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關鍵詞】應激；水浸束縛；頜下腺；瘦素；大鼠

Effectofwaterimmersionrestraintstresssonleptinexpressioninsubmandibularglandofrats

【Abstract】AIM:Toobservethechangesofleptinexpressioninsubmandibularglandofratsfollowingwaterimmersionrestraintstressandtoexploretheeffectsandsignificanceofstressresponseonleptinsecretioninsubmandibulargland.METHODS:TwentySpragueDawleyratsweredividedintowaterimmersionrestraintstress(WRS)group(n=10)andnormalcontrolgroup(n=10).Localizationanddistributionofleptininratsubmandibularglandwereobservedbyimmunohistochemistry,andtheconcentrationsofleptininserumandsubmandibularglandweredeterminedbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).RESULTS：Leptinimmunoreactivecellsweremainlylocatedintheepithelialcellsofthegranularconvolutedandstriatedducts.Theimmunocomplexesweredistributedintheepithelialcytoplasmoftheductsbutnotinthenuclei.Thestainingintensityforleptininthegranularconvolutedductwasmuchhigherthanthatinstriatedduct.TheleptinstainingintheductsofsubmandibularglandinWRSgroupwasdenserthanthatinnormalcontrolgroup.Theconcentrationsofleptininbothserumandsubmandibularglandwereincreasedmarkedlycomparedwiththatinnormalcontrolgroup(P<0.01).CONCLUSION:Leptiniswidelyexpressedintheepithelialcellsofthegranularconvolutedandstriatedductsoftheratsubmandibulargland.WRScanleadtotheenhancedexpressionofleptininratsubmandibulargland,andtheseresultssuggestedthatleptininsubmandibularglandmightbeinvolvedintheregulationofstressresponseprocess.

【Keywords】stress;waterimmersionrestraint;submandibulargland;leptin;rat

【摘要】目的：觀察應激狀態下大鼠頜下腺內瘦素表達的變化，探討應激反應對頜下腺瘦素分泌的影響及其意義.方法：采用水浸束縛應激（WRS）方法，將20只SD大鼠隨機均分為WRS組(n=10)和對照組(n=10)，用免疫組織化學方法觀察大鼠頜下腺內瘦素的定位與分布；用ELISA法檢測兩組大鼠血清和頜下腺組織中瘦素水平.結果：瘦素免疫反應陽性細胞主要定位于頜下腺導管的顆粒曲管和紋狀管，腺泡細胞為陰性，其中顆粒曲管上皮細胞呈強陽性反應.WRS組大鼠頜下腺導管上皮細胞瘦素免疫反應細胞的染色強度高于對照組.與對照組相比，WRS組大鼠血清和頜下腺中瘦素水平均顯著升高（P<0.01）.結論：瘦素表達于大鼠頜下腺導管上皮細胞；水浸束縛應激可致大鼠血清和頜下腺中瘦素濃度增加，頜下腺內瘦素可能參與應激反應過程的調節.

【關鍵詞】應激；水浸束縛；頜下腺；瘦素；大鼠

0引言

瘦素（leptin）是一種由肥胖基因編碼的多肽產物被首次發現［1］.瘦素具有廣泛的生物學效應，是一種調節體內脂肪貯存量、能量代謝及維持恒定體重的［2］,在脂肪、胃等多種組織與血液中維持一定的平衡，在機體處于應激、創傷等因素刺激下，血液中瘦素水平發生顯著變化，參與攝食行為、脂肪代謝和ATP合成等過程.近年的研究發現，人和哺乳類動物唾液腺內有瘦素及其受體表達［3-5］.應激刺激條件下頜下腺內瘦素水平有無變化、其是否參與應激反應過程的調節等問題至今未見研究報道.本研究采用免疫組織化學方法觀察瘦素在大鼠頜下腺的定位與分布；并應用ELISA技術檢測水浸束縛應激條件下大鼠血清及頜下腺組織中瘦素水平的變化，以期為深入研究頜下腺內瘦素在應激反應中的調節作用提供實驗資料.

1材料和方法

1.1材料健康SD大鼠2只，鼠齡為13wk，體質量200~250g，隨機均分為WRS(waterimmersionrestraint)組（n=10）和正常對照組（n=10）.采用水浸束縛應激模型［4］.乙醚麻醉下將大鼠四肢固定于特制的木板上，待動物清醒后，置于高約30cm的方形塑料桶內，桶內加入溫度為21±1℃的冷水，使水面至大鼠的胸骨劍突，經10h后，即可成功誘發WRS模型.正常對照組不做任何處理.動物飼養與實驗過程均遵守實驗動物飼養與使用的規定進行.將兩組大鼠在烏拉坦（1.2g/kg）腹腔麻醉下，剖開胸腔，暴露心臟，用5mL注射器心內取血2mL于4℃靜置2h，離心（7000r/min）20min取上清，-20℃保存備用.然后從頸部取出雙側頜下腺組織，一側頜下腺于-70℃保存、留待ELISA檢測；另一側頜下腺組織入Bouins液固定24h后，常規脫水、石蠟包埋、制成厚5μm切片，分別裱貼于預先用APES(3aminopropyltriethoxysilane,Sigma公司)處理過的載玻片上，于37℃恒溫箱烤干備用.

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色兔抗瘦素多克隆抗體購自武漢博士德公司（Boster）；生物素標記的羊抗兔IgG以及ABC試劑盒均購自Sigma公司.根據免疫組化ABC染色程序，取制備好的石蠟切片入二甲苯脫蠟10min×2次，無水乙醇漂洗5min×2次.新鮮甲醇配制的3g/L(V/V)雙氧水漂洗30min，以消除內源性過氧化物酶.0.01mol/LPBS(pH7.3)漂洗5min×3次.用15g/L(V/V)正常羊血清封閉30min；甩去正常羊血清后，滴加第一抗體兔抗瘦素（1∶200），4℃冰箱內孵育過夜；PBS漂洗5min×3次，滴加生物素標記的羊抗兔IgG(1∶400)，室溫2h；PBS漂洗5min×3次，滴加ABC復合物1h(1∶200)；PBS漂洗5min×3次，DABH2O2顯色8~15min；常規脫水、透明、DPX封片.用正常兔血清替代瘦素抗體作為第一抗體進行染色作為陰性對照實驗.

1.2.4頜下腺及血清中瘦素的檢測瘦素ELISA試劑盒購自武漢博士德公司（Boster），具體操作步驟按試劑盒說明書進行.取凍存的頜下腺組織、稱重，用2mL勻漿器勻漿（加1mLPBS）.組織勻漿液用樣品稀釋液稀釋5倍，將預先配置好的標準品和樣品各0.1mL加入酶標板孔內，室溫孵育5h；甩去酶標板內液體、不洗，每孔滴加生物素化抗瘦素抗體工作液0.1mL，37℃反應1h；0.01mol/LPBS洗滌3min×3次；ABC工作液每孔0.1mL（TMB空白顯色孔除外），37℃反應1h，0.01mol/LPBS洗滌5min×3次；TMB顯色液每孔90μL，37℃避光反應25min；TMB終止液每孔0.1mL終止顯色.酶標儀在450nm測定A值，繪制標準曲線，計算各樣品濃度.血清內瘦素測定同法進行.

統計學處理：實驗數據以x±s表示，兩組間用t檢驗進行分析，P<.05認為有統計學意義.

2結果

2.1瘦素在大鼠頜下腺的定位與分布大鼠頜下腺組織的實質由腺泡和導管組成，其中紋狀管和顆粒曲管（GCT）是導管的主要部分.瘦素在正常及WRS大鼠頜下腺組織均有表達，免疫反應產物呈棕褐色顆粒狀，定位于導管上皮細胞的胞漿和胞膜、細胞核未見陽性物質沉著，對比明顯，背景清晰.WRS組與正常對照組大鼠頜下腺內瘦素免疫反應陽性細胞的分布基本一致，它們均位于頜下腺導管的紋狀管和顆粒曲管，其中顆粒曲管上皮細胞呈強陽性反應、紋狀管上皮細胞呈中等陽性反應.WRS組大鼠頜下腺導管上皮細胞瘦素免疫反應細胞的染色強度高于對照組（圖1A,B），正常兔血清替代一抗的陰性對照切片未見特異性著色.

A：對照組；B：WRS組

圖1大鼠頜下腺內瘦素免疫反應陽性細胞的定位與分布×200（略）

2.2水浸束縛應激對大鼠血清和頜下腺組織中瘦素表達的影響WRS大鼠血清和頜下腺組織中瘦素濃度均顯著高于對照組（P<0.01，表1）.

表1水浸束縛應激對大鼠血清和頜下腺組織中瘦素水平的影響（略）

aP<0.01vs對照.

3討論

頜下腺是三大唾液腺之一，屬外分泌腺，但隨著研究的深入，人們發現下頜下腺是具有外分泌和內分泌雙重功能的腺體，其內含有多種生物活性物質.大鼠頜下腺導管由閏管、顆粒曲管、紋狀管和小葉間導管組成，其中顆粒曲管粗長而彎曲，頜下腺分泌的生物活性物質主要定位于顆粒曲管細胞內.迄今已在大鼠頜下腺內發現和分離出30多種生物活性肽.彭彥霄等［5］首先觀察了大鼠頜下腺內瘦素的定位與分布，發現瘦素免疫反應陽性細胞主要分布于導管中的紋狀管和顆粒曲管.本研究進一步證實了上述結果，并發現WRS時頜下腺導管上皮瘦素免疫染色強度增加.有研究者在健康人唾液涂片中亦發現有瘦素陽性微粒，表明成人下頜下腺具有分泌瘦素的功能，其分泌途徑為外分泌方式.瘦素隨唾液進入消化道后，與消化道的瘦素受體結合，可促進胃腸粘膜分泌、增強胃動力、促進小腸吸收、促進粘膜細胞增生和粘膜修復等.應激是有害或過強刺激引起的機體非特異性反應，應激可致體內多種內分泌激素水平和代謝活動的改變.傳統觀點認為，應激效應的機理是由于交感神經興奮和下丘腦－垂體－腎上腺軸功能活動的增強.近年來的研究發現，腦－腸肽也參與了應激過程的調控.有關瘦素在應激反應的作用已有一些研究報道.手術創傷應激可導致患者血清瘦素濃度持續升高，并且與C反應蛋白和ACTH水平的變化無相關性，因而推測瘦素可能作為一種獨立因素影響創傷應激的病理生理過程［6］.Konishi等［7］的研究亦證明，水浸束縛應激大鼠血清瘦素水平顯著升高，應激刺激開始后9h達高峰；而胃內瘦素在應激開始后6h和9h時顯著下降，脂肪組織中瘦素水平在應激開始后3h顯著升高.這說明WRS后血清瘦素水平變化與胃和脂肪組織內瘦素分泌有關，瘦素水平瘦應激事件的調節.而本研究結果證明，水浸束縛應激大鼠血清和頜下腺組織中瘦素濃度均顯著增高，從而提示應激狀刺激可影響頜下腺內瘦素的分泌，多種組織分泌的瘦素進入血循環，進而影響應激反應的進程和結果.

關于應激刺激下頜下腺內瘦素分泌增加的意義，我們推測可能與應激過程中下列因素有關.首先，瘦素促進脂肪進入高分解狀態，使ATP生成增加；其次，瘦素促進細胞損傷的修復和增殖，有利于減少應激組織細胞損傷；第三，瘦素可降低非特異性炎癥反應，因而應激時瘦素升高是機體的一種保護機制.

本研究通過對應激狀態下大鼠頜下腺組織中瘦素表達的檢測，發現瘦素可能在應激引起機體內分泌和代謝紊亂中發揮重要作用.進一步探討應激條件下頜下腺內瘦素與其它經典腦腸肽之間的相互作用，將有助于闡明應激導致消化道內分泌功能紊亂的機制.

【參考文獻】

［1］ZhangY,ProencaR,MaffeiM,etal.Positionalcloningofthemouseobesegeneanditshumanhomologue［J］.Nature,1994,372(6505):425-432.

［2］MollerN,O''''BrienP,NairKS.Disruptionoftherelationshipbetweenfatcontentandleptinlevelswithaginginhumans［J］.JClinEndocrinolMetab,1998,83(3):931-934.

［3］DeMatteisR,PuxedduR,RivaA,etal.Intralobularductsofhumanmajorsalivaryglandscontainleptinanditsreceptor［J］.JAnat,2002,201:363-370.

［4］BohlenderJ,RauhM,ZenkJ,etal.Differentialdistributionandexpressionofleptinandthefunctionalleptinreceptorinmajorsalivaryglandofhumans［J］.JAnat,2002,201:363-370.

［5］彭彥霄,伍雪芳,王惠珠，等.瘦素及其受體在大鼠下頜下腺的定位研究［J］.解剖學報，2004,35(6):640-642.

［6］顏光濤,郝秀華,薛輝，等.血清瘦素在手術創傷后應激反應中的變化［J］.中國危重病急救醫學.2006,18(3):172-175.

［7］KonishiN,OtakM,OdashimaM,etal.Systemstressincreasesserumleptinlevel［J］.JGastroenterolHepatol，2006,21(7):1099-1102.