導語：線栓法大腦中動脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注鼠模型的腦水腫和腦梗死比的變化一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關鍵詞】大腦中動脈閉塞；局灶性腦缺血/再灌注；腦水腫；

摘要：目的：探討短暫性右側大腦中動脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注模型的腦梗死比和腦水腫的變化。方法：線栓法制作大鼠腦缺血/再灌注不同時間點模型，行TTC染色測量腦梗死比及干濕稱重法測量腦含水量。結果：腦缺血再灌注6h時大鼠腦組織即有含水量的增加，并隨著時間的推移呈上升趨勢，且未損傷側中段腦組織含水量升高最為顯著。TTC染色在缺血再灌注6h即可見白色梗死灶，梗死比在再灌注72h內逐漸增加。結論：局灶性腦缺血再灌注72h內腦梗死比和腦水腫均呈進行性加重。

關鍵詞：大腦中動脈閉塞；局灶性腦缺血/再灌注；腦水腫；

腦梗死比缺血性腦損傷（ischemiabraininjury）是危及患者生命的疾病之一。而腦缺血及再灌注引起的腦水腫（hydrocephalus）是影響病人急性期與亞急性期生存的重要因素。較大面積的缺血因腦水腫致病變腦組織體積急劇增大，可誘發腦疝。缺血后的腦水腫被認為是加重腦缺血原有病變，導致腦疝及危及患者生命的主要原因［1~3］。另外，血腦屏障（bloodbrainbarrier,BBB）破壞也是缺血性中風繼發出血的原因，而這也是患者死亡的原因之一。目前缺血后BBB破壞引起血管源性腦水腫（vasogenicbrainedema,VBE）及其對缺血病變進展的影響尚未引起足夠的重視。本實驗旨在進一步明確局灶性腦缺血再灌注后腦水腫的時程變化，為臨床診治提供參考資料。

1材料與方法

11實驗動物與材料

SD大鼠56只（由武漢大學醫學院動物實驗中心提供），SPF級，雄性，體重280～320g。隨機分為空白組（n＝8）、假手術組（n＝8）和缺血再灌注組2h、6h、12h、24h、48h每組各8只。尼龍線為上海申丁實業有限公司生產，TTC為Amresco公司（美國）生產。其余試劑均為市售。

12栓線的制備

采用6cm長3/0單股尼龍線，用記號筆在雙側距頭端18mm、20mm和22mm點分別作標記，然后浸入肝素鈉（12500單位）中浸泡30min后晾干備用。

13右側大腦中動脈閉塞（middlecerebralarteryocclusion,MCAO）局灶性腦缺血再灌注改良模型的建立

采用longa法，略有改良。采用10％水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉，頸部正中略偏右側長約2cm的豎直切口，沿胸鎖乳突肌內側緣分離出右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）。用6/0絲線結扎CCA近心端和ECA起始端，在CCA遠心端和ICA起始端各置6/0絲線備用，用眼科剪在CCA近心端和遠心端之間距離頸總動脈分叉約5mm處剪一個小口，經CCA插入3/0尼龍線至大腦中動脈起始段，插入深度為19.5±0.5mm；術中維持體溫37.0±0.5℃。術后兩小時用乙醚再次麻醉老鼠后將尼龍線輕輕拔退約1cm，此時記為再灌注0h。假手術插線深度為10mm，余同實驗組。空白組不作任何處理。術后單籠飼養，進食顆粒食物。剔除術中出血較多、呼吸困難、取腦時有蛛網膜下腔出血及提前死亡的大鼠。

14神經功能缺損評分

動物缺血2h待蘇醒后,按ZeaLonga方法評定神經功能缺損現象。0分:無任何神經功能缺失體征；1分:未損傷側前肢不能伸展；2分:向未損傷側行走；3分:向未損傷側轉圈成追尾狀；4分:意識障礙,無自主行走［4］。動物評分在1～3分之間為造模成功,否則棄之不用。

15紅四氮唑（TTC）染色確定梗死效果

每組取4只大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，從前額極開始行冠狀切片，片厚約2cm，置入2％TTC水溶液中，37℃避光孵育30min后，用眼科鑷分離白色區(梗死區)和紅色區(正常區),分別稱取重量,計算梗死比。梗死比(%)=白色區重量/(白色區重量+紅色區重量)［5］。

16腦含水量的測定

剩余每組大鼠在相應時間點麻醉后斷頭取腦，以視交叉前2mm和乳頭體為標志冠狀切為前、中、后三段，每段分為健側和患側。萬分之一電子分析天平稱取腦濕重,置100℃烤箱中烘烤至恒重（即兩次測量重量相同）時稱取腦干重,按公式:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重,測算出腦組織的含水量［6］。

17統計學處理

組間行單因素方差分析，經SPSS統計軟件處理。

2結果

21神經病學表現

缺血組所有動物在麻醉清醒后均出現不同程度的偏癱，缺血再灌注組每只大鼠在麻醉清醒后均出現左前肢不能伸展，其中15只大鼠出現向左側行走的癥狀，18只大鼠出現向左側轉圈的癥狀，平均評分為2.28分；而假手術組和空白組未出現任何神經功能缺損癥狀，平均評分為0分。缺血再灌注組與空白組和假手術組間差別均具有統計學意義（P<0.05；P<0.05）。

22TTC測量梗死比（％）

正常組織經TTC染色呈紅色，而梗死組織呈白色。空白組和假手術組經TTC染色后均未見有白色梗死灶（圖1、2），其梗死比為0；缺血再灌注12h即可見有白色梗死灶形成(圖3)，隨著再灌注的進行，白色梗死灶區域逐漸增大(圖4)，梗死灶主要分布于損傷側頂葉皮質，部分額葉皮質和基底節區。缺血再灌注組與空白組和假手術組間的梗死比的差異均具有顯著性（P<0.01；P<0.01），再灌注各組間差異均具有顯著性（P<0.01）。其梗死比的時程變化見圖51。表1各組大鼠腦梗死比的比較

23腦含水量（％）的測定

正常大腦外觀左右兩側對稱，背側表面血管呈淡紅色，左右分布大體均一。損傷1d和2d，肉眼可見右側腦組織腫脹明顯，MCA供血區組織蒼白。各組腦組織含水量的變化如表2所示，缺血再灌注各組損傷側腦組織含水量明顯高于未損傷側（P<0.05），且損傷側中段腦組織水腫最為突出。如圖52我們可以看到各部位腦水腫的時程變化，在腦缺血再灌注2h后腦組織含水量開始增加，在再灌注48h時增加比較明顯，并持續至再灌注72h。再灌注各組間差別均具有統計學差異（P<0.05）。表2各組大鼠各腦段不同時段含水量（％）的比較注：*：與空白組比較，P<0.01；#：與前一組比較，P<0.05；##：與前一組比較，P<0.01。

3討論

31建模的改進

在腦血管疾病的研究中，動物模型是研究缺血性腦損傷必不可少的方法，模型成功與否關鍵在于腦梗塞部位與范圍的恒定，重復性好，并且病理生理過程盡可能模擬人的發病過程。臨床上出現較多的就是頸內動脈系的大血管栓塞造成的缺血性腦損傷，其中大腦中動脈栓塞較為多見。因此本實驗采用線栓法閉塞大腦中動脈所致的局灶性腦缺血與臨床腦缺血的病理過程類似，具有一定的參考價值。本實驗采用longa線栓法復制大腦中動脈閉塞所致的缺血性腦損傷模型，并有了以下改進：①采用略偏右側切口。此種切口更容易暴露頸動脈鞘，且可以避免從氣管旁分離血管，從而可以避免刺激氣管而造成呼吸道分泌物增加，改善了術后生存質量。②栓線的預處理。本實驗所用栓線事先經肝素浸泡，一者可以軟化栓線，避免因栓線過硬造成插線時刺破血管，二者可以減緩血液在栓線頭端凝固而減輕拔線的困難度。③拔線時的二次麻醉。拔線時用乙醚麻醉可以避免大鼠因拔線的痛苦而掙扎從而增加死亡率，而且乙醚麻醉為吸入麻醉，起效快，蘇醒快，可以避免因水合氯醛二次麻醉不易掌握劑量而造成麻醉意外，也可以減短動物的麻醉時間，增加術后生存質量。此外，本實驗采用單一性別的大鼠可以避免雌激素的干擾，因為雌激素對梗死灶的大小有影響，同時在整個實驗過程中剔除術中呼吸困難，出血較多，取腦時有蛛網膜下腔出血和提前死亡的大鼠，可以避免人為誤差，增加模型的穩定性和可重復性。

32腦梗死比

腦代謝非常活躍，對血流和氧的需要量很高，而且幾乎沒有葡萄糖和氧的儲備，完全依賴血流供給葡萄糖和氧氣，供應相應腦組織區的某支大的動脈一旦閉塞，就會造成局部腦損傷［1］。通常急性腦梗死病灶由中心壞死區及周圍的缺血半暗帶（ischemicpenumbra）組成。壞死區由于完全性缺血導致腦細胞死亡，為不可逆損傷；而缺血半暗帶仍存在側支循環，可獲得部分血液供應，且神經元死亡方式主要為凋亡，尚存在大量可存活的神經元，因此對于該區的腦組織，如果能夠及時中和由死亡的細胞釋放的毒性代謝產物和恢復血供，則可能獲得挽救［8，9］。在本實驗中，由腦梗死比測量結果可以看出，再灌注各組腦梗死比與空白組和假手術組間均有差異，且腦梗死比在再灌注72h內呈逐漸增加的趨勢，提示除了恢復血供外可能尚需要其它的處理措施。目前相關研究認為MMP29［5］、MMP3、TIMP3［15］等的表達與腦梗死比高度相關，這為缺血性腦損傷發生后早期防止腦梗死體積的增大提供了一定的參考價值。

33腦水腫

通常腦水腫是指腦組織含水量增加所引起的腦體積增大，它有3種類型：細胞毒性腦水腫、血管源性腦水腫和混和性腦水腫。腦缺血再灌注后的腦水腫是一種細胞毒性和血管源性腦水腫的混和型。細胞毒性腦水腫在缺血性腦卒中時即刻發生，是由于急性腦缺血死亡細胞釋放的細胞毒性物質引起，繼發于神經元和膠質細胞腫脹，這個階段全腦體積下降。隨著缺血再灌注的進行，由于各種分子生物學機制導致血腦屏障（bloodbrainbarrier,BBB）的開放或破壞，引起血漿成分外滲至細胞外間隙，出現血管源性腦水腫（vasogenicbrainedema,VBE）。血管源型水腫伴有細胞外液體聚積，發生在梗死后24～48h［12］。當出現大面積的腦水腫可導致顱內壓增高，使得血管受壓阻塞、管腔變窄，引起腦循環機能障礙，形成缺血、水腫和顱內高壓惡性循環，甚至發生腦疝危及生命。如在腦梗死超早期給予溶栓治療，可以減輕腦損傷，改善腦梗死患者的預后，而溶栓也就是再灌注的過程，它可以通過氧自由基的釋放、興奮性氨基酸的作用等而引起非缺血性、缺氧性的損傷而加重原有的損傷，加重病情。

根據文獻指出［13、14］，腦組織含水量增加的多少，反映腦水腫的程度。從本實驗腦組織含水量的變化結果可以看出，正常鼠腦的含水量約為7454%，在再灌注6h時含水量即有增加(7623%)，隨著再灌注的進行，含水量逐步增加，在再灌注12h時顯著增加，再灌注48h～72h達到高峰，這說明在72h內腦水腫程度都是呈進行性加重，這與其他結果也是相類似的［13］。此外，水腫部位位于損傷側，以中段為主，也就是大腦中動脈供應區域為主，而未損傷側未出現明顯水腫，因此導致一側腦容積增大，顱內壓力不均衡，如果損傷側水腫過于嚴重，就會因為壓力差而引發腦疝，危及患者生命。

本實驗中，空白組和假手術組均未見腦梗死和腦水腫，缺血再灌注組則在再灌注72h內隨著時間的推移梗死比和腦水腫逐漸加劇。當缺血持續時，缺血中心區域逐漸擴大，半暗帶的可逆損傷也逐漸變為不可逆損傷，因此出現了梗死比逐漸增加的結果。急性腦缺血后死亡細胞釋放的細胞毒性物質可以引起細胞毒性腦水腫，因此在缺血的同時死亡細胞的不斷增加也不斷加重細胞毒性腦水腫，同時由于各種分子生物學機制導致血腦屏障（bloodbrainbarrier,BBB）的開放或破壞，引起血漿成分外滲至細胞外間隙，出現血管源性腦水腫（vasogenicbrainedema,VBE），所以腦水腫在72h內呈加重趨勢。腦梗死區血流再通后氧與葡萄糖供應及腦代謝恢復，腦組織損傷理應得到恢復。然而，實際上并非如此，這是因為存在再灌注損傷（reperfusiondamage）。目前認為再灌注損傷的機制可能為：①毛細血管水平無復流或不再流現象；②細胞膜與線粒體受損引起鈣超載；③缺血后白細胞粘附引起局部血流環境改變，內皮細胞腫脹、變形，毛細血管狹窄、痙攣；④氧自由基導致的細胞損傷［10，11］。腦缺血再灌注后繼發的腦水腫，會降低腦的灌注壓，損害毛細血管和增大氧氣從血液彌散到細胞的距離，從而進一步加重原有的腦缺血改變。

缺血半暗帶和再灌注損傷概念的提出更新了急性腦梗死的臨床治療觀念，搶救缺血半暗帶的關鍵是超早期溶栓治療，減輕再灌注損傷核心是積極采取腦保護治療。本實驗僅僅模擬了大腦中動脈閉塞造成局灶性腦梗塞后的腦梗死比及腦水腫的變化，而對其影響因素的研究將在日后的實驗工作中作進一步探討。

參考文獻

1HeyeN,PaetZC,CewosNJ.Theroleofmicrothrombiandmicrocirculatoryfactorsinlocalizationandevolutionoffocalcerebralischemia.NeurosurgRev,1991,14(1):7～16

2DempseyRJ,RoyMW,MeyerKL,etal.Indome2thacin2mediatedimprovementfollowingmiddlecerebralarteryocclusionincats,Effectsofanesthesia.JNeurosurg,1995,62(6):874～881

3PaczynskiRP,HeYY,DiringgerMN,etal.Multiple2dosemannitolreducesbrainwatercontentinaratmodelofcorticalinfarction.Srtoke,1997,28:1437～1444

4GiddayJM,GascheY,ShahAR,etal.ReductionincerebralvasogenicedemaandinfarctvoluminMMP29nullmiceandfollowingMMP29inhibition.SocietyforNeuroscienceAbstracts,2000,26(12):287.

5劉華，廖維靖，楊萬同，等缺血性腦損傷基質金屬蛋白酶29的表達與梗死面積研究中國康復理論與實踐，2003，9（10）：600~601

6OsamuG,TakaoA,TohruK,etal.Ischemicbrainedmafollowingocclusionofthemiddleeerebralarteryintherat.Stroke,1985,16(1):101～109

7WalzW.Boleofastrocytesinthespreadingdepressionsignalbetweenischemiccoreandpenumbra.NeurosciBiobehavRev,1997,21（2）:135~142.

8SiejoBK.Pathophysiologyandtreatmentoffocalcerebralischemia.Part1:pathophysiology.JNeurosurg,1992,77(20):169～184

9HeissWD,GrafR,WienhardK,etal.DynamicpenumbrademonstratedbysequentialmultitracerPETaftermiddlecerebralarteryocclusionincats.JCerebBloodFlowMetab,1994,14(6):892～902

10HatashitaS,HoffJT.Brainedemaandcerebrvascularpermeabilityduringcerebralischemiainrats.Stroke1990;21(3):582~588

11黃海威，黃如訓，蘇鎮培磁共振顯像對缺血性腦水腫的動態試驗研究中華神經精神科雜志，2000，26（4）：212~214

12楊偉中缺血性腦卒中并發癥的治療中國中醫藥報，2004，1，8

13MenzieaSA,BetzAL,HoffJT,Contributionsofionsandalbumintotheformationandresolutionofischemicbrainedema.JNeurosurg,1993,78(2):257～266

14SprumontP,CapranoG,LintermansJ.Morphometricalquantificationofbrainedemarelatedtoexperimentalmultiplemicro2infarctsinmice:assessmentofneurotropineffect.MethodsFindExpClinPharmacol,1993,15(3):169～177

15WallaceJA,AlexanderS,EstradaEY,etal.Tissueinhibitorofmetalloproteinase3isassociatedwithneuronaldeathinreperfusioninjury.JCerebBloodFlowMetab,2002,22(11):1303~1310.