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摘要目的：探討雷公藤紅素對HMC-1細胞表達Fas、Fas-L的影響及與凋亡的關系。方法：用流式細胞儀檢測細胞凋亡和Fas、Fas-L的表達。結果：HMC-1細胞能自發表達Fas，不表達Fas-L。經雷公藤紅素作用，Fas呈先升后降的變化，Fas-L低水平表達。Fas陽性率下降與凋亡率增加相關。結論：Fas可能是雷公藤紅素誘導HMC-1細胞凋亡的途徑之一。

關鍵詞雷公藤紅素HMC-1細胞FasFas-L凋亡

FasmaybeoneofthemoleculeswhichmediatesHMC-1cellapoptosisinducedbytripterine

BAOYi-Xiao,ZHANGLing-Zhen,LILietal.

ClinicalImmunologyCenterofPLA,ChangzhengHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,

Shanghai200003

AbstractObjective:ThispaperreportstheeffectoftripterineontheexpressionFasandFas-LinHMC-1cellsandtherelationtoapoptosis.Methods:TheexpressionofFas/Fas-Landapoptosiswereassayedbyflowcytometry.Results:HMC-1cellsconstituantlyexpressFas(22.7%),butnotFas-L.Onexposuretotripterineattheconcentrationof1.0μmol/L,Faspositiverateincreasedto57.5%at2h,thendecreasedto12.5%at4hand2.3%at6h.Fas-Lexpressedatlowerlevel.ThereweresignificantrelationbetweenthedecreaseofFaspositiverateandincreaseapoptosis.Conclusion:FasisoneofthemoleculeswhichmediatesHMC-1cellapoptosisinducedbytripterine.

KeywordsTripterineHMC-1cellFasFas-LApoptosis

雷公藤紅素是雷公藤單體之一，屬三萜類色素［1］。它能誘導人肥大細胞系HMC-1細胞凋亡［2］，但誘導凋亡的機制尚不清楚［3］。Fas抗原（CD95）是一種膜受體，屬TNFR/NGFR家族成員，表達于多種類型的細胞表面，其配體（Fasligand,Fas-L)主要表達于活化的淋巴細胞。Fas與FasL結合能迅速地啟動細胞凋亡。本文研究雷公藤紅素誘導HMC-1細胞凋亡過程中Fas及Fas-L表達的變化及與凋亡的關系，以探討雷公藤紅素誘導HMC-1細胞凋亡的機制。

1材料與方法

1.1細胞培養HMC-1細胞培養于5％CO2,37℃孵箱中。培養基IMDM(GIBCOBRL)含10%熱滅活小牛血清，0.1U/L青霉素，0.1U/L鏈霉素。培養細胞密度為0.5×106～1.0×106ml-1,取對數生長期細胞待用。

1.2細胞凋亡的檢測

1.2.1形態觀察HMC-1細胞呈圓或橢圓形。凋亡時細胞膜內陷，核濃縮，形成凋亡小體。

1.2.2流式細胞儀(FCM)DNA含量分析1×106個細胞加50μl含0.1%Triton-X100的碘化丙啶(PI)(5μg/ml)染色，避光放置5min,加0.5mlPBS,上流式細胞儀檢測,Multicycles軟件分析結果。

1.2.3DNA瓊脂糖電泳1×106細胞加100μlTBE緩沖液，0.25%NP-40,0.1mg/mlRnase，50℃水浴30min；再加1mg/ml蛋白酶K,50℃水浴30min，即獲得需要的DNA溶液。取30μlDNA溶液于1.8%瓊脂糖凝膠電泳,細胞凋亡時可出現梯形條帶。

1.3Fas和Fas-L的測定0.5×106個HMC-1細胞，加鼠抗人anti-Fas或anti-Fas-L單克隆抗體20μl，加同型非特異性IgG為陰性對照(ImmunoTech公司),4℃共育30min；加FITC-anti-鼠IgM20μl,4℃共育30min。FCM檢測（COULTE，EPICSXL），計數10000個細胞。

1.4凋亡細胞群中Fas的測定中晚期凋亡細胞膜透性可以增加，不加Triton-X100的PI可滲入細胞著色。對細胞進行Fas標記后，加0.1%PI染色，在流式細胞儀上進行雙標記分析。

1.5數據處理t檢驗。

2結果

2.1雷公藤紅素誘導HMC-1細胞凋亡在雷公藤紅素作用下HMC-1細胞可出現細胞皺縮，核濃縮，形成凋亡小體的形態改變（圖1)。作用24h,DNA瓊脂糖電泳可見梯形條帶(圖2）。

2.2HMC-1細胞Fas和Fas-L的表達HMC-1細胞大小不等，在流式細胞儀上根據前向散射程度可將其分為大、中、小三群，三群細胞分別占37.5％,12.1%,23.7%，三群細胞Fas的陽性率分別為20.0%,37.1%和6.5%；整群細胞表達Fas的陽性率為22.7％，不表達Fas-L。

圖1HMC-1細胞在雷公藤紅素作用下呈凋亡形態改變(HE染色，×400)

Fig.1Tripterineinducedmorphologicalchangescharacteristicofapoptosis(HEstain,×400)

Note:CondensationofchromatinandapoptoticbodyformationinHMC-1cells

圖2雷公藤紅素作用24hHMC-1細胞DNA瓊脂糖電泳顯示梯形條帶

Fig.2AgarosegelelectrophoresisofDNAfromHMC-1cellstreatedwithtripterinefor24hours

Note:Marker:657,458,328,289,176bp

2.3雷公藤紅素對HMC-1細胞表達Fas和Fas-L的影響在雷公藤紅素作用下Fas陽性率呈先升后降的變化，升高的程度和下降的速率與藥物的劑量相關（圖3）。Fas-L在1.000μmol/L作用下，0,4,6h分別為0,3.3%,1.8%。0.125,0.250,0.500,1.000μmol/L雷公藤紅素作用4h,Fas-L陽性率分別為3.4%,4.0%,5.7%和1.8%。

2.4PI染色陽性細胞群中Fas陽性率增高1.000μmol/L雷公藤紅素作用4h，PI染色陽性細胞為21.4%±5.0%（n＝5），PI陽性細胞群中Fas陽性率為29.1%±3.9%，PI陰性細胞群中Fas陽性率為5.7%±1.2%，兩者相比有顯著差異，P＜0.01。

2.5Fas陽性率與凋亡率變化的關系HMC-1細胞與1.000μmol/L雷公藤紅素共育，在0，2，4，8h同時測定Fas陽性率和細胞凋亡率，分析兩者的相關性。發現Fas陽性率自2h開始呈下降趨勢，細胞凋亡率自2h開始呈上升趨勢。至6h,Fas陽性率僅為2.3%，趨于0，細胞凋亡率繼續上升，見圖4。

圖3在雷公藤紅素作用下流式細胞儀測定HMC-1細胞Fas陽性率的變化

Fig.3FaspositiveratechangesmeasuredonflowcytometryintripterinetreatedHMC-1cellsFig.4Fasandapoptoticpositiveratechangesin1μmol/LtripterinetreatedHMC-1cells

3討論

雷公藤紅素能以時間和劑量依賴方式誘導肥大細胞系HMC-1細胞凋亡，提示雷公藤紅素抗炎癥［4］、治療類風濕性關節炎［5］等與肥大細胞相關疾病的作用與此有關。

既往的研究已經表明，Fas廣泛地表達于胸腺細胞，活化T、B淋巴細胞，NK細胞，單核細胞等免疫細胞表面，是介導細胞凋亡，維持細胞數量穩定的重要分子［6］。本實驗的研究表明HMC-1細胞也能表達Fas，提示Fas在介導肥大細胞凋亡、維持肥大細胞數量穩定方面發揮重要的作用。HMC-1細胞大小不等，可能與其分化階段不同有關。它們表達Fas的水平也不相同，提示不同分化階段的細胞對凋亡的敏感性不同。

多種因素可影響Fas的表達，其表達水平的變化會影響到細胞對凋亡的敏感性。如外周血T細胞在超抗原作用下高水平地表達Fas和Fas-L，由此促進T細胞的凋亡［7］。本實驗發現雷公藤紅素使HMC-1細胞表達Fas增高，同時誘使Fas-L呈低水平表達。雷公藤紅素的這一作用可能與其誘導HMC-1細胞凋亡有關。因為Fas的高表達提高了HMC-1細胞凋亡的敏感性，尤其在體內接觸到Fas-L陽性淋巴細胞即可以引起凋亡；在體外接觸到Fas-L陽性的HMC-1細胞也可引起凋亡。凋亡細胞群中Fas陽性率增高。凋亡率的增加伴隨Fas陽性率的下降，二者在啟動時間上一致。這些均支持雷公藤紅素促進Fas表達與其誘導HMC-1細胞凋亡有關。

但是，雷公藤紅素誘導HMC-1細胞凋亡并非均由Fas介導。1.000μmol/L雷公藤紅素作用8h，Fas陽性細胞幾乎消失，而凋亡率繼續升高，48h可達90％，遠遠高于Fas陽性細胞比例，因此雷公藤紅素誘導HMC-1細胞凋亡還存在其它途徑，Fas只是其途徑之一。

Fas可能是雷公藤紅素誘導HMC-1細胞凋亡的途徑之一國家自然科學基金資助項目(編號39400123)

作者簡介：鮑一笑，男，34歲，臨床免疫學博士，主要研究哮喘的免疫機理

作者單位：(第二軍醫大學附屬長征醫院全軍臨床免疫中心，上海200003)

4參考文獻

1崗艷云，張正行.雷公藤及其單體的藥理作用研究進展.中國藥科大學學報,1995;26(4):252

2ButterfieldJH,WeilerD,DewaldGetal.Establishmentofanimmaturemastcelllinefromapatientwithmastleukemia.LeukRes,1988;12(4):34

3鮑一笑，孔憲濤，李莉etal.雷公藤紅素誘導HMC-1細胞凋亡及與細胞周期的關系.中國中西醫結合雜志,1998;18(基礎理論研究特集):198

4徐維敏，張羅修，程彰華etal.雷公藤紅素對IL-1和IL-2活性及PGE2釋放的抑制作用.藥學學報,1991;10(9):641

5嚴云屏，施守義，施宜平etal.雷公藤紅素外用治療類風濕性關節炎局部腫瘤.新藥與臨床，1989;8(6):365

6KrammerPH,DanielJ,WalaczakHetal.TheroleofAPO-1-mediatedapoptosisinimmunesystem.ImmunolRev，1994;142:175

7RennoT,HahneM,TschoppJetal.PeripheralTcellsundergoingsuperantigen-inducedapoptosisinvivoexpressB220andupregulateFasandFasligand.JExpMed，1996;183(2):431