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[論文關(guān)鍵詞]心肌梗死；內(nèi)皮祖細胞；CXCR4

[論文摘要]目的觀察急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)患者外周血來源內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogentiorcells，EPCs)CXCR4受體表達及功能的變化。方法選擇AMI患者15例，對照組非AMI患者15例，抽取外周血密度梯度離心法獲取單個核細胞，培養(yǎng)7d后對貼壁的細胞進行分析。激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC標記荊豆凝集素I和DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白雙染色陽性細胞為EPCs。應(yīng)用改良的Boyden小室測定EPCs對基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-I)的遷移能力，流式細胞儀測定EPCs的CXCR4的表達，RT-PCR法測CXCR4的mRNA表達。結(jié)果AMI患者外周血EPCs數(shù)目增多，對SDF-1的遷移能力增強，其表達CXCR4上調(diào)，CXCR4的mRNA合成增強。與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論AMI患者外周血來源EPCs的CXCR4受體表達上調(diào)，功能增強。

眾多證據(jù)表明，循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogentiorcells，EPCs)在成體血管形成中起了重要作用。動物和臨床實驗均表明，靜脈注射EPcs，能顯著促進缺血組織的血管新生及功能恢復(fù)，而同樣條件下注射成熟內(nèi)皮細胞卻收效甚微。這些均表明了EPcs在機體生理或病理情況下對血管形成的重要作用。因而EPcs也成為研究的熱點。正常人外周血循環(huán)中有一定數(shù)量的來源于骨髓的EPcs，參與維持血管壁的完整性。但冠心病人的EPCs數(shù)量減少，功能減低，且這種損害與冠心病的危險因素呈相關(guān)性。作為冠心病的一種特殊類型急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)，在急性期由于存在自體骨髓動員現(xiàn)象，EPCs卻是升高的。但升高后的EPCs功能如何，少有報道。筆者研究了AMI急性期EPCs的CXCR4受體的變化，來試圖解釋其功能的變化，以期為提高EPCs治療效果提供一種新的思路。

1資料與方法

1．1一般資料

AMI患者15人，對照組為因非典型胸痛而行冠狀動脈造影并排除冠心病的患者15人，2組臨床資料。排除近期內(nèi)有炎癥、腫瘤、手術(shù)及合并糖尿病，服用雌激素、他汀類藥物等影響EPCs因素的患者。

1．2材料與試劑

淋巴細胞分離液(相對密度1.077)購自上海生化試劑二廠；EGM-2-MV內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基購自Clonetic公司；胎牛血清(Fcs)購自GIBCO公司；人纖維連接蛋白購自Chemicon公司；FITC標記荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)、DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)購自Sigma公司；基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1)、FITC標記的抗CXCR4抗體購自深圳晶美生物公司；改良的Boyden小室購自江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、TaqDNA聚合酶和dNTP購自Fermcntas公司。引物由北京奧科公司合成。

1．3方法

1．3．1EPCs的分離、培養(yǎng)與鑒定每例患者取外周血15ml，分別常規(guī)密度梯度離心法分離單個核細胞。將單個核細胞以1×105個細胞/孔的密度接種在人纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板。加入EGM-2-MV培養(yǎng)基及5％FCS于5％CO培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)4d后，用PBS洗掉非貼壁細胞。為了維持細胞原先生存環(huán)境，換為EGM-2-MV培養(yǎng)基，加入20％的細胞來源患者血清，繼續(xù)培養(yǎng)至7d后進行各種檢查分析。貼壁細胞用DiI-acLDL、FITC-UEA-I行熒光化學染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，染色雙陽性細胞被認為是正在分化的EPCs。每孔隨機選擇15個視野(×200)對EPCs計數(shù)。取其平均值換算成每平方毫米的細胞個數(shù)記錄。

1．3．2EPCs對SDF-l的遷移能力檢測用胰酶消化貼壁細胞并計數(shù)。將含SDF-1質(zhì)量濃度濃度為100ng/ml的培養(yǎng)液(EGM＋20％患者血清)30μl注入改良的Boyden小室的下室，將含3×10個EPCs的培養(yǎng)液(同上)50μl注入上室，培養(yǎng)5h，刮去濾膜上面的未移動細胞，用甲醇固定，Giemsa染色，隨機選擇5個顯微鏡視野(×200)計數(shù)遷移到低層的細胞。

1．3．3流式細胞術(shù)分析消化后的部分EPCs離心，沉淀重懸于PBS中，取約5×105細胞，加入FITC標記的抗CXCR4抗體及同型對照，于流式細胞儀(FACSCalibur，B－D公司)上進行陽性細胞記數(shù)，每次分析獲取10個細胞。

1．3．4RT-PCR檢測應(yīng)用Trizol提取上述收集的EPCs總RNA，測定RNA濃度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA再進行PCR反應(yīng)。CXCR4引物序列：上游引物5’－AATCTYCCTGCCCACCATCT－3’，下游引物5’－GACGCCAACATAGACCACCT－3’，產(chǎn)物為367bp。內(nèi)參照為GAPDH，上游引物：5’－TATGATGACATCAAGAAGGTGG－3’，下游引物：5’－CACCACCCTGTFGCTGTA，擴增片段213bp。反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳。圖像分析軟件(BandLeaderApplication3.0)分析電泳條帶灰度值，目的基因mRNA表達的相對強度＝目的基因條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

1．3．5統(tǒng)計分析采用SAS8.1forwindows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差(χ±s)表示，兩組間均數(shù)比較用成組t檢驗，計數(shù)資料采用Fisher法進行檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2．1EPCs的鑒定及計數(shù)

培養(yǎng)4d后可見貼壁的單個核細胞，7d后單個核細胞變?yōu)樗笮危瑑?nèi)皮樣細胞。對貼壁細胞行熒光化學染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察，見>80％的細胞雙染色陽性，說明這些細胞能內(nèi)吞ac—LDL和結(jié)合UEA-1，可被認為是正在分化的EPCs。隨機選擇15個視野計數(shù)雙陽性細胞，見AMI組患者外周血來源EPCs為(439±54)個/mm，明顯高于對照組(263±37)個/mm，P<0.01。2．2EPCs對SDF-1遷移能力的比較

與對照組相比，AMI組外周血來源EPCs對SDF-1的遷移能力明顯增強。[175±19)vs(98±11)個/mm，P<0.01]。

2．3流式細胞儀測定EPCs表面CXCR4的表達

AMI組為(69.5±12.1)％，對照組為(58.7±10.4)％，AMI組較對照組明顯增高(P

2．4EPCs中CXCR4mRNA表達測定

AMI組CXCR4mRNA表達的相對強度為(0.8±0.11)，對照組為(0.5±0.09)，AMI組明顯高于對照組。(P<0.05)。

3討論

本實驗中發(fā)現(xiàn)，AMI后急性期外周血中EPCs數(shù)量增多，對SDF-l的遷移能力增強，同時EPCs的CXCR4受體表達增高，mRNA合成增強。AMI后，由于缺血缺氧、組織損傷、炎癥因子釋放增多，可致自體骨髓干細胞動員，因而外周血中EPCs數(shù)量增多。EPCs如何歸巢到受損心肌處以發(fā)揮生成血管的作用，目前認為主要是靠SDF-1與其受體CXCR4相互作用來完成。研究發(fā)現(xiàn)AMI后急性期內(nèi)，心肌局部SDF-1表達明顯增高，SDF-1可通過EPCs上CXCR4受體劑量依賴性地提高EPCs的遷移、歸巢向缺血組織的能力。與心肌局部SDF-1升高相對應(yīng)的是EPCs上CXCR4表達上調(diào)，筆者在體外實驗中證實了這種上調(diào)可導致EPCs對SDF-1的遷移能力增強，因而推測AMI后外周血中EPCs的CXCR4表達上調(diào)，加速了EPCs向損傷心肌處歸巢，以保護或代償生成血管。

EPCs的CXCR4上調(diào)，考慮由多種原因造成。一方面AMI后從骨髓中動員到外周血中EPCs比例、數(shù)量增多，另一方面，AMI后可釋放多種細胞因子，其中便包含VEGF、SCF、IL-6等。而實驗表明VEGF、SCF、IL-6可直接作用于CD34細胞，誘導CXCR4的表達。盡管AMI后心肌局部SDF-1表達增多，但由于基質(zhì)金屬蛋白酶、中性蛋白酶等的作用，血液及骨髓局部中SDF-1卻是降低的，SDF-1的下降，也可使其配體CXCR4相對上調(diào)，這些情況更有利于干細胞的動員，而不利于動員出的干細胞再回歸于骨髓中。

心肌局部表達SDF-1升高是短暫的，AMI后7d便降低，同時自體骨髓干細胞動員也僅限于急性期，長期冠心病對EPCs的數(shù)量與功能是有損害的，這也是依靠機體自身的代償起不到治療作用的原因之一。但是可以利用SDF-1與CXCR4相互作用來干預(yù)治療。動物試驗表明，轉(zhuǎn)染SDF-1基因或直接注射SDF-1，均能提高局部SDF-1的水平，促進自體或移植的EPCs歸巢增強局部血管生成。國內(nèi)學者進行動物試驗表明應(yīng)用G-CSF或他汀類藥物，均能大幅提高心肌梗死后外周血中EPcs的數(shù)目，促進梗死區(qū)血管再生。而且有報道表明G-csF在體內(nèi)能間接引起EPcs的cxcR4表達上調(diào)。相反，用相應(yīng)抗體阻斷cxcR4的表達后，治療AMI的作用明顯降低。因而圍繞sDF-1與cxcR4相互作用，如何提高AMI后自體或移植的EPCs的cxCR4表達，如何提高AMI后心肌局部的SDF-1的表達，從而促進AMI后EPCs的血管生成作用，將是一個較有前景的治療方法。