導語：人乳頭瘤病毒E6E7基因重組腺病毒的構建及鑒定一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關鍵詞】人類乳頭狀瘤病毒,人；腺病毒科

ConstructionandidentificationofrecombinantadenovirusescarryingHPV16e6e7

【Abstract】AIM:Toconstructthereplicationdeficientrecombinantadenovirusescarryinghumanpapillomavirus16（HPV16）E6E7andidentifythevectorwithWesternBlot.METHODS:TheHPV16E6E7genefragmentwasobtainedfromtheplasmidpET32a（+）E6E7byamplificationanddigestion,andtheshuttleplasmidpAdTrackCMVE6E7inwhichtheE6E7wasinsertedintothedownstreamofCMVpromoterwasestablishedbyligation.ThenthelinearizedshuttleplasmidwascotransformedintoBJ5183bacteriawithbackbonevectorAdEasy1toobtaintherecombinantadenoviralplasmidpAdE6E7byhomologousrecombination.TherecombinedadenovirusDNAwastransfectedinto293cellsforpackingandtheamplificationproductofreplicationdeficientAdE6E7viruswaspurifiedbyCsCldensitygradientcentrifugation.TheexpressionofE6E7wasverifiedbyWesternBlotin293cellafterinfectedwithAdE6E7.RESULTS:TherecombinantplasmidpAdE6E7wasestablishedbyhomologousrecombinationandconfirmedbyrestrictionendonucleasedigestionandsequencing.GFPexpressioncouldbeobserved3dafterpackingofthelinearizedpAdE6E7in293cellsand6.9×1010pfu/LtiterofAdE6E7wasobtainedbyCsClgradientpurification.The293cellwasinfectedwiththistiterofAdE6E7viruses,andthentotalproteinin293cellswasextracted.WesternBlotshowedthatE6E7proteinwasexpressedobviously.CONCLUSION:AdE6E7expressingbothGFPandE6E7simultaneouslycanbesimplyandrapidlygeneratedbyusingtheAdEasysystem.

【Keywords】papillomavirus,human;adenoviridae

【摘要】目的：利用AdEasy系統構建人乳頭瘤16(HPV16)E6E7基因重組腺病毒，并通過WesternBlot方法檢測E6E7蛋白的表達.方法：將質粒pET32a（+）E6E7擴增、酶切獲得E6E7片段插入腺病毒穿梭載體質粒pAdTrackCMV的巨細胞病毒（CMV）啟動子下游，構建重組穿梭載體pAdTrackCMVE6E7，線性化后與骨架載體AdEasy1在細菌BJ5183內同源重組得到腺病毒質粒pAdE6E7，經人胚腎293細胞包裝后得到復制缺陷型重組腺病毒AdE6E7；用包裝后的病毒上清再次感染293細胞，提取細胞中的蛋白，通過WesternBlot方法檢測E6E7蛋白的表達.結果：連接、重組后通過酶切和測序法篩選出pAdE6E7；經人胚腎293細胞包裝，3d后觀察到綠色熒光蛋白（GFP）明顯表達，氯化銫梯度離心純化最終獲得6.9×1010pfu/L滴度的重組病毒；用該滴度的AdE6E7重新感染人胚腎293細胞3d后，提取細胞蛋白,WesternBlot檢測,E6E7有明顯表達.結論：利用新型腺病毒載體AdEasy系統可在短期內制備同時表達GFP和E6E7的重組腺病毒AdE6E7.

【關鍵詞】人類乳頭狀瘤病毒，人；腺病毒科

0引言

高危型人類乳頭瘤狀病毒（HPV16,18）與宮頸癌的發病密切相關［1］.HPV編碼了多種癌蛋白（E1,E5,E6,E7等）其中以E6,E7為主，他們都能誘導細胞永生化，引起細胞的永生.復制缺陷型重組腺病毒(replicationdeficientrecombinantadenovirus)是目前基因治療最常用的載體之一［2］，我們利用AdEasy系統構建了外源插入HPV16E6E7片段的復制缺陷性腺病毒AdE6E7，并觀察了AdE6E7感染293細胞，為研究HPV16E6E7在女性宮頸癌中的作用提供新的手段.

1材料和方法

1.1材料穿梭質粒pAdTrackCMV，骨架質粒pAdEasy1，僅插入GFP的對照重組腺病毒質粒pAdGFP，大腸桿菌BJ5183由重慶醫科大學肝病研究所惠贈；293細胞、E.coli,DH5a由本實驗室保存.pET32a（+）E6E7載體已構建成功.PmeⅠ,PacⅠ限制性內切酶購自基因公司；BglⅡ,HindⅢ限制性內切酶、連接試劑盒、DNA小量膠回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒均為大連寶生物工程有限公司產品；LipofectaminTM2000脂質體轉染試劑盒購自Roche公司，DMEM培養基及胎牛血清購自Hyclon公司；蛋白Marker購自Tiangene公司；驢抗鼠的E6單克隆抗體購自SantaCruz公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠的E6二抗及DAB顯色系統購自北京中山公司.

1.2方法BglⅡ和HindⅢ分別雙酶切腺病毒穿梭質粒pAdTrackCMV和pET32a（+）E6E7，凝膠回收E6E7片段和線性化的pAdTrackCMV，連接（16℃,8h），轉化DH5a感受態細菌，在卡那酶素抗性的LB平板上培養過夜，挑選轉化的菌落，提取質粒，BglⅡ和HindⅢ雙酶切鑒定陽性克隆，同時送上海生物工程公司測序分析.提取pAdtrackCMVE6E7質粒，取1μg用PmeⅠ線性化，膠回收線性化的pAdtrackCMVE6E7質粒，轉化到含有腺病毒基因組質粒AdEasy的BJ5183感受態細胞中［3］，在卡那酶素抗性的LB平板上培養16～24h，挑選較小的菌落培養，抽提質粒，瓊脂糖凝膠電泳初篩重組體，再用PacⅠ酶切鑒定.PacⅠ線性化AdE6E7，乙醇、醋酸鈉沉淀，700mL/L乙醇漂洗后重新溶解在20μL滅菌的去離子水中.配制A液（質粒DNA4μg+無血清DMEM至250μL）和B液（10μLLipofectaminTM2000以無血清DMEM稀釋至250μL），A，B混合，37℃反應2h.PBS漂洗細胞后每孔加入2mL無血清培養液，將混合物輕傾于培養孔中輕輕混合，繼續培養8h后更新完全培養基，直至90%以上293細胞出現病變（cytopathiceffect,CPE）.收集上清繼續感染293細胞以擴增病毒.用氯化銫密度梯度離心法純化重組重組腺病毒AdE6E7.收集后的病毒層，0.22μm無菌過濾后小份分裝，-80℃保存.Trizol試劑提取重組腺病毒感染293細胞和未感染293細胞的RNA取1μg細胞總RNA進行逆轉錄反應，總反應體積為50μL,37℃反應1h,95℃5min，滅活逆轉錄酶.PCR擴增E6E7片段的上游引物PF:5＇cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物PR:5＇cgggatcccatggtagattatggtt3＇.反應條件：95℃變性5min,95℃30s,58℃30s,72℃1min，30個循環，72°C延伸10min.RIPA提取AdE6E7感染293細胞和未感染293細胞的總蛋白，變性后做SDSPAGE電泳，轉膜，條件為6V恒壓，3.5h.驢抗羊的E6單抗、HRP標記的二抗，雜交反應后DAB顯色.根據文獻［3］用已獲得的重組腺病毒感染HEK293細胞，得到擴增的病毒粗提液，將病毒粗提液進行對數稀釋，通過終點稀釋試驗計算病毒滴度.終點稀釋實驗中滴度計算公式：病毒滴度（pfu/L）=104（x+0.8），x為各行陽性率總和.

2結果

2.1腺病毒穿梭載體pAdtrackCMVE6E7的構建和鑒定用BglⅡ和HindⅢ分別雙酶切腺病毒穿梭質粒pAdTrackCMV,pET32a（+）E6E7和pAdtrackCMVE6E7質粒（圖1），可以獲得860bp的E6E7基因和8.9kb的pAdTrackCMV.

1:Marker:λHindⅢ;2:pAdTrackCMV/BglⅡ,HindⅢ;3:pET32E6E7/BglⅡ,HindⅢ;4:pAdTrackCMVE6E7/BglⅡ,HindⅢ;5:Marker:2000.

圖1腺病毒穿梭載體pAdtrackCMVE6E7鑒定（略）

2.2E6E7重組腺病毒基因組質粒的構建和鑒定同時將pAdtrackCMVE6E7質粒和pAdtrackCMV空質粒用PmeⅠ線性化后，轉化到含有AdEasy1的BJ5183感受態細菌中，與其內的AdEasy1進行同源重組.PacⅠ酶切后，可見4.5kb和23kb處各有1個條帶（圖2）.

1.3AdEasyE6E7重組腺病毒感染293細胞的鑒定脂質體包裹AdEasyE6E7同源重組腺病毒基因組質粒轉染293包裝細胞1~2d后，光鏡下可觀察到空斑形成，細胞變圓、腫脹、脫壁、細胞核變大等病變.熒光顯微鏡下觀察，重組腺病毒感染的293細胞和pAdtrackCMV感染的293細胞，在培養1～2d后有EGFP表達，并逐漸增多.AdEasyE6E7重組腺病毒感染的293細胞，RTPCR檢測顯示有1條860bp條帶，而pAdtrackCMV空載體感染的293細胞的相應位置無特異條帶（圖3）.AdEasyE6E7重組腺病毒感染的293細胞，用WesternBlot檢測顯示有1條能與E6單抗特異性結合的蛋白印跡條帶，而pAdtrackCMV空載體重組后的腺病毒AdEasyCMV感染的293細胞的相應位置無特異條帶（圖4）.經終點稀釋實驗測定得到重組復制缺陷型病毒滴度為6.9×1010pfu/L.

1:Marker:λHindⅢ;2:pAdTrackk14E6E7/BamHⅠ;3:重組后的pAdTrackCMVE6E7/PacⅠ;4:重組后的pAdTrackCMV.

圖2PacⅠ酶切鑒定AdEasyE6E7（略）

1:Marker:100bpDNAMarker;2:RTPCR產物:E6E7基因（860bp）;3:RTPCR陰性對照.

圖3RTPCR鑒定AdEasyE6E7轉染的293細胞中E6E7的表達（略）

1:E6E7;2:NOE6E7.

圖4WesternBlot鑒定AdEasyE6E7/AdEasyCMV（略）

3討論

目前基因治療中應用最廣泛的生物病毒載體有反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體和單純皰疹病毒載體，其中腺病毒的優于其他載體的特點［4-5］.腺病毒載體可轉導非分裂細胞，并在細胞培養物中有高滴度的重組病毒產量，最后腺病毒載體進入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，因而安全性較高.已被美國FDA批準作為基因治療載體應用于臨床實驗.

我們先將AdEasy1骨架載體轉化到用CaCl2制備的BJ5183感受態中，然后再將線性化的pAdtrackCMVE6E7轉化進含有AdEasy1的BJ5183制成感受態，同源重組［6-7］.已轉化了AdEasy1質粒的BJ5183細胞更方便進行細菌內同源重組，免去了在真核細胞內重組篩選復雜、費時的缺點.為了驗證重組腺病毒是否帶有目的基因E6E7，進行了如下鑒定：對pAdtrackCMVE6E7質粒酶切和測序，結果證明目的基因E6E7正確插入到穿梭載體；pAdtrackCMVE6E7經PacⅠ酶切后，可見4.5kb和23kb兩條帶，說明重組成功；構建腺病毒載體的穿梭質粒pAdtrackCMV中的構建元件已插入EGFP表達盒，重組腺病毒轉染293細胞后，通過熒光顯微鏡觀察，可見293細胞有綠色熒光蛋白表達，并逐漸出現生長停止和空斑形成，證明AdEasyE6E7已包裝入293細胞；通過RTPCR和Westernblot方法證明了AdEasyE6E7轉染293細胞后有E6E7核酸和蛋白的表達.這個載體的構建對于進一步研究HPV16E6E7體內、體外基因治療實驗奠定了基礎.

【參考文獻】

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