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【摘要】目的探討層黏連蛋白（laminin，LN）α1，α2，α3，α5亞基在人腦膠質瘤中的表達特征。方法采用免疫組織化學SP法和圖像分析技術分析77例腦膠質瘤、8例正常腦組織以及10例腦內轉移瘤標本中LNα1、α2、α3、α5亞基的表達情況。結果（1）人腦膠質瘤中，LNα2，α3呈陰性，LNα1，α5陽性染色位于瘤細胞質及細胞膜，其陽性染色強度與病理級別密切相關（P<0.01）；（2）LNα5在血管內皮細胞及基膜呈陽性染色，染色強度與病理級別比較無統計學意義（P>0.05），但明顯強于腦內轉移瘤（P<0.05），后者常表現為基膜不連續弱陽性染色。結論（1）LNα1，α5亞基的表達強度與腦膠質瘤病理級別密切相關；（2）LNα5在腦膠質瘤和腦內轉移瘤組織中血管內皮細胞及基膜表達的差異可能與瘤細胞轉移行為有關。

【關鍵詞】腦腫瘤神經膠質瘤腫瘤轉移層粘連蛋白免疫組織化學

ABSTRACT:ObjectiveToexploreexpressionpatternsoflamininα1、α2、α3、α5subunitinthehumanbrainglioma.MethodsTheexpressionoflamininα1、α2、α3、α5subunitin77brainglioma,8normalbraintissueand10metastatictumorspecimenswereanalyzedbyimmunohistochemistryandimageanalysistechnique.Results1.Therewerenegativeexpressionoflamininα2、α3subunitandpositiveexpressionoflamininα1、α5subunitinthehumanbraingliomas,whosepositivestaininglocatedintumourcellmembrane,plasma.Thepositivestainingintensitywascorrelatedwithpathologicalgradeofglioma（P<0.001）.2.Therewerealsopositiveexpressionoflamininα5subunitinbloodvesselendothelialcellsandbasalmembrane,whichintensitywasnotcorrelatedwithpathologicalgradeofglioma(P>0.05),butwasstrongerthanexpressioninmetastatictumor(P<0.05).Conclusion1.Theexpressionintensityoflamininα1、α5subunitintumorcellswascloselycorrelatedwithpathologicalgradeofglioma.2.Theexpressiondifferenceoflamininα5subunitinbraingliomaandmetastatictumorwasprobablycorrelatedwiththemetabasisbehavioroftumorcells.

KEYWORDS:brainneoplasms;glioma;neoplasmmetastasis;laminin;immunohistochemistry

福建醫科大學學報2008年7月第42卷第4期梅文忠等：層黏連蛋白α1、α2、α3、α5亞基在人腦膠質瘤中的表達層黏連蛋白（laminin，LN）是一族具有多種生物學功能的細胞外基質(extracellularmatrix,ECM)糖蛋白，它們參與基底膜構建，對維持基底膜的完整結構起重要作用，還在細胞黏附、生長、遷移中扮演著至關重要的角色[1]。研究表明，某些LN分子在膠質瘤細胞中表達增高，且與腫瘤病理級別相關，參與膠質瘤侵襲性生長而罕見顱外轉移行為的調控[23],但是以往的研究多是針對LN蛋白分子或某些LN亞型分子的研究，如LN5，LN8，LN9，LN10/11等。本實驗采用免疫組織化學SP法檢測LNα1，α2，α3，α5亞基在不同病理級別的腦膠質瘤中的表達情況，探討其與人腦膠質瘤生物學行為的關系。

1材料和方法

1.1材料

手術切除并經病理檢查證實的人腦膠質瘤標本77例，其中星形細胞瘤41例、少突膠質細胞瘤7例、混合型膠質細胞瘤10例、室管膜瘤9例、髓母細胞瘤3例、膠質母細胞瘤7例。77例中，男性49例、女性28例，年齡（35±5.9）歲（3～70歲）。參照2000年WHO神經系統腫瘤分類及分級標準：Ⅰ級10例，Ⅱ級34例，Ⅲ級23例，Ⅳ級10例；術前均未接受放療或化療。取10例經病理檢查證實的非神經系統來源的腦內轉移瘤標本，男性7例，女性3例，年齡（54±2.8）歲（45～72歲）。8例正常腦組織標本取自顱腦損傷行內減壓術患者，男性5例、女性3例，年齡（37±4.3）歲（13～61歲）。所有組織標本取后立即用10％福爾馬林固定，常規石蠟包埋，研究時選取典型蠟塊作2～4μm連續切片。

1.2方法

1.2.1主要試劑

羊抗人LNα1，α2，α3，α5亞基多克隆抗體(濃縮型)購自美國SantaCruz公司；超敏SP試劑盒購自福州MaixinBio公司。

1.2.2免疫組織化學

使用檸檬酸鹽（PH6.0）高溫高壓修復法進行抗原修復，免疫組織化學使用超敏SP法，具體參照說明書進行。抗體工作濃度（1∶100）。

1.2.3結果判斷

定位于腦膠質瘤細胞質及細胞膜上根據染色程度及染色細胞百分率進行分析評分[3]：著色缺如者為0分、淡者為1分、適中者為2分、深者為3分；著色細胞占細胞記數百分率＜5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、＞50%為3分；每張切片著色與著色百分率得分相乘為其最后得分：規定0～1分者為陰性（-）、2～3分者為弱陽性（+）、4～6分者為陽性（++）、>6分者為強陽性（+++）。

在腦膠質瘤血管內皮細胞膜及血管基膜染色陽性的指標，利用ImageProPlus6.0軟件測定陽性染色的血管內皮及基膜的平均光密度值（averageopticaldensity，AOD）和陽性染色的微血管管壁厚度（microvascularwallthickness，MWT）。

1.3統計學處理

應用SPSS11.5軟件對檢測數據進行統計處理，采用單因素方差分析、Kendall’s等級相關分析檢驗方法。P<0.05為差別有統計學意義。

2結果

2.1LNα1，α5的表達

LNα1主要定位在腫瘤細胞膜上，病理級別越高染色越強；陽性染色的細胞呈巢狀分布或散在分布，在少數高級別膠質瘤標本中還可見陽性染色的瘤細胞圍繞著血管分布，而在血管內皮細胞及基膜無染色（表1～2，圖1）。表1LNα1，LNα5在膠質瘤細胞中的陽性表達強度與病理級別的關系（略）表2LNα5在血管內皮及基膜中的陽性表達強度與腦內腫瘤惡性程度的關系（略）

LNα5不僅在所有膠質瘤的瘤體及瘤周腫瘤細胞膜與細胞質上有染色，且病理級別越高染色越強；同時，血管內皮細胞及基膜也出現陽性染色，表現為靠管腔的一層內皮細胞和基膜呈連續、完整的陽性染色，但染色強度在膠質瘤各級別之間無明顯差異。然而，LNα5在正常腦組織的血管內皮細胞及基膜無陽性染色，在腦內轉移瘤的血管內皮細胞及基膜也僅見弱陽性染色，但染色基膜呈不連續，染色強度低于膠質瘤組；不過，膠質瘤和轉移瘤標本血管腔中紅細胞膜上均可見LNα5強陽性染色(圖1,2)。

2.2LNα2、α3的表達情況LNα2、α3亞基在膠質瘤細胞及血管內皮細胞和基膜中均無陽性表達。

3討論

研究發現，LN能增強膠質瘤細胞活動性，促進膠質瘤細胞粘附和遷移，促進腫瘤的侵襲[1,3]。陳菊祥等利用含13939種人類基因的BioStarH40S型芯片篩選人腦膠質母細胞瘤與侵襲性相關基因的表達和功能，結果發現層黏連蛋白、血小板衍化生長因子受體A（PDGFRA）等8條細胞骨架和細胞外基質基因均在膠質母細胞瘤中顯著上調[4]。研究也發現PDGFRA和LN可以促進腫瘤新生血管的形成，導致膠質母細胞瘤侵襲性增強[5]。最近，Kawataki等在體外實驗中發現含α3的LN5和含α5的LN10可強烈的促進膠質瘤細胞遷移，含α1的LN1作用較弱，含α2的LN2和α4的LN8在體外對膠質瘤細胞遷移無促進作用[6]。本研究發現，LNα1、α5在膠質瘤的瘤體及瘤周、瘤細胞質與細胞膜均有表達，表明LN可由瘤細胞合成、組裝、分泌；本研究發現LNα1、α5在膠質瘤細胞漿膜的表達強度與病理級別密切相關，隨著病理級別的增高而表達增強，提示它們可能與瘤細胞惡性程度有關，促進瘤細胞之間或瘤細胞與ECM、血管基膜之間的黏附和遷移。

臨床病理發現，腦組織雖是身體其他器官原發癌轉移的好發部位，但顱內原發腫瘤卻很少顱外轉移，其原因也被認為與LN在腦膠質瘤中的分布特征有關[3]。本研究發現，LNα5在膠質瘤血管內皮細胞和基膜上表達增高，且LNα5在基膜上的表達是連續的、完整的，與之前的文獻報道基本相符；而在腦內轉移瘤中見LNα5在血管內皮和基膜的表達較弱，且不連續、有斷裂。提示LNα5可能影響膠質瘤細胞侵襲血管向顱外轉移。

基膜上的LN除了可抑制瘤細胞穿越血管壁而發生轉移外，還可通過與瘤細胞表面存在LN受體（整合素類和非整合素類）的結合，誘導瘤細胞的黏附和遷移[7]。Lugassy等用內皮細胞形成類管腔結構并與腫瘤細胞共培養發現，膠質瘤細胞可沿著管腔外表面前行，并包繞在血管基底膜成分LN的外周[8]。提示本研究中的LNα5可能在影響膠質瘤顱外轉移的同時，還誘導膠質瘤細胞沿著血管基膜向正常腦組織遷移。此外，在臨床和不同動物實驗中也觀察到腦膠質瘤細胞還常沿有髓纖維（束內、束周及束間）侵襲，研究表明雖然腦膠質瘤細胞系能特異地粘附到中樞神經系統髓磷脂提取物，但比粘附到純化的LN上明顯要慢[9]。

呂德蘭血型糖蛋白（Lu），也稱為基底細胞黏附分子（BCAM），是表達于紅細胞膜上的一種LN受體，屬于免疫球蛋白超家族，研究表明它與LN的高親和力結合有助于器官發生、血管形成、紅細胞生成，研究還表明它在一些疾病和惡性腫瘤中高表達，并和其它的黏附受體一起涉及到腫瘤的惡性轉化和轉移[1011]。Kikkawa等研究發現在ECM蛋白中，僅僅含α5鏈的LN是Lu/BCAM的配體[12]。本研究發現LNα5除了在血管內皮細胞和基膜表達外，還在紅細胞膜上呈陽性染色，膠質瘤和轉移瘤標本中紅細胞膜上染色遠強于正常腦組織，膠質瘤與轉移瘤之間染色無明顯差異。提示高表達的LNα5結合到紅細胞膜受體上，其來源有可能是內皮細胞合成、分泌的，LNα5與Lu/BCAM相互作用在紅細胞運輸、腫瘤營養、血管內皮增生/新血管生成等過程中可能起重要作用。

不過，要確切地搞清楚是哪些LN亞基在腦膠質瘤的那些生物學行為中起作用？作用如何？分子機制何在？還需要借助現代分子生物學技術（基因敲除，基因轉染、RNAi干擾技術等）在體內外實驗（黏附、遷移、侵襲實驗）中進一步研究。

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