導語：醫學生社會實踐論文：大腸癌中VHL mRNA，FIH一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關鍵詞】結直腸腫瘤；低氧誘導因子1α；VHL基因；缺氧誘導因子抑制因子1

EffectofVHLmrnaandfih1mRNAexpressionsincolorectalcarcinomaonHIF1αproteinlevel

【Abstract】AIM:TodetectmRNAexpressionsofVHLandFIH1incolorectalcancer,andexploretheireffectonHIF1αproteinlevel.METHODS:SemiquantitativeRTPCRassaywasusedtodetecttheexpressionsofVHLmRNA,FIH1mRNAin42patientswithcolorectalcancer;ExpressionofHIF1αproteinwasmeasuredbySPimmunohistochemistry;Spearmanrankcorrelationwasusedtoanalyzethecorrelationbetweenthem.RESULTS:mRNAlevelsofVHLandFIH1incolorectalcancerweresignificantlylowerthanthoseinadjacenttissue（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；BothexpressionsdecreasedasDukesstageincreased,andtheexpressionsinDukesA+BstageweresignificantlyhigherthanthoseinDukesC+Dstage（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；Theirexpressionshadnorelationshipwithtumorlocationandgender.In42casesofcolorectalcancer,positiverateofHIF1αproteinwas69.1%(29/42),theexpressioninDukesC+Dstage(80.0%,24/30)wassignificantlyhigherthanthatinDukesA+Bstage(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02);itwasnegativeinadjacenttissue;SpearmanrankcorrelationdisplayedthattheexpressionsofVHLmRNAandFIH1mRNAwerenegativelycorrelatedwiththeHIF1αproteinlevel(rs=-0.97,P=0.01;rs=-0.66,P=0.01).CONCLUSION:TheoverexpressionofHIF1αmayplayanimportantroleinthedevelopmentandmatastasisofcolorectalcancer；ThedecreaseofVHLmRNAandFIH1mRNAexpressionsiscloselycorrelatedwiththeincreaseofHIF1αproteinlevelincolorectalcancer.

【Keywords】colorectalneoplasms;HIF1α;VHL;FIH1

【摘要】目的：檢測大腸癌中VHLmRNA，FIH1mRNA以及HIF1α蛋白的表達,探討VHL，FIH1對HIF1α蛋白水平的影響.方法：采用RTPCR技術檢測42例大腸癌組織和相應的癌旁正常粘膜組織中VHLmRNA，FIH1mRNA的表達，采用免疫組化SP法檢測HIF1α蛋白在大腸癌和癌旁正常組織中的表達，Spearman相關關系檢驗分析其之間的相關性.結果：大腸癌組織VHLmRNA和FIH1mRNA的表達水平顯著低于癌旁正常組織（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；二者的表達水平隨Dukes分期而降低，DukesA+B期顯著高于DukesC+D期（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；它們的表達水平與與腫瘤部位、性別無關.大腸癌組織HIF1α蛋白表達陽性率為69.1%(29/42),在癌旁正常組織中均為陰性；DukesC+D期(80.0%,24/30)顯著高于DukesA+B期(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02)；Spearman相關分析顯示，HIF1α表達水平與VHLmRNA，FIH1mRNA的表達水平顯著負相關（rs=-0.97,P=0.01，rs=-0.66,P=0.01）.結論：HIF1α的過表達在大腸癌的發生發展、浸潤轉移過程中起著重要作用，大腸癌組織中VHL以及FIH1的水平下降與HIF1α蛋白水平的升高之間存在密切相關.

【關鍵詞】結直腸腫瘤；低氧誘導因子1α；VHL基因；缺氧誘導因子抑制因子1

低氧誘導因子1（hypoxiainduciblefactor1，HIF1）在低氧狀態下通過對靶基因的轉錄激活，調控著血管發生、紅細胞生成以及糖酵解等過程［1］.希佩爾林道病(vonHippelLindau,VHL)希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白(proteinvonHippelLindau,pVHL)在依賴于氧的條件下作用于HIF1的α亞單位，促使其發生泛素化和蛋白酶體的降解［2］.低氧誘導因子1抑制因子(factorinhibitingHIF1,FIH1)能結合HIF1α并抑制其轉錄激活功能［3］.我們采用RTPCR法檢測了大腸癌組織和相應癌旁正常組織中VHLmRNA,FIH1mRNA的表達水平，同時采用免疫組化方法檢測HIF1α蛋白的表達，并進一步分析探討它們之間的相關性.

1材料和方法

1．1材料甘肅省人民醫院肛腸科200410/200504手術切除并經病理證實的新鮮大腸腺癌標本42(男27，女15)例，年齡31～76（中位56)歲.其中結腸癌7例，直腸癌35例.DukesA期5例，B期7例，C期18例，D期12例(有7例發生轉移),術前未做化放療.同時距腫瘤邊緣5～10cm以上切取正常組織作為自身對照.標本離體后5min內即投入液氮罐并轉至-80℃冰箱凍存.RNA提取試劑,飽和酚,100bpDNAladder購自上海生工;逆轉錄酶MMLV(RNaseH)，Taq酶，AgaroseGel，MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)，RNA酶抑制劑，瓊脂糖（Agarose）均購自大連寶生物公司;兔抗人HIF1α多克隆抗體購自武漢博士德公司;生物素鏈霉素抗生物素蛋白檢測系統(SP)試劑盒均購自福州邁新公司;根據從NCBI的Nucleotide數據庫中所查到VHL和FIH1mRNA序列，經計算機輔助設計引物，內參對照選用磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh).引物均由上海生工合成，使用濃度均50μmol/L(表1).

1．2方法

1．2.1VHL及FIH1的RTPCR檢測從-80℃冰箱中取出凍存的新鮮組織(癌及癌旁正常組織)200mg，采用Trizol法提取組織總RNA，測定總RNA濃度及純度.使用Takara的MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)反轉錄合成cDNA的第1鏈，接著合成第2鏈（均照說明書操作）.將所得30μL產物凍存于-20℃以備進行PCR.PCR反應體系50μL，包括10×Buffer5μL,25mmoldNTPmixture0.5μL,TaqDNA酶1μL，目的引物（VHL或FIH1）上下游各1μL，Gapdh引物上下游各1μL，cDNA模板1μL，無菌水38.5μL.反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s,退火30s(退火溫度VHL55℃,FIH158℃)，72℃延伸45s，30個循環；72℃10min后終止反應.PCR產物于20g/L的瓊脂糖凝膠做電泳,以無菌水代替cDNA模板的PCR管為陰性對照，天能凝膠成像系統對電泳條帶拍照并進行半定量分析.VHLmRNA,FIHmRNA相對表達量以同一反應體系中目的產物電泳條帶密度指數與內參對照Gapdh電泳條帶密度指數的比值來表示.

1.2.2HIF1α免疫組化染色取出凍存的新鮮標本迅速置于40g/L甲醛中固定，制成石蠟塊.先行HE染色確定,取標本無出血、壞死區域,組織厚度5μm連續切片,HIF1α稀釋度1∶50,SP法染色，用PBS液代替一抗作陰性對照.DAB作底物顯色,蘇木素復染核,梯度酒精脫水,二甲苯透明,樹脂膠封片,顯微鏡下觀察.HIF1α判斷標準按文獻［4］:陽性細胞胞核呈棕黃色顆粒著色,陰性(-)為腫瘤組織完全不著色或陽性細胞數<5%；陽性(+)為腫瘤組織陽性細胞數的范圍為5%～25%；陽性()為腫瘤組織陽性細胞數的范圍為>25%～50%；陽性()為腫瘤組織陽性細胞數>50%.

統計學處理:數據采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗.計數資料兩組率的比較采用四格表的校正卡方檢驗，RTPCR結果和免疫組化結果的相關性采用Spearman等級相關分析，按α=0.05的水準判斷是否具有統計學意義.

2結果

2．1RTPCRVHLmRNA在大腸癌組織中的表達水平為0.51±0.08，癌旁正常組織中的表達水平為0.63±0.11，配對t檢驗結果顯示差異有顯著性（t=-10.14,P=0.00）；FIH1mRNA在大腸癌組織中的表達水平為0.52±0.05，癌旁正常組織中的表達水平為0.60±0.14，配對t檢驗結果顯示差異有顯著性（t=-15.26,P=0.00）.VHLmRNA，FIH1mRNA表達水平與發病部位，性別，Dukes分期以及有無轉移等臨床病理資料之間有關(圖1,2,表2).表2大腸癌組織VHLmRNA與FIH1mRNA的表達與臨床病理的關系

2．2免疫組化染色癌旁正常組織HIF1α免疫組化染色均為陰性（圖3）；癌組織中29例（69.1%）HIF1α陽性(圖4)，其中(+)16例，()10例，()3例.HIF1α表達與Dukes分期明顯相關，DukesA+B期和DukesC+D期的陽性率分別為41.7%(5/12),80.0%(24/30),兩者差異具有顯著性(P<0.05).無轉移者HIF1α陽性率為65.7%(23/35),有轉移者陽性率為85.7%(6/7),兩者差異無統計學意義.

2．3VHLmRNA，FIH1mRNA表達與HIF1α蛋白水平的關系我們采用非參數檢驗的Spearman等級相關分析，結果顯示，大腸癌組織中HIF1α表達水平與VHLmRNA和FIH1mRNA的表達水平呈顯著負相關(rs=-0.97,P<0.01；rs=-0.66,P<0.01).圖3癌旁正常組織HIF1α的表達SP×400

3討論

HIF1是一個異二聚體，由對氧敏感的α亞單位(HIF1α或HIF2α)和組成性表達的β亞單位(HIF1β,也稱之為芳香烴受體核轉位分子，ARNT)構成［5］.HIF1調節通路的失調對于癌癥以及缺血性疾病的發生發展有著重要的影響作用［6］.VHL基因定位于染色體3p2526區域,包含3個外顯子，編碼由284個氨基酸殘基組成的pVHL［7］.FHI1基因定位于染色體10q24，它在生物工程信息數據庫國家中心的基因座ID為55662.此基因有8個外顯子，全長14kb，可以編碼一種特異性的天冬酰胺羥化酶，屬于2酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族［8］.我們用RTPCR法檢測了大腸癌和癌旁正常組織中VHLmRNA和FIH1mRNA的水平，同時用免疫組化法檢測了HIF1α蛋白在癌組織和癌旁正常組織中的表達.結果表明，VHLmRNA和FIH1mRNA在癌組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織；二者的表達水平隨Dukes分期而降低，DukesA+B期顯著高于DukesC+D期；FIH1mRNA在有轉移的病例中顯著低于無轉移的病例；它們的表達水平與與腫瘤部位、性別無關.而HIF1α蛋白表達在癌組織中總陽性率為69.1%(29/42),在癌旁正常組織中均為陰性；在DukesC+D期顯著高于DukesA+B期；HIF1α蛋白的表達在轉移的病例中高達85.7%(6/7)，而未轉移者為68.6%(23/35)，但卻無統計學意義，可能是樣本量過少的緣故.

Spearman等級相關分析顯示，HIF1α表達水平與VHLmRNA，FIH1mRNA的表達水平顯著負相關，這表明大腸癌組織中抑癌基因VHL以及FIH1的水平下降與HIF1α蛋白水平的升高之間存在密切相關.HIF1α的過表達在大腸癌的發生發展，浸潤轉移過程中起著重要作用，HIF1α高表達的癌組織具有較強的浸潤和轉移能力.提示HIF1α的表達可反映結直腸癌的生物學行為，可以作為判斷結直腸癌浸潤、轉移和預后的有價值指標.此外，低氧適應性反應在腫瘤發生發展中起著重要作用，而HIF1α是此過程中的樞紐環節，利用反義核酸抑制HIF1α的轉錄活性已經成為治療腫瘤的一個重要切入點［9-11］，隨著對VHL和FIH1作為HIF1α負性調節子功能的逐步闡明［12］，進一步探討聯合應用VHL基因治療和FIH1的擬似物，以降低HIF1α的表達和轉錄活性，抑制癌細胞的低氧適應反應，在防治大腸癌的發生發展，浸潤轉移方面將會有更廣闊的前景.

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