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摘要:目的：研究如何提高體外培養人牙周膜細胞（hPDL）的成功率，為簡便、快速地獲得大量成活率高的hPDL膜細胞，建立體外細胞模型提供一定的實驗方法。方法：利用3種不同方法（組織塊法、酶消化組織塊法、全牙消化法）進行牙周膜細胞的原代培養，用形態學、免疫細胞化學染色等方法鑒定細胞來源；通過生長曲線的測定研究體外細胞生長特性。結果：3種方法獲得的細胞形態和生物學行為大致相同；波絲蛋白抗體染色陽性，角蛋白抗體染色陰性。組織塊法培養的細胞同源性好，但初代培養時間長；全牙消化法的原代培養成功率高于其他2種方法。結論：通過對牙周膜細胞培養方法的改良，可以顯著提高hPDL原代培養的成功率。

關鍵詞:牙周膜細胞培養免疫組織化學

細胞體外分離培養是研究復雜的生物系統的重要手段，細胞培養條件下，將細胞從復雜的體內環境轉移到較為簡單的體外環境，可對細胞學研究中的變量進行分離和控制。上世紀70年代以來，國外學者對牙周膜細胞（PeriodontalLigamentCellsPDL）分離純化進行了大量的探索和研究，且成功地從猴、豬、人等牙周膜分離培養出牙周膜細胞［1～3］。人牙周膜細胞（hPDL）分離培養主要有酶消化法和組織貼塊法［4］。國內外學者對這2種方法評價不一，并且在這2種方法的基礎上進行改進提出了酶消化組織塊法和全牙消化法［5］。對組織塊法、酶消化組織塊法和全牙消化法這3種方法做了一些比較，以尋求hPDL體外培養的最佳方法。

1、材料和方法

1.1試劑及主要實驗儀器設備

α-MEM培養液（Hyclone，USA），膠原酶（TypeI，Sigma，USA），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（配成0.25%,過濾分裝，冷凍保存），青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/L；SABC免疫組織化學試劑盒（武漢博士德），角蛋白抗體及波絲蛋白抗體（武漢博士德），二氧化碳恒溫培養箱，倒置相差顯微鏡，血球計數板。

1.2方法

1.2.1組織塊法培養hPDL

（1）取材：選擇健康青少年（12～18歲）正畸拔除的健康的雙尖牙，超凈工作臺內用刀片仔細刮除附著牙齦及根尖組織，用D-Hanks液沖洗3次；（2）無菌處理：將牙冠浸入5.25%次氯酸鈉溶液中2min，再用含高濃度雙抗的D-Haks液沖洗2遍。按照司徒鎮強［6］傳統組織塊培養法進行原代培養；（3）傳代：細胞匯合至培養瓶80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化傳代。

1.2.2酶消化組織塊法培養hPDL

酶消化組織塊法原代培養在取材、無菌處理上與組織塊法相同。刮下根中2/3的牙周膜后，不剪，移入離心管內。0.1%膠原酶37℃消化30min，其中，每5min振蕩1次，當肉眼觀察到培養液略混濁，顯微鏡下見組織塊松散時，離心，棄上清液，用含血清及雙抗的培養基漂洗1次后棄上清液，收集組織塊，將組織塊平鋪于培養瓶底，翻轉培養瓶，向內加入4ml培養液，置CO2培養箱孵育2h，使組織塊貼壁，再翻轉培養瓶培養；傳代與組織塊法相同。

1.2.3全牙消化法培養hPDL

全牙消化法原代培養牙周膜細胞取材、無菌處理與組織塊法相同。將牙齒放入裝有0.1%膠原酶的青霉素小瓶內，牙根向下，使消化液浸沒牙根，37℃溫箱內消化1h，用吸管充分吹打牙根表面，加入等量含血清的培養基，離心，棄上清液，加入3ml培養基（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100mg/L）吹打形成細胞懸液，移入25ml培養瓶內，置CO2培養箱內進行培養，3d換液1次，待細胞鋪至瓶底80%時用0.25%胰蛋白酶1∶2消化傳代。

1.3細胞的生長情況觀察

1.3.1倒置相差顯微鏡連續觀察細胞原代和傳代生長情況。

1.3.2HE染色

取生長狀態良好的第5代細胞進行爬片，用蘇木精-伊紅染色，觀察細胞形態。

1.3.3細胞免疫化學染色

將培養的第3代hPDL接種于置有蓋玻片的培養瓶中，按常規SABC法操作，進行波絲蛋白抗體、角蛋白抗體染色，光鏡下觀察染色情況。

1.3.4描繪細胞生長曲線

取3塊24孔板，分別取3種方法培養的第5代細胞，調整細胞濃度為1×104個/ml接種于24孔板，每孔100μl，CO2培養箱內培養4h后每孔加0.5ml培養液繼續培養，每天每組各取3孔的細胞作細胞計數，連續觀察8d，繪制細胞生長曲線。

2、結果

2.1形態學觀察3種方法培養的hPDL形態學上無太大區別，均呈長梭形或星形，胞突細長，胞體豐滿，胞漿均勻，中央有圓形或橢圓型的胞核，細胞呈放射狀、漩渦狀排列（見圖1～3）。HE染色胞核嗜堿性，胞漿嗜伊紅（見圖4）。

2.2免疫組織化學鑒定結果免疫組織化學實驗顯示細胞波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源（見圖5、圖6）。

2.33種方法培養的hPDL生長情況

2.3.1組織塊法

牙周膜組織塊經靜置貼壁后，一般8～16d組織塊邊緣有細胞開始游出，以組織塊為中心成放射狀、漩渦狀生長，生長的細胞以1∶2傳代培養，最初5代的細胞3～5d即可長滿培養瓶底，生長狀態較活躍，核分裂相多見；6～12代細胞，7～10d匯合，細胞增殖穩定。本實驗用組織塊法培養牙周膜細胞培養了20例，成功1例，成功率5%。

2.3.2酶消化組織塊法

用此方法所培養的20例中，有4例在5～10d內觀察到細胞游出，2例傳代成功。細胞以組織塊為中心呈放射狀排列生長。傳代后的細胞生長旺盛，狀態良好，原代培養成功率為10%。圖1組織塊周圍長出的牙周膜

2.3.3全牙消化法

最初消化下來的細胞為圓形，呈懸浮狀態。24h后細胞開始貼壁，48h后幾乎全部貼壁。貼壁后的細胞2～3d開始伸展變形，多數細胞形態呈長梭形或星形，少數呈扁平多角形。從第6天起，細胞生長加速，長梭形及星形細胞增殖活躍，多角形細胞生長相對較緩慢，細胞大約經歷12d后開始形成單層，長梭形細胞占絕對優勢。細胞傳至2～3代時可基本去除上皮樣細胞，4～10代細胞生長狀態較好，核分裂相多見，3～5d可長滿培養瓶底。用此方法原代培養20例，有4例傳代成功，成功率20%。

2.4細胞增殖情況及生長曲線從第5代牙周膜細胞的增殖數和生長曲線可以看出，3種方法培養的細胞增殖速度相近，生長曲線相似，均呈S型（見圖7）。

3、討論

原代培養是從供體獲取組織后首次培養，主要應用酶消化法和組織塊培養法，這2種方法在國內外均有人采用，而且采用的組織比較廣泛，迄今為止，人們相繼利用豬、猴、牛等多種動物和人的拔除牙齒來培養牙周膜細胞［1～3］。國內學者多采用組織塊法。上世紀70年代初，Arnold首先系統研究了組織塊法培養PDL和其生長特點［7］。國內在這方面的研究起步較晚，最初在上世紀90年代報道了用組織塊法培養hPDL，目前對培養的方法正在不斷完善和改進［8］。

本實驗采用3種方法對PDL原代培養，其中，組織塊法培養的hPDL，原代培養時間較長，細胞傳代顯示，最初5代的細胞3～5d即可長滿培養瓶底，生長狀態較活躍，分裂相多見；6～12代細胞，7～10d匯合，細胞增殖穩定，可為實驗提供足量的細胞，適于進行細胞形態、功能、生理、生物化學、分子生物學等多方面的實驗。12～20代，細胞10～15d長滿瓶底，細胞增殖速度下降，營養狀況不佳，胞漿內出現顆粒和空泡，細胞趨于老化。雖然這種方法原代培養操作簡便，細胞同源性好，但并非每塊組織都有生長能力，組織塊法原代培養成功率5%，培養的成活率較低，到可傳代的時間較長。酶消化組織塊法，即將不經切割的牙周膜先用酶消化使組織略松散，進行培養。在實際操作中發現，從根中2/3刮取到的牙周組織塊已經較小，為了最大限度地利用組織，減小損傷，將不經切割的牙周膜直接用酶消化，以去除部分妨礙細胞生長的基質和纖維［9］。此種方法雖然減少了牙周膜被反復剪切而導致組織塊的損傷，但刮取的過程中對牙周膜組織已經造成了機械性損傷，組織塊成活率也較低，本實驗成活率為10%。

利用全牙消化法可減少刮取組織塊時的機械損傷，最初消化下來的細胞為圓形，呈懸浮狀態。24h后圓形細胞開始貼壁，48h后幾乎全部貼壁。貼壁后的細胞伸展變形較慢，約貼壁后2～3d開始伸展變形，多數細胞形態呈長梭形或星形，少數呈扁平多角形。從第6天起，細胞生長加速，長梭形及星形細胞增殖活躍，多角形細胞生長相對較緩慢，細胞大約經歷12d后開始形成單層，長梭形細胞占絕對優勢。細胞傳至2～3代時可基本去除上皮樣細胞，4～10代細胞生長狀態較好，核分裂相多見，3～5d可長滿培養瓶底；本實驗用此方法成功率20%。

3種方法培養的hPDL經穩定傳代后均為長梭形成纖維細胞，免疫組織化學實驗顯示，細胞角蛋白染色陰性，波形絲蛋白染色陽性，說明傳代培養的細胞均來自中胚層的成纖維細胞。細胞經穩定傳代后，細胞的增殖速度相近，生長曲線很相似，說明細胞的生長特性無太大區別。通過對3種培養方法的比較發現，除細胞的初代培養時間和細胞純化程度3種方法差別較大之外，細胞的其他特性無明顯區別。實際應用中，組織塊法培養hPDL適用于細胞純度要求較高的實驗，而全牙消化法培養hPDL適用于短期內獲得大量細胞的實驗；因本實驗例數較少以及實驗條件等原因，對體外培養hPDL的最佳實驗方法仍需作進一步的探索及改進。

參考文獻：

［1］ArnoldLF,BaramP.Invitrocultureofperiodontalligamentcells［J］.DentRes,1972（4）:953-959.

［2］BrunetteDM,KanozaRJ,MarmaryY,etal.Interactionsbetweenepithelialandfibroblast-likecellsinculturesderivedfrommonkeyperiodontalligament［J］.CellSci,1977（27）:127-130.

［3］HuardTK,ArnoldLF,BaramP.Cultivationofperiodontalligamentfibroblastsondentalimplantmaterialsandenzymaticallydebridedteeth［J］.DentRes,1974（6）:1368-1376.

［4］RagnarssonB,CarrC,DanielJC.Isolationandgrowthofhumanperiodontalligamentcellsinvitr［J］.DentRes,1985（64）:1026-1030.

［5］王健平,隋曉梅.組織塊法和酶消化法培養人牙周膜細胞［J］.黑龍江醫藥科學,2002（6）:4-6.

［6］司徒鎮強,吳軍正.細胞培養［M］.西安:世界圖書出版公司西安公司,1996.63-71.

［7］AdamsAM,SoamesJV,SeralRF.Culturalandmorphologicalcharacteristicsofhumanperiodontalligamentcellsinvitro［J］.ArchOralBiol,1993（38）:657-662.

［8］趙桂芝,吳軍正,陳建元.人牙周膜成纖維細胞的分離培養及其生物學特性的探討［J］.實用口腔醫學雜志,1994（3）:189-191.

［9］湯楚華,施生根.酶消化組織塊法原代培養人牙周膜成纖維細胞的初步研究［J］.中華醫學雜志,2004（8）:656-658.