導語：二氮嗪對深低溫腦缺血再灌注大鼠腦組織NR1表達的影響一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的探討二氮嗪對深低溫缺血再灌注大鼠的腦保護作用及其機制。方法采用雙側頸總動脈阻斷法制作深低溫缺血再灌注大鼠模型，將306只SD大鼠隨機分成3組:假手術組、二氮嗪組和模型組。分別在缺血1h后再灌注2、6、12h及1、2、3、7d斷頭取腦，對腦組織行含水量檢測，并采用免疫組織化學技術檢測腦組織nr1表達情況。結果假手術組腦組織含水量明顯低于二氮嗪組和模型組，二氮嗪組低于模型組，模型組和二氮嗪組腦組織含水量在12h開始升高、1d達高峰、3d基本恢復正常，模型組和二氮嗪組NR1均在2h開始升高、1d達到高峰、7d后基本達到正常水平，但二氮嗪組NR1表達水平在2、6、12h及1、2d明顯低于模型組，且兩組NR1表達水平均高于假手術組。結論二氮嗪預處理對深低溫缺血再灌注大鼠具有腦保護作用，其作用機制可能是通過下調腦組織NR1的表達來實現。

【關鍵詞】深低溫;腦缺血再灌注;二氮嗪;腦保護;NR1表達;大鼠

腦缺血再灌注損傷及其機制十分復雜，至今尚不完全清楚。腦缺血再灌注損傷包括神經細胞壞死和凋亡兩個方面，其中線粒體ATP敏感性鉀通道被認為是關鍵環節之一［1］。二氮嗪是線粒體ATP依賴性鉀離子通道開放劑，已廣泛應用于缺血再灌注心肌保護方面的研究，而對腦保護方面的研究相對較少。N-甲基天冬氨酸受體（NMDAR）是目前研究最為深入的興奮性氨基酸（EAA）受體之一，是一種離子型EAA受體。目前已證實，NMDAR是由NR1、NR2A～2D5種亞單位組成的異聚體。其中NR1亞單位是NMDAR的功能單位，NR2是其調節單位，只有和NR1組合才表現出活性。NR1基因紊亂就會使NMDAR的活性喪失。EAA的毒性是通過受體活性改變而發揮作用，缺氧缺血能影響NMDAR的數量和功能，誘導和加強NR1的表達，上調NMDAR的數量?；谏鲜鲅芯勘尘?，本試驗主要采用腦缺血再灌注大鼠模型，觀察二氮嗪預處理對腦缺血再灌注損傷后腦含水量、形態學及NR1的表達變化來探討二氮嗪對深低溫缺血再灌注大鼠是否具有腦保護作用及其可能的機制。

1材料和方法

1.1實驗動物

成年健康SD大鼠306只，雌雄不限，體重200～250g，由南京市兒童醫院實驗動物中心提供。動物飼養與實驗均符合我國衛生部《醫學實驗動物管理實施細則（1998）》的要求。

1.2主要儀器與試劑

水合氯醛（南京市兒童醫院提供）、二氮嗪（美國Sigma公司）、NR1（SantaCruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫組化檢測試劑盒SA1022（武漢博士德公司）、DAB顯色劑（武漢博士德公司）、多聚賴氨酸（美國Sigma公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠）、熒光倒置顯微鏡（德國蔡司）、801圖像分析系統（江蘇捷達）。

1.3動物模型建立

用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉后固定大鼠四肢及頭部。剃除頸部及腹股溝處鼠毛，碘伏消毒皮膚，酒精脫碘后，縱行剪開頸部皮膚，從正中打開頸外肌層，分別向左右沿頸外斜肌間隙分離筋膜，找到頸總動脈，從伴行的神經旁游離出動脈并套上絲線，用紗布蓋好切口;用涂有石蠟油的溫度計插入肛門3cm，探測大鼠的體溫（通過對大鼠深部體溫檢測來估計腦部的溫度）。將鼠置冰盒并用冰塊袋包埋大鼠行物理降溫。當體溫降至21℃時停止降溫，用動脈夾阻斷兩側頸總動脈，使體溫維持在（21±1）℃，60min后恢復頸總動脈血流。用電吹風給大鼠復溫，每分鐘體溫恢復不超過0.5℃，大約在0.5h內將體溫恢復到32℃，再將大鼠放入35℃早產兒孵育箱復溫，在2h內將體溫恢復到37.5℃體溫，維持正常體溫4h后放置室溫下正常飼養。

1.4動物分組

①假手術組:102只，不夾閉左右頸總動脈，不注射藥物;②模型組:102只，術前腹腔內注射等體積生理鹽水;③二氮嗪組:102只，術前腹腔內注射二氮嗪5mg·kg-1。模型組和二氮嗪組再分為缺血60min再灌注后2、6、12h和1、2、3、7d共7個小組，假手術組分為術后2、6、12h和1、2、3、7d共7個小組，每個小組16只，其中6只用于腦組織含水量測定，10只用于石蠟包埋后行免疫組化檢測。

1.5腦組織含水量測定

待測含水量的腦組織標本測定其濕質量及在電熱恒溫干燥箱中100℃48h的干質量，以計算含水量。公式如下:含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.6腦組織中NMDAR1的表達情況

大鼠腦組織予多聚甲醛灌注、固定，完畢后斷頭取腦，腦組織采用4%多聚甲醛溶液再固定約24h，常規脫水石蠟包埋切片，厚度4μm，取4張連續切片，操作步驟按SABC試劑盒操作說明進行，陰性對照以PBS代替一抗。步驟如下:切片常規脫蠟，3%H2O2滅活內源性酶，熱修復抗原，5%BSA封閉，加入兔抗大鼠NMDAR1多克隆抗體（1∶100）4℃過夜，再滴加生物素化山羊抗兔IgG室溫保存20min，SABC室溫20min，滴加新鮮配置的DAB顯色液進行顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，中性樹膠封片后，光鏡下觀察。應用捷達801分析軟件測定陽性細胞的灰度值，每張切片隨機選擇4個高倍視野（400×）觀察并取其平均值，以灰度值來表示NR1的表達水平，灰度值越高，免疫組織化學染色越淺，NR1表達越低。

1.7統計學處理

所有實驗數據用x-±s表示，采用SPSS11.0統計軟件進行析因設計資料的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間均數之間比較采用SNK檢驗，相同時間點兩組間比較用t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠腦組織含水量

結果見表1。3組腦組織含水量在缺血再灌注后2、6h未見明顯區別，再灌注12h、1d時3組之間差異有統計學意義（P<0.01），模型組含水量明顯高于二氮嗪組和假手術組，二氮嗪組高于假手術組，2d時模型組和假手術組之間比較差異有統計學意義（P<0.01），二氮嗪組和假手術組間差異無統計學意義（P>0.05）。3d和7d3組間無統計學差異（P>0.05）。表13組大鼠缺血再灌注不同時間腦含水量比較（略）

2.2腦組織NR1的表達

模型組NR1在2h開始升高，1d達到高峰后下降，7d達到正常水平。二氮嗪組變化與模型組類似，但NR1表達水平低于模型組，假手術組NR1表達水平最低，3組各時間點（除7d外）均有統計學差異（P<0.05）。3組灰度值見表2（灰度值越高，表明NR1表達越低）。表2各組再灌注后NR1的表達情況比較（略）

3討論

ATP依賴性鉀通道（KATP）屬于內向整流型鉀通道，由完全不同的兩個亞單位構成，即內向整流亞單位Kir61x（Kir611和Kir612）和磺酰脲受體（SUR）兩種蛋白質構成［2］。KATP同時存在于細胞膜和線粒體膜上，是一種應激活化分子，缺氧、代謝毒物等均可將其激活，從而調節機體對外界刺激的適應性。其中線粒體ATP依賴性鉀通道（mitoKATP）被認為是組織缺血、缺氧保護的共同效應器［1］。mitoKATP的開放劑能有效地保護缺血再灌注損傷，是減輕缺血損傷和介導缺血預適應的主要機制［3］。mitoKATP開放劑二氮嗪原來僅被認為是一種作用于血管內膜鉀通道的血管擴張劑，臨床上主要用于治療高血壓。近年來mi-toKATP在腦缺血中的地位引起廣泛關注，本實驗研究發現，模型組腦組織含水量在12h及1d時間點明顯高于二氮嗪組和假手術組，而二氮嗪組高于假手術組，2d時腦含水量模型組高于假手術組，兩者之間有統計學意義（P<0.01），二氮嗪組和假手術組間未見區別，無統計學意義。其余各時間點未見差別。這說明了二氮嗪預處理對深低溫缺血再灌注大鼠具有腦保護作用。NR1是NMDAR的基本功能亞單位，NMDAR是興奮性神經遞質谷氨酸的離子型受體，生理狀態下，NMDAR的興奮對神經系統的發育、學習、記憶起著關鍵作用，但是在缺血缺氧時，它卻是谷氨酸神經毒性的主要通路。谷氨酸是腦內主要的興奮性氨基酸，但是在一定條件下，也具有神經毒性。缺血缺氧時谷氨酸通過直接和間接兩種途徑產生興奮毒性。目前已證實，缺血缺氧時谷氨酸的釋放增加，清除減少，突觸間隙的谷氨酸濃度迅速升高，激活NMDAR，產生興奮毒性。高國棟等［4］研究發現，二氮嗪預處理可抑制EAA的釋放，NMDA受體數量的增加可能反映著與受體結合的谷氨酸和（或）轉運體量的增加。Selkirk等［5］研究報道谷氨酸的過多釋放和中樞神經系統的發育畸變有關，它可以使其受體過度激活并產生興奮性毒性，谷氨酸轉運體的過度表達使小鼠海馬CA1區錐體細胞的易損性增加。本試驗同時檢測了各組NR1的表達水平，結果表明模型組NR1在2h開始升高，1d達到高峰后下降，7d達到正常水平。二氮嗪組變化與模型組類似，但NR1表達水平低于模型組，假手術組NR1表達水平最低，3組各時間點（除72h外）均有統計學差異（P<0.05）。由此推斷，二氮嗪發揮腦保護作用可能是通過下調NR1的表達水平來實現，這可能是其腦保護作用機制之一。認識到mitoKATP的存在已近10年，但有關檢測這種通道在完整細胞中活性的方法最近才發展起來。越來越多的證據表明mitoKATP的藥理學特征是獨特的，然而這方面的研究進展緩慢。最新研究表明，KATP通道在“缺血或缺氧預適應”所誘導的大腦自身保護機制中起關鍵作用［6-7］。因此，KATP通道開放劑作為腦保護劑將日趨成為研究熱點［8-9］。

mitoKATP開放劑二氮嗪預處理對缺血再灌注大鼠具有腦保護作用，是一種有潛力的腦保護藥物。明確其保護作用機制，可以為研制開發新型抗腦缺血藥物及其二氮嗪應用于臨床提供實驗依據。

【參考文獻】

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