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【摘要】目的探討卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（pma）聯合鈣離子載體（CI）誘導k562細胞向樹突狀細胞（DC）分化的作用。方法對數生長期的K562細胞在含PMA和CI的培養液中培養96h后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，用流式細胞儀檢測細胞表型，用MTT法檢測其刺激淋巴細胞增殖的能力。結果PMA聯合CI組細胞形態發生明顯變化，表面出現許多細小的突起，細胞表面CD83、CD86、CD80、CD40、HLADR和CD1a表達上調，并且可以刺激淋巴細胞的增殖反應。結論PMA聯合CI可以有效地使K562細胞向DC分化。

【關鍵詞】K562細胞樹突細胞十四酰佛波乙酯鈣通道離子載體

ABSTRACT:ObjectiveToexploretheeffectofPMA(phorbolmyristateacetate)andcalciumionophore(CI)ininducingthedifferentiationofleukemiacelllineK562intoactivateddendriticcells(DC).MethodsK562cellswereculturedinacommonmediumcontainingCI(A23187)andPMAfor96h.Thecellmorphologywasobservedunderthelightphasecontrastmicroscopeandtheelectronicmicroscope.TheviabilityrateofK562cellsculturedineachgroupwasexaminedbythetrypanbluestaining.Theimmunologicphenotypeswereanalyzedbyflowcytometry.TheproliferationreactionoflymphocytecellswasdetectedbyMTTcolorimetry.ResultsAfter96htreatmentwithA23187(375ug/ml)andPMA(10μg/mL),thecellsexhibitedthecharacteristicDCmorphology,CD83,CD86,CD80,CD40andHLADR,CD1aexpressionwasupregulatedandthecellswerefoundtobeabletostronglystimulatetheproliferationofallogeneicTcellswhenculturedwiththem.ConclusionCIincombinationwithPMAcaninduceK562cellstodifferentiateintoDCs.

KEYWORDS:K562cells;dendriticcells;tetradecanoylphorbolacetate;calciumchannels;ionophores

福建醫科大學學報2008年7月第42卷第4期曾曉明等：PMA聯合鈣離子載體誘導K562細胞向樹突狀細胞分化樹突狀細胞（DC）是體內最強的抗原提呈細胞（APC），來源于髓系祖細胞。在白血病的細胞中，DC的祖細胞和白血病細胞同樣來源于骨髓造血干細胞，因此可以刺激原始細胞分化成DC，直接呈遞完整的白血病抗原，從而刺激T細胞產生抗腫瘤效應[1]。筆者觀察了卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristateacetate，PMA)聯合鈣離子載體（calciumionorphore，CI）誘導K562細胞向DC分化的作用,探討運用細胞株進行抗白血病免疫治療的可行性。

1材料與方法

1.1材料

K562細胞株由福建醫科大學藥理學研究所饋贈。CI（A23187）、PMA為Sigma公司產品。RPMI1640干粉為美國Gibco公司產品。胎牛血清(FCS)為杭州四季青生物制品公司產品。異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗HLADR、CD80單抗，PE標記的抗CD86，CD83，CD40和CD1a單抗及同亞型對照抗體（鼠抗人），均為美國eBioscience公司產品。絲裂霉素C為上海Roche公司產品。6孔培養板、96孔培養板均為Coasta公司產品。L谷氨酰胺、MTT及臺盼藍制劑為廈門泰京生物工程有限公司產品，人淋巴細胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限責任公司產品。

1.2方法

1.2.1K562細胞培養及形態觀察

（1）取對數生長期的K562細胞，以完全RPMI1640培養基（加入10％FCS，10mmol/LL谷氨酰胺）懸浮，以1×106mL-1接種于6孔板中，每孔2mL，分4組。PMA+CI組：加入PMA和CI,使PMA最終濃度為10ng/mL，CI最終濃度為375ng/mL；PMA組：只加入PMA，PMA最終濃度為10ng/mL；CI組：只加入CI，CI最終濃度為375ng/mL；對照組：只加培養基。每組細胞為一板（n=6），37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養，隔天半液換量。實驗組（包括PMA+CI組、PMA組及CI組）另外加入半量新鮮試劑，對照組只補充新鮮培養基。培養96h后收獲細胞。（2）形態觀察。收獲4組細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。（3）細胞活率測定。收獲各實驗組的K562細胞，按臺盼藍1滴、K562細胞9滴的比例混合均勻，<30s滴于細胞計數板上，顯微鏡下計數。

計算細胞活率=不染色細胞/（染色細胞＋不染色細胞）×100％

1.2.2電鏡觀察

收獲的細胞經離心沉淀，用3.0%戊二醛和1.0%餓酸固定，經乙醇梯度脫水，超薄切片置透射電鏡觀察（由福建醫科大學電鏡室協助完成）。

1.2.3流式細胞儀檢測

收獲的細胞用PBS洗滌2次后重懸成體積100μL，加入FITC標記的抗HLADR和CD80單抗，PE標記的抗CD86、CD83，CD40和CD1a單抗及同亞型對照抗體20μL，室溫孵育30min，PBS洗滌3次，用流式細胞儀（BECKMANCOULTEREpicsXL）檢測。

1.3同種混合淋巴細胞反應

1.3.1人外周血淋巴細胞的分離和培養

抽取健康人外周血20mL，用淋巴細胞分離液密度梯度離心分離，吸取中間層單個核細胞層，洗滌3次，用1640完全培養基重懸浮，于6孔板37℃、體積分數為0.05的CO2培養4h后，輕輕吸取未貼壁細胞，為外周血淋巴細胞，備用。

1.3.2MTT比色法測定

取PMA+CI組培養96h后收獲的K562細胞（刺激細胞），用PBS洗滌2次，用含10％的FCS的RPMI1640培養基懸浮，調整細胞濃度5×105mL-1，加入終濃度為25μg/mL的絲裂霉素C，37℃、體積分數為0.05的CO2孵育30min去增殖后，用PBS洗滌2次，分別調整細胞濃度為5×103，2.5×103，1×103mL-1，與上述淋巴細胞（效應細胞，濃度為5×105mL-1）共同接種于96孔板中，每孔終體積為180μL，刺激細胞和效應細胞比分別為1∶100，1∶200，1∶500，每孔設3個復孔。同時，將沒有經過實驗處理的K562細胞（對照細胞）以同樣的方法和淋巴細胞接種于96孔板內。另設相同濃度的單獨效應細胞（淋巴細胞）對照孔及單獨DC對照組（空白1）、單獨靶細胞（K562細胞）對照組（空白2）對照孔，每孔同樣設3個復孔，在37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養96h，在培養結束前4h每孔加入MTT20μL，培養結束后離心棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，酶標儀于490nm波長檢測吸光度，計算實驗孔和未處理孔增殖倍數。

實驗孔增殖倍數=（實驗組孔-空白1）/淋巴細胞對照孔

對照孔增殖倍數=（對照細胞孔-空白2）/淋巴細胞對照孔

2結果

2.1顯微鏡觀察

PMA+CI組的細胞變大，表面出現許多細小的突起，部分細胞死亡，細胞數與對照組相比有所減少。PMA組的細胞也變大，但突起不明顯，死亡的細胞較多，數量明顯減少。CI組細胞稍變大，但沒有發現細胞突起，也沒有引起細胞死亡，數量上與對照組也沒有很大的差別（圖1）。

2.2細胞活率

各實驗組的細胞活率：PMA+CI組為67.1%，PMA組為35.1%，CI組為89.7%，對照組為99%。

2.3電鏡觀察

PMA+CI組的細胞體積增大，形狀不規則，細胞質有突起，細胞核清晰，線粒體豐富，粗面內質網發達，可見溶酶體（圖2）。

2.4流式細胞儀檢測

與對照組比較，PMA+CI組細胞表面分子CD80、CD83、CD83、CD40L、CD1a、HLADR都有明顯的表達上調（圖3）。而單用PMA和單用CI組與對照組比較無明顯不同（表1）。表1K562細胞經PMA聯合CI誘導96h后的細胞表型（略）

2.5混合淋巴細胞反應

PMA+CI組與對照組的淋巴細胞增殖反應見圖4。PMA+CI組在DC∶淋巴細胞為1∶100，1∶200，1∶500均可見淋巴細胞增殖反應，以1∶100時最強，達200％以上，而對照組的增殖倍數都沒有超過100％，即淋巴細胞沒有發生增殖反應。

形狀不規則，細胞質有突起，細胞核清晰，線粒體豐富，粗面內質網發達，可見溶酶體.

3討論

Choudhury等采用慢性粒細胞白血病（CML）患者的骨髓細胞，經體外誘導成DC，這些DC帶有CML細胞的特異性抗原bcr/abl融合基因，可以激活T細胞產生特異性的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）效應，對白血病細胞進行殺傷溶解[1]。本實驗室也曾采集CML患者的骨髓細胞在體外誘導可轉化為DC，這種DC同樣表達腫瘤抗原，在同CML骨髓細胞共同培養后，可以使CML腫瘤細胞減少，為CML的體外凈化提供了一條可能的治療途徑[2]。

用白血病細胞株也可以在體外誘導分化成DC[23]，白血病細胞株來源方便，同質性好。但研究表明，白血病細胞誘導生成的DC表面分子表達不充分，分析認為，可能由于不同的刺激因子只是部分激活了DC分化的機制，不能全面誘導DC成熟。Mohamed等分析了不同的刺激因子（細胞因子、CI、PMA）誘導腫瘤細胞生成DC的作用認為，比起細胞因子，CI和PMA可以使細胞分化得更為成熟。可能是經由細胞因子介導細胞分化的信號傳導途徑可能在腫瘤細胞中存在缺陷，而CI和PMA是直接刺激下游信號的介質，可以繞過這些途徑而引起細胞的分化[4]。

筆者采用PMA聯合CI誘導K562細胞，經過4d的培養，觀察到細胞周圍有細小的突起，檢測其表達免疫表型CD80、CD86、CD83、CD40、MHCI/Ⅱ分子，發現比對照組有明顯的上調。混合淋巴細胞培養也顯示，比對照組具有明顯的淋巴細胞增殖效應。單用CI誘導K562細胞，沒有發現有形態上的變化，其免疫表型和對照組也沒有很大的區別，這也和本實驗室以往的研究結果一致[5]。雖然采用CI已證實可以在體外使CML患者的外周血或骨髓單個核細胞分化成具有抗原提呈功能的DC[6]，但單用CI看來不足以使K562細胞分化。可能的解釋是，K562是增殖旺盛的細胞株，需要更強的誘導分化刺激。單用PMA的實驗結果是細胞死亡率比較高，和Mohamed等實驗結果一致[5]，可能由于PMA是一種化學誘導劑，對細胞的毒性作用比較大。本實驗在淋巴細胞增殖反應上采用了比其他實驗更低的效靶比（1∶100，1∶200，1∶500），同樣發現有相當強烈的增殖效應，說明采用這種方法誘導生成的DC具有很強的刺激淋巴細胞增殖的能力。

筆者認為，采用PMA聯合CI誘導K562細胞，可以使其獲得典型DC的形態特征、免疫表型和刺激同種混合淋巴細胞增殖的功能，使這種類DC的細胞更加具有成熟DC的特征，為臨床上獲取DC進行免疫治療提供了一種更加方便和可靠的方法，有可能成為抗白血病治療新的手段，當然，K562細胞作為腫瘤細胞，其應用的安全性還需要進一步的研究和探討。

【參考文獻】

[1]ChoudhuryA,GajewskiJL,LiangJC,etal.UseofleukemicdendriticcellsforthegenerationofantileukemiccellularcytotoxicityagainstPhiladelphiachromosomepositivechronicmyelogenousleukemia[J].Blood，1997,89(4):11331142.

[2]陳君敏,陳志哲,魏秀妹.自體樹突狀細胞用于慢性粒細胞白血病骨髓凈化的初步研究[J].福建醫科大學學報,2001,35(1):3639.

[3]LindnerI,KharfanDabajaMA,AyalaE,etal.InduceddendriticcelldifferentiationofchronicmyeloidleukemiablastsisassociatedwithdownregulationofBCRABL[J].JImmunol,2003,171(4):17801791.

[4]KharfanDabajaM,AyalaE,LindnerI,etal.Differentiationofacuteandchronicmyeloidleukemicblastsintothedendriticcelllineage:analysisofvariousdifferentiationinducingsignals[J].CancerImmunolImmunother,2005,54(1):2536.

[5]郜峰,陳君敏,葉德富,等.鈣離子載體上調K562細胞B7分子表達[J].中國免疫學雜志,2006,22(7):612614，618.

[6]KoskiGK,SchwartzGN,WengDE,etal.Calciummobilizationinhumanmyeloidcellsresultsinacquisitionofindividualdendriticcelllikecharacteristicsthroughdiscretesignalingpathways[J].JImmunol,1999,163(1):8292.