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摘要目的：得到擬類脂A的六肽。方法：用抗類脂A的單克隆抗體篩選噬菌體隨機六肽庫，經四輪篩選后進行ELISA檢測,用得到的15個陽性克隆分別免疫小鼠，并將使小鼠產生抗LPS抗體的10個克隆進行測序，將保守序列進行肽合成。結果：得到保守序列為Lys-Phe-Ser-Ser-Arg,即KFSSRX。固相合成此小肽可與其1B6抗體結合，且此結合可被LPS抑制。結論：此六肽可模擬脂多糖或類脂A表位。

關鍵詞脂多糖模擬短肽噬菌體肽庫

PreparationofpeptidesmimicringlipidAepitopeusingphagedisplaypeptidelibrary

BAOYong-Li,FUNing①,YANGGui-Zhenetal.

DepartmentofImmunology,NormanBethuneUniversityofMedicalSciences,Changchun130021.①DepartmentofImmunology,FirstMilitaryMedicalUniversity，Guangzhou510515

AbstractObjective:FindingmimicLipidA6-merpeptides.Methods:Usedanti-LipidAMcAbtofishoutphagedisplay6-merpeptiderandomlibrary.After4roundsselection,15positiveclonesweredetectedbyELISAandusedtoimmunizemice.TenofthemcouldgetantibodyforLPS.ToanalyzetheDNAsequencesandtosynthesizethepeptidefromconservativesequences.Results:TheconservativeaminoacidsequenceisLys-Phe-Ser-Ser-ArgorKFSSRX.Thesolidphasesynthesispeptidecanbindto1B6antibodyandthisbindingcanbeinhibitedbyLPS.Conclusion:Theseresultssuggestthat6-merpeptidecanmimicrytheepitopeofLPSorLipidA.

KeywordsLPSMimicpeptidePhagedisplaypeptidelibrary

已知細菌脂多糖為非胸腺依賴抗原，難以誘導有效的免疫回憶反應，90年代初曾有人用抗獨特型抗體成功地模擬了脂多糖表位，提示了用蛋白或多肽模擬脂多糖的可能性。從噬菌體肽庫中篩選目的短肽是近年來發展起來的一項新技術，是研究蛋白質分子之間相互作用的一個有效工具。本研究用具有交叉反應性的抗鼠傷寒桿菌脂多糖類脂A單克隆抗體篩選噬菌體隨機六肽庫，旨在得到可模擬脂多糖類脂A表位的短肽，為研制具有胸腺依賴性抗原性質的LPS疫苗及內毒素拮抗劑奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料噬菌體隨機六肽庫及大腸桿菌K91Kan均為美國密蘇里大學Smith博士惠贈；T7DNA聚合酶測序試劑盒購自Promega公司；32P-dATP購自北京亞輝公司；抗類脂A單抗1B6為IgG1亞類系本室自制，方法見文獻［1］；豚鼠抗野生型M13噬菌體抗體為本室制備。

1.2噬菌體六肽庫的篩選親合素包被全塑培養皿，4℃過夜，1%BSA封閉，4℃1h，加入生物素化單克隆抗體1B6室溫2h，加肽庫，4℃作用1h洗去未結合的噬菌體，用洗脫液解離已結合的噬菌體，侵染K91Kan，擴增并提取噬菌體，用于下一輪篩選。共進行4輪篩選，每一輪都不斷減少生物素化單抗的用量及單抗與肽庫作用時間旨在得到高親和力，特異性強的克隆。四輪篩選后挑選單斑擴增，PEG沉淀回收噬菌體，并測其滴度，詳見文獻［2］。

1.3夾心ELISA法篩選陽性噬菌體克隆用1B6包被酶標板，1％BSA封閉后加篩選出的噬菌體克隆，同時以野生型噬菌體Fuse1為對照，43℃30min后加豚鼠抗M13血清，43℃30min后加HRP-SPA，最后加OPD顯色，酶標儀測OD490值。

1.4陽性噬菌體克隆免疫原性的測定用篩選出的15個陽性克隆及野生型噬菌體分別免疫Swiss小鼠，每次1012個顆粒，第1次加弗氏佐劑免疫，14d后用噬菌體顆粒直接腹腔注射，2次免疫后5d取血清，間接ELISA方法測LPS抗體。用LPS包被，加入待測血清，然后加入兔抗鼠丙種球蛋白，再加入HRP標記的驢抗兔IgG，最后加OPD顯色，測OD490值。

1.5陽性噬菌體克隆DNA序列分析用Sanger雙脫氧末端終止法對可刺激小鼠產生抗LPS抗體的噬菌體克隆進行序列分析，測引物序列為5′HO-TGAATTTTCTGTATGAGG-OH3′，測序方法參照Promega公司T7DNA聚合酶測序試劑盒說明書。

1.6模擬短肽的固相合成根據陽性克隆的保守序列在TentaGelS樹脂珠上合成固相短肽。方法為固相Fmoc化學合成法，如下：合成反應在8.0×1.6cm的Polypropylene柱中進行，將3倍克分子濃度的L型Fmoc氨基酸及交聯劑BObT及DIC加入溶漲的TentaGelS樹脂珠，交聯時間為1h，反應過程均用Ninhydrintest檢查其完全程度。Fmoc氨基酸脫保護劑為20％Piperidine/DMF。全部交聯完成后用三氟乙酸(TFA)/Phenol/Ethaneditiol/Anisole(94:2:2:2V/W/V/V)去側鏈保護基，用DMF，甲醇，雙蒸水及PBS洗滌并保存于含0.02％NaN3的PBS備用。

1.7合成短肽的抗原性鑒定以0.2μg/ml生物素標記1B6抗體與短肽交聯樹脂珠混合，室溫振搖2h，洗滌后加入堿性磷酸酶標記的親和素，室溫1h，洗滌后加入底物BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phophate)溶液，立即倒入3.5cm平皿，呈色反應完全后以1mol/LHCl終止反應。陽性樹脂珠于普通光學顯微鏡下呈綠色?？乖偁幵囼灱从诩涌贵w同時加入150μg/ml的LPS，余同上。

2結果

2.1陽性克隆的篩選及免疫原性的測定從第4輪篩選洗脫物中任選22個克隆以雙抗體夾心ELISA測定其抗原性，用PBS調零點，Fuse1為對照。結果如表1所示。

經ELISA法篩選后得到15個陽性噬菌體克隆，將其分別免疫Swiss小鼠，結果2次免疫后有10個克隆產生抗LPS抗體，其中有2個克隆效價較高，結果見圖1。

表1用夾心ELISA法檢測噬菌體克隆抗原性

Tab.1AntigenicitydetectionofphageclonesbysandwichELISA

No.ofphagecloneOD490nmNo.ofphagecloneOD490nm

10.53120.92

20.37130.62

30.23140.83

40.43150.67

50.45160.21

61.07170.37

70.36180.85

81.05190.94

91.02200.80

100.52211.01

110.84220.70

Control（Fuse1）0.20

圖1陽性克隆免疫小鼠血清LPS抗體效價的測定

Fig.1Titerofmurineanti-LPSantiserumimmunizedwithpositivephageclone

表2擬類脂A合成肽的抗原性

Tab.2TheantigenicityofsynthesismimiclipidApeptides

No.andsequencesofpeptidesBiotin-1B6Biotin-1B6mixedwithLPS

1.KFSSRF+++++

2.Ac-KFSSRF++++

3.AFSSRA++++

4.Ac-AFSSRA－N

5.KCSSRK+N

6.Ac-KCSSRK－N

7.YGGFL－N

8.Ac-KPfQwFwLQ－N

9.rPKPwQwFwLL－N

Note：SmalllettershowDtypeaminoacid；N:Notdone

2.2擬類脂A六肽編碼DNA序列分析將10個可使小鼠產生抗LPS抗體的噬菌體克隆通過Sanger末端終止法進行測序，結果其序列為5′-AAGTTTAGTTCTCGTTTC（部分為TTG)-3′進而推斷其氨基酸序列為Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Phe（或Leu)即KFSSRX。其N末端5個氨基酸序列呈高度保守。

2.3合成短肽的抗原性鑒定根據上述保守序列合成的六肽交聯樹脂珠可與生物素標記1B6單抗反應，且可被LPS特異性抑制，見表2中的短肽1～3。這一結果說明KFSSRF可模擬特異性LPS類脂A表位，N末端乙酰化對其與抗體的結合有輕度影響；用甘氨酸置換兩端的短肽3仍具有較好的抗原性，但乙酰化的短肽則不能與抗體結合。對照短肽5.6為用無關抗體篩出的與短肽1～4有共同序列SSR的短肽，其不能被1B6抗體結合說明FSSR為該目的短肽所必需的核心序列；對照短肽7、8、9分別為內啡肽及P物質（SubstanceP)表位合成模擬短肽［3，4］。

3討論

隨著分子生物學技術的迅速發展，大量的蛋白質分子得以被克隆、重組、改造，表達并付諸應用，存在于許多細菌，病毒，真菌及腫瘤細胞表面多糖抗原表位的重要性也日漸被重視。曾認為分子生物學及蛋白質化學技術無法直接用于研究多糖，而噬菌體肽庫與合成肽庫技術的出現為研究并以短肽模擬多糖表位提供了有效的工具。已有實驗證實用抗多糖抗體或酶的底物從肽庫中篩出的短肽不但具有多糖表位的抗原性，而且可模擬多糖的功能。如Kooyman等從噬菌體肽庫中篩出并合成的六肽分子可模擬大量存在于豬紅細胞表面的Galα1.3(galactosyl)，并抑制熱滅活的人血清對豬紅細胞的凝集作用［5］，這正是異種移植中亟待解決的難題之一。Taki等嘗試從噬菌體肽庫中篩選出(神經)糖鞘脂的模擬肽，根據其編碼核苷酸合成的九肽不但模擬了糖脂的抗原性，而且引人注目的是可調節糖苷酶的活性［6］。對病原微生物多糖的模擬短肽研究目前主要限于新型隱球菌多糖,鏈球菌莢膜多糖及HIV多糖［7-9］。有關革蘭氏陰性菌脂多糖內毒素方面僅Phalipon等進行了LPS的O抗原的模擬肽研究［10］，尚未見到有模擬LPS類脂A表位的報道。

脂多糖內毒素(LPS)是革蘭氏陰性菌的共同致病成分，目前雖可應用大量的抗生素治療該類細菌的感染，但菌體死亡后釋放的脂多糖（LPS）仍可造成機體的嚴重損傷。類脂A為LPS毒力中心，且在各種革蘭氏陰性菌中高度保守，LPS對機體的損傷主要是通過此部位與血漿中的LPS結合蛋白（LBP）結合，再與巨噬細胞及淋巴細胞上的CD14分子結合，從而使巨噬細胞等釋放一系列的細胞因子IL-1，TNF等造成機體的損傷［11］。目前有人采用針對LPS，IL-1及TNF的抗體治療革蘭氏陰性菌敗血癥，但效果均不顯著，且有不同程度的副作用［12］，亦有人嘗試用類脂A的結構類似物作為拮抗劑［13］。由于LPS及類脂A均為胸腺非依賴性抗原不能誘導有效的再次應答，也難以成為有效的疫苗用于預防。本研究用具有交叉反應性的抗鼠傷寒桿菌類脂A保護性單抗篩選噬菌體隨機六肽庫，所得的陽性克隆其編碼序列呈高度保守，為KFSSR。據此序列合成的短肽在體外反應顯示了較好的抗原特異性。因條件所限暫未進行各位置上的氨基酸置換，但以FSSR為核心將兩端換為甘氨酸仍具有良好的抗原性及對照短肽5僅具有微弱抗原性可提示FSSR為該表位的核心序列。N末端乙?；哪康氖茄娱L其體內半衰期，但本實驗結果提示乙?；瘜乖杂胁煌潭鹊挠绊懀@是在設計體內實驗時應予以考慮的。在進行免疫原性測定時，各個克隆刺激小鼠產生的抗體效價高低不一，但測序結果顯示為同一序列，其原因可能是普通小鼠個體差異較大所致，其次與免疫次數較少亦有關。

本研究證實了表達于噬菌體表面的短肽可模擬脂多糖類脂A表位，且據此合成的六肽即可具有較好的抗原性。此結果將為進一步研制擬LPS表位的多肽疫苗及內毒素的新型拮抗劑奠定基礎。

致謝：本研究的肽合成部分工作是在美國ArizonaCancerCenter的LamKS的指導下完成的,在此表示感謝。

噬菌體表達短肽模擬脂多糖類脂A表位的研究本項目受國家自然科學基金資助(No.39470658)

富寧現在第一軍醫大學基礎醫學院免疫教研室，廣州510515

作者簡介：鮑永利，女，30歲，講師，從事免疫生物工程方面的研究；

富寧，女，45歲，教授，主要從事抗感染免疫及細胞因子受體的研究

作者單位：（白求恩醫科大學基礎免疫學教研室，長春130021)

4參考文獻

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