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【摘要】目的研究氯諾昔康對手術(shù)致痛大鼠脊髓Fos蛋白表達(dá)的影響。方法大鼠隨機(jī)分為7組：注射用水組、氯諾昔康組、手術(shù)致痛組及氯諾昔康預(yù)處理組4組（分別于致痛前20min腹腔注射氯諾昔康0.33，1，3，9mg/kg）。3h后取出脊髓,免疫組織化學(xué)檢測Fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元（FLIN），觀察Fos蛋白的表達(dá)。結(jié)果手術(shù)致痛組脊髓背角淺層Ⅰ～Ⅱ?qū)覨os蛋白大量表達(dá),氯諾昔康可減少Fos蛋白表達(dá),并呈量效關(guān)系。結(jié)論氯諾昔康對手術(shù)致痛引起的脊髓背角Fos蛋白的表達(dá)能產(chǎn)生抑制作用,且呈劑量依賴性，同時對手術(shù)致痛有鎮(zhèn)痛作用。

【關(guān)鍵詞】疼痛；氯諾昔康；脊髓；原癌基因蛋白質(zhì)cfos；免疫組織化學(xué)；疾病模型,動物；消炎藥,非甾類

非甾體類抗炎藥氯諾昔康已越來越多用于臨床術(shù)后鎮(zhèn)痛[1]。本文擬研究氯諾昔康對手術(shù)致痛大鼠脊髓Fos蛋白表達(dá)的影響,評價氯諾昔康對手術(shù)致痛的鎮(zhèn)痛作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物與分組健康成年雄性SD大鼠[福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(閩)20040002)]50只,體質(zhì)量280～320g,隨機(jī)分為7組：注射用水組（W組）、氯諾昔康組（L組）、手術(shù)致痛組（S組）、4個氯諾昔康預(yù)處理手術(shù)致痛組（L1S組、L2S組、L3S組、L4S組）。其中W組（腹腔注射注射用水1mL）、L組（腹腔注射氯諾昔康3mg/kg）、S組（手術(shù)致痛未預(yù)注氯諾昔康）為對照組,每組6只；L1S組、L2S組、L3S組、L4S組為實驗組,每組8只,于手術(shù)致痛前20min分別腹腔預(yù)注射氯諾昔康0.33,1,3,9mg/kg。

1.1.2試劑一抗兔抗cFos(4):sc52,免疫組織化學(xué)染色試劑盒為PV9000（北京中杉生物公司）。

1.2方法

1.2.1疼痛模型制作手術(shù)致痛參照文獻(xiàn)[2],從足底近端0.5cm處向趾部作一約1cm的切口,挑起足底肌肉并縱向切割后縫合皮膚。

1.2.2脊髓片制備及免疫組織化學(xué)分析手術(shù)致痛3h后,3%戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉下迅速開胸顯露心臟,經(jīng)左心室灌注預(yù)冷的4%多聚甲醛固定,打開椎板,取脊髓L4～L5節(jié)斷,位置相當(dāng)于腰膨大中下段。將所取標(biāo)本置于甲醛固定液中固定,經(jīng)處理后石蠟包埋切片,切片經(jīng)抗原修復(fù)、封閉非特異抗原、一抗兔抗Fos血清（1∶200）、二抗羊抗兔IgG血清及DAB呈色處理后,在光學(xué)顯微鏡下觀察,計數(shù)Fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元（Foslikeimmunoreactivityneurons,FLIN）。每次實驗均留取數(shù)片用PBS或正常羊血清代替一抗做對照實驗。

1.2.3結(jié)果判定免疫組織化學(xué)標(biāo)記顯示：FLIN呈圓形或者卵圓形,細(xì)胞核呈棕黃色。每只大鼠隨機(jī)取切片8張,計數(shù)每張切片脊髓背角淺層（Ⅰ～Ⅱ?qū)樱┑腇LIN數(shù)目,其均數(shù)為平均FLIN數(shù)目。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理計量數(shù)據(jù)均以x±s表示,采用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較用方差分析,兩兩比較用Dunnettt檢驗,P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

W組和L組未行手術(shù)致痛,FLIN極少,2組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。S組經(jīng)過手術(shù)致痛,未用氯諾昔康鎮(zhèn)痛藥,在脊髓L4～L5節(jié)斷灰質(zhì)出現(xiàn)大量FLIN,多集中在手術(shù)側(cè)脊髓,最多分布在脊髓背角淺層（Ⅰ～Ⅱ?qū)樱?其次在深層（Ⅴ～Ⅵ層）,固有核和腹側(cè)灰質(zhì)也有少量FLIN。L1S組、L2S組、L3S組及L4S組大鼠脊髓灰質(zhì)背角淺層FLIN數(shù)目隨氯諾昔康劑量的增大呈減少趨勢,且同S組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1，圖1）。

3討論

3.1疼痛與脊髓cfos的表達(dá)自Brennan等提出大鼠切口疼痛模型后[2],文獻(xiàn)報道大鼠切口疼痛可使脊髓背角即刻早期基因cfos原癌基因表達(dá),其產(chǎn)物為Fos蛋白[3]。cfos原癌基因的表達(dá)可作為傷害性刺激的標(biāo)志物。一定程度上,cfos被誘導(dǎo)的數(shù)量與所受刺激的強(qiáng)度時間及性質(zhì)而異[4]。

表1脊髓灰質(zhì)背角淺層Fos蛋白表達(dá)的比較（略）

Tab1TheexpressionofFosindorsalhornofspinalcord

FLIN:Fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元.W組：注射用水組；L組：氯諾昔康組；S組：手術(shù)致痛組；L1S、L2S、L3S及L4S組為氯諾昔康預(yù)處理手術(shù)致痛組.與S組比較,☆：P<0.05；與L1S組比較,#：P<0.05；與L2S組比較,△：P<0.05；與L3S組比較,□：P<0.05.

脊髓背角淺層（Ⅰ～Ⅱ?qū)樱┑腇os蛋白表達(dá)是支配大鼠后爪的C類傳入神經(jīng)纖維興奮所致,深層（Ⅴ～Ⅵ層）的Fos蛋白表達(dá)是由于淺層輸入會聚結(jié)果,而Ⅲ、Ⅳ層主要是由那些僅對非傷害性刺激做了反應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成。它們的分布與傳遞外周傷害性信息的初級傳入纖維終末的終止部位相一致,也與背角痛敏神經(jīng)元的分布部位相重疊,表明脊髓背角Fos陽性神經(jīng)元大都是感覺傳遞通路上的二級或中間神經(jīng)元。因此FLIN主要集中在脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)?其次為Ⅴ～Ⅵ層,而Ⅲ～Ⅳ層卻很少。

A:注射用水組;B:氯諾昔康組;C:手術(shù)致痛組;D:氯諾昔康0.33mg/kg;E:氯諾昔康1mg/kg;F:氯諾昔康3mg/kg;G:氯諾昔康9mg/kg.A，B:基本無Fos表達(dá);C:可見較多Fos表達(dá);D，E，F(xiàn)，G:隨氯諾昔康增加Fos表達(dá)減少.

圖1脊髓灰質(zhì)背角淺層Fos表達(dá)情況(×40)（略）

Fig1TheexpressionofFosindorsalhornofspinalcord

3.2鎮(zhèn)痛藥減少疼痛引起的脊髓cfos表達(dá)Honore等研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后3hFLIN最多[5]。本研究中L組僅行手術(shù)致痛，未用鎮(zhèn)痛藥,與其它組相比,脊髓背角淺層FLIN數(shù)目最多,與以上研究結(jié)果相似。已有研究顯示,預(yù)先給予鎮(zhèn)痛藥嗎啡、曲馬多等可顯著減少各種傷害性刺激所致的脊髓cFos表達(dá),如機(jī)械性損傷、足底注射甲醛等[34]。

既往非甾體類抗炎藥較少用于術(shù)后疼痛,而近年來研制出的新型非甾體類抗炎藥如氯諾昔康等已在臨床上越來越多用于術(shù)后鎮(zhèn)痛,其機(jī)制主要是通過作用于環(huán)氧化酶抑制可致痛的前列腺素類物質(zhì)的產(chǎn)生,其次它也能刺激體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源性阿片類物質(zhì)。在氯諾昔康的鎮(zhèn)痛基礎(chǔ)研究中,Buritova等將氯諾昔康用于大鼠足底的炎癥疼痛模型,表明氯諾昔康有量效關(guān)系,隨著給藥量增加,大鼠足底的腫脹減少,脊髓Fos蛋白表達(dá)減少[6]。

本研究采用外科手術(shù)致大鼠切口疼痛模型,結(jié)果提示隨著氯諾昔康劑量增加,脊髓Fos蛋白表達(dá)減少,與手術(shù)致痛組比較,氯諾昔康（0.33,1,3,9mg/kg）劑量依賴性減少脊髓背角淺層Fos蛋白表達(dá)（22%,45%,69%,82%）,說明氯諾昔康對手術(shù)致痛有鎮(zhèn)痛作用。

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