導語：圖書館室內空間布局探究論文一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

［摘要］目的：在外源抗原表位表達載體系統中構建并表達乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位，并對其診斷敏感性進行評價。方法：人工合成編碼HBV“a”抗原決定簇表位中24個氨基酸(S124147)的寡核苷酸序列，克隆入外源抗原表位表達載體系統FHVRNA2I3位點，構建重組質粒，在原核pET系統(BL21細胞)中表達。通過ELISA和Westernblot檢測表達產物的抗原性，并以表達產物為包被抗原,通過ELISA和Westernblot檢測58份乙肝患者血清抗HBs。結果：嵌和蛋白可與抗HBs特異性結合，其ELISA檢測抗HBs陽性率為77.5%，Westernblot的為68%，而對照試劑盒的為62%。結論：在外源抗原表位表達系統中表達的HBV重組抗原表位具有良好的抗原性，有診斷應用價值。

［關鍵詞］HBV;抗原表位;抗原性;FHVRNA2載體系統

StudyonAntigenicityofHBVRecombinantEpitope

Abstract：ObjectiveConstructionandExpressionHBVrecombinantepitopeinaforeignepitopepresentingvector，andevalutionofdignosticsensitivityforantiHBswithHBVepitope.MethodsOligonucleotidsencodedtwentyfouraminoacids(aaS124147)whichiswithin"a"antigenicdeterninantweresynthesizedandinsertedintoaforeignepitopepresentingcarrierI3site(FHVRNA2cDNAI3).HBVepitopewasexpressedinaprokaryoticcellularsystem(BL21cell).TheexpressionproductwasanalyzedanditsantigenicitywasfurtherstudiedbyELISAandWsternblotmethodwithchimericproteinascoatingantigen.weusedchimericproteinascoatingantigentotestantiHBswithELISAandWsternblotin58seralsamples.ResultsThechimericproteinreactedwithantiHBsseralspecially.ThedetectionpositiveratioofantiHBsis77.5%and68%respectivelybyELISAandWsternblotwithchimericproteinascoatingantigen,thecontrol''''swas62%.ConclusionHBVepitopeexpressedinaforeignepitopepresentingcarrierpossessedgoodantigenicityanddiagnosticvalue.

Keywords：HBV；Epitope；Antigenicity；FHVRNA2carriersystem

乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原體，并引起慢性肝炎和肝硬化，而且與肝癌的發生密切相關。迄今，對HBV感染最有力的預防和控制措施，仍是發展疫苗。FHVRNA2載體系統［1］是一個以昆蟲小RNA病毒flockhousevirus外殼蛋白為載體的新型抗原表位表達載體，此系統中表達的載體蛋白可自動組裝成病毒樣顆粒，使插入的外源抗原表位可以暴露在顆粒的表面，保持天然構象和免疫學特性。本研究擬將HBVa抗原表位插入到FHV外殼蛋白上，并對其抗原性及診斷意義進行了研究。

1材料與方法

1.1細胞重組質粒DNA大腸桿菌DH5α用于重組質粒pETEDNA的克隆和擴增。大腸桿菌BL21(DE3)用于重組質粒pETEDNA的表達。質粒DNA在含200μg/ml氨芐青霉素的LB或TB培育中生長，FHVRNA2載體系統即重組pETFHV構建見［1］。

1.2HBV抗原表位及重組pETE的構建和表達

1.2.1HBV抗原表位及重組pETE的構建人工合成HBV特異抗原表位E(氨基酸序列：124CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC147)寡核苷酸序列：正向5’GATGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGC3’；反向3’CTACGTGCTGAGGACGAGTTCCGTTGAGATACAAAGGGAGTACAACGACATGTTTTGGATGCCTACCTTTAACG5’，兩端為Bsu36I識別位點，與經Bsu36I作用后的重組pETFHVDNA混勻后置室溫連接2h,轉化DH5α細胞，接種LB平板(200μg/mlAmp)培養。重組質粒pETEDNA經酶切篩選并經DNA序列測定。

1.2.2攜帶HBV抗原表位的嵌和蛋白的表達重組pET系統中，嵌和蛋白的表達受T7啟動子的控制［2］。BL21經重組pETEDNA轉化后，在TB培養液中37℃生長16h～18h,細胞經4000r/10min離心沉淀,用超聲裂解緩沖液懸浮，超聲裂解，裂解液經離心，棄上清，沉淀(包涵體)用8mol/L尿素溶解。

1.2.3SDSPAGE及Westernblot分析方法見前文［1，3］，3，3二氨基苯胺四氫鹽酸(DAB)底物試劑為AMRESCO公司產品;第二抗體辣根過氧化物酶(HRP)結合物購自華美公司。

1.3HBV重組抗原表位診斷意義評價

1.3.1ELISA檢測血清樣本固相ELISA檢測如前文所述［1］，以純化的嵌和蛋白為包被抗原，每孔100μl(含1μg純化嵌和蛋白)，檢測58份乙肝患者血清中抗HBs，與抗HBsELISA檢測試劑檢測結果比較。陽性判斷標準為(檢測血清A492底物對照A值)/(陰性血清A492底物對照A值)>2.1。鄰苯二胺二氫鹽酸(OPD)購自AMRESCO公司；第二抗體辣根過氧化物酶(HRP)結合物購自華美公司；乙肝患者血清由昆明市傳染病醫院收集;抗HBsELISA檢測試劑盒購自上海科華公司。

1.3.2HBV重組抗原表位Westernblot檢測血清樣本方法見前文［3］，檢測了58份乙肝患者血清樣本。

2結果

2.1攜帶HBV抗原表位的嵌和蛋白的表達FHVRNA2cDNA載體系統即重組pETFHV構建見文獻［4］，其編碼產物是FHV外殼蛋白，三維立體結構已得到精確測定，其上有6個可供外源抗原表位插入的位點［5］(見圖1)。應用該系統，我們將人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重組pETFHVDNA上，構建攜帶HBV抗原表位的重組質粒pETE，經NsiⅠ和NcoⅠ雙酶切篩選(見圖2)和DNA序列測定無誤后轉化BL21細胞，高水平表達嵌和蛋白。經SDSPAGE和考馬斯亮藍染色(見圖3)和Westernblot(見圖4)分析結果表明，這些嵌和蛋白為攜帶有HBV抗原表位的重組FHV外殼蛋白。

圖1FHV外殼蛋白的三維結構：示可供選擇的外源抗原表位序列插入位點L1、L2、L3、I1、I2，I3HBV抗原表位氨基酸序列在FHV中插入位點。（略）

圖2重組質粒NcoⅠ+NsiⅠ酶切圖（略）

2.2攜帶HBV重組抗原表位的嵌和蛋白在BL21中的表達與鑒定攜帶HBV抗原表位的重組質粒pETFHVE在BL21(DE3)轉化細胞中高水平表達了攜帶HBV抗原表位的嵌合蛋白FHVE,其分子質量與陽性對照相同，約為45000(等于載體FHV外殼蛋白的分子質量43000加上HBV抗原表位的分子質量)。經SDSPAGE和考馬斯亮藍染色(見圖3)及Westernblot(見圖4)分析結果表明，重組抗原表位顯示了抗原性。

圖3攜帶HBVa特異抗原表位的嵌合蛋白SDSPAGE(10%)分析（略）

圖4嵌合蛋白的Westernblot分析（略）

2.3HBV重組抗原表位ELISA檢測敏感性分析我們用嵌和蛋白為包被抗原用間接ELISA法檢測58份乙肝患者血清中抗HBs抗體，檢測陽性率為77.5%，高于ELISA試劑盒檢測的62%。

2.4HBV重組抗原表位Westernblot以嵌和蛋白為包被抗原用Westernblot檢測58份乙肝患者血清中抗HBs抗體，檢出陽性率為68%。

3討論

3.1HBVa抗原表位在疫苗及診斷應用研究中的意義根據HBsAgS蛋白的抗原性不同，將HBV分為9個血清型(即HBsAg亞型)［6，7］：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-、adrq+。HBVS蛋白第120～第160氨基酸序列是HBV的交叉中和抗原表位即a表位［8］，可誘導產生交叉中和抗體，保護成人免受各HBV亞型的感染。本研究進一步表明，HBVa重組抗原表位可與臨床不同來源的血清抗HBs發生特異性結合，具有疫苗研究和診斷意義。

3.2新型抗原表位表達載體系統對于抗原表位來說，決定其免疫原性和抗原性的因素除了氨基酸序列，更重要的是分子的空間構象和呈遞給免疫細胞識別的方式。利用FHVRNA2表達載體在大腸桿菌中表達的抗原表位具有良好的免疫原性，免疫小鼠產生了交叉中和抗體［9］，并已成功的在該系統中表達了HIV1V3、輪狀病毒Vp4抗原表位和HCV抗原表位，并誘導中和抗體和交叉中和體產生［1，10，11］。HBV抗原表位在FHVRNA2載體系統可中高效地表達，并近似天然構象，能被天然抗HBs抗體特異性識別結合，具有良好的抗原性，在以其為包被抗原用ELISA和Weternblot檢測抗HBs中檢測敏感性與ELISA診斷試劑盒差異無顯著性，在HBV診斷試劑和重組抗原表位亞單位疫苗研究中具有重要意義。

參考文獻：

［1］ScodellerEA，TisminetzkySG，PorroF，etal.AnewepitopepresentingsystemdisplayaHIV1V3loopsequencesandinducesneutralizingantibodies［J］.Vaccine,1995，13:12331239.

［2］RosenbergAH,LadeBN,ChuD，etal.VectorsforselectiveexpressionofclonedDNAsbyT7polymerase［J］.Gene,1987，56:125135.

［3］TowbinH，StaehelinT，GordenJ，etal.Electrophoretictransferofproteinfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets：procedureandsomeapplication.Proc.Natl.Acad.Sci［J］.USA，1979，76：43504353.

［4］TisminetzekySG，ScodellerEA，EvangelistiP，etal.ImmunoreactivityofchimericproteincarryingtheHIV1epitopeIGPGRAF，correlationbetweenpredictedconformationandantigenicity［J］.FEBSLetters，1994，353：14.

［5］FisherAJandJohnsonJE.OrderedduplexRNAcontrolsthecapsidarchitectureofanicosahedralanimalvirus［J］.Nature,1993,361:176179.

［6］MagniusLO，etal.AnewvirusspecifieddeterminantofhepatitisBsurfaceantigen［J］.ActaPatholMicrobiolScan,1975，83B:295297.

［7］WandsJR，etal.HepatitisBviralantigenicstructure:signatureanalysisbymonoclonalradioimmunoassays［J］.ProcNatlAcadSciUSA,1984，81:22372241.

［8］MoynihanJS，DmelloFI，etal.48mersyntheticpptideanalogueofthehepatitisBvirus"a"determinantinducesanantiHBsantibodiesresponseafterasingleinjection［J］.JMedVirol,2000，62:159166.

［9］TisminetzekySG.FEBSLetters,1994，353:14.

［10］陳元鼎.劉名英，鄒永健，等.表達輪狀病毒SA11株Vp4的抗原表位誘導病毒中和抗體生成［J］.中國病毒學，1997，12：125131.

［11］PengM.DaiCB.ChenYD.ExpressionandimmunoreactivityofanepitopeofHCVinaforeignepitopepresentingsystem［J］.WorldJGastroenterol.2005，11(22):33633367.