間特征的質子偶合關系。在二氫黃酮類化合物圣草酚(eriodictyol，圖4)的1HNMR(CD3OD)圖譜中，給出了H-2特征的信號5.28(1H，dd，J=12.7，3.0Hz)，以及兩個H-3質子信號:3.07(1H，dd，J=17.1，12.7Hz)和2.70(1H，dd，J=17.1，3.0Hz)。學生通過分析可以發現，H-3兩個質子和H-2分別表現出偶合常數為12.7Hz和3.0Hz的鄰位偶合。通過ECD圖譜中331nm處正的Cotton效應，判斷C-2為S構型。學生通過搭建其分子模型，可以很清楚地觀察到在B環這一大基團位于平伏鍵的情況下，處于朝向直立鍵上的H-2與處于直立鍵的H-3和平伏鍵的H-3之間的二面角分別約為180°和60°，從而分別呈現出12.7和3.0Hz的鄰位偶合。

3分子模型互動教學平臺的初步應用

雖然目前互動教學系統尚未投入使用，但筆者已經將“化學結構繪制”“NMR信號分析”“分子模型搭建”和“晶體結構驗證”四個模塊的教學在兩個專業的天然藥物化學實驗中加以應用。初步探索式的運行采取自愿報名的方式從學生中選擇參與人，以興趣小組的形式組織教學活動:筆者首先進行ChemOffice2004和Topspin軟件(含青蒿素的1D及2DNMR圖譜)的安裝和操作講解;學生課前查閱相關文獻，通過ChemDraw組件進行青蒿素結構的繪制，并整理NMR信號列表;學生課上搭建實物球棍分子模型，并通過Chem3D組件獲取模擬分子模型，結合NOESY數據對兩種模型進行校正;在CCDC數據庫檢索獲取青蒿素晶體結構，與實物和模擬分子模型進行比對，熟悉青蒿素各個雜環的構象，并在此基礎上學生進一步檢索學習雙氫青蒿素的晶體結構。參與此項教學活動的學生普遍反映:通過“分子模型搭建”和“晶體結構驗證”兩個模塊的學習，真正理解了天然產物立體化學涉及的相對構型、絕對構型、構象等概念，并掌握了其確定方法;掌握了NMR圖譜處理軟件的使用方法，并且對復雜質子峰形的解析方面積累了豐富的經驗;掌握了復雜天然產物結構的規范畫法。

4結語

由于教學手段和教學條件的局限，傳統的天然藥物化學實驗課程主要圍繞提取分離和理化鑒別開設不同的教學內容，而未能給理論教學中非常突出的難點———結構鑒定提供一個通過具體操作來加深理解的機會。而筆者通過實物和虛擬分子模型的引入，激活了NMR處理軟件和結構繪制分析軟件在實驗教學中的應用，并構建起了完整的“天然產物平面結構———立體結構解析”的教學平臺。在今后的教學活動中，筆者將逐步完善該平臺在數碼互動教學系統中的運行，同時也會在科研工作中尋找更多適合應用到該平臺的化合物立體化學解析實例，以不斷提高學生對天然產物結構解析和立體化學的學習效果，并在此過程中全面提升學生自主學習的積極性和能力。

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作者:李占林 朱玲娟 張雪 高慧媛 單位:沈陽藥科大學中藥學院