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[摘要]目的研究烏蕨總黃酮體外抗氧化活性。方法采用分光光度法，測定烏蕨總黃酮對羥自由基、脂質(zhì)過氧化的清除能力、總還原力和總抗氧化作用，并通過多元線性回歸分析，考察了烏蕨總黃酮含量及其體外抗氧化活性的相關性。結果烏蕨總黃酮具有較強的抗氧化性能、自由基清除能力和一定的還原力，可有效抑制脂質(zhì)過氧化，且抗氧化作用與烏蕨總黃酮含量呈正相關。結論烏蕨總黃酮具有顯著的抗氧化活性，黃酮類化合物可能是其抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎。

[關鍵詞]烏蕨;總黃酮;抗氧化

烏蕨[Stenolomachusanum(L.)Ching]為鱗始蕨科植物烏蕨的全草，又名野雞尾、金花草、中華金粉蕨，具有清熱、解毒、利濕、止血的功效[1]。其主要含有芳樟醇、松油醇和香葉醇等揮發(fā)性成分以及木犀草素、牡荊素等黃酮類化合物[2~4]。據(jù)報道，烏蕨具有抑菌、護肝、止血、解毒等作用，且安全，無毒副作用[5~7]。目前國內(nèi)研究主要集中在烏蕨抗菌作用，筆者未見對其抗氧化作用的報道。為了合理利用該植物資源并確定其主要抗氧化活性成分，筆者對其進行了體外抗氧化研究，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器BS224S精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，KQ-5000超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2試藥烏蕨藥材于2008年10月采自杭州九溪，經(jīng)熊耀康教授鑒定為烏蕨[Stenolomachusanum(L.)Ching]的地上部分，陰干，粉碎，備用。蘆丁標準品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:100080-20030);大豆卵磷脂購自Sigma公司(批號:F20070207);其他試劑均為分析純。

2方法

2.1烏蕨提取物的制備定量稱取烏蕨干燥粗粉10g，加16倍量含0.1%鹽酸的60%乙醇回流提取4h，提取1次，提取液減壓濃縮至含醇量約10%抽濾，除去雜質(zhì)，加60%乙醇定容至100mL，作為供試品溶液，備用。參照文獻[8]，經(jīng)測定其總黃酮含量為11.89%。

2.2抗氧化活性實驗[9~11]

2.2.1磷鉬絡合物法總抗氧化活性的測定在5mL具塞試管中加入供試品溶液適量，加試劑液4mL，加純化水定容至5mL，加蓋，混勻，置95℃水浴反應30min，冷卻后，以純化水作空白，于695nm波長下測定其吸光度。

2.2.2還原力測定取供試品溶液適量，加入磷酸緩沖液(0.2mol·L-1，pH6.6)1.5mL及1%鐵氰化鉀溶液1mL，50℃保溫20min后，加入10%三氯乙酸溶液1mL，混勻，加純化水2.5mL及0.1%三氯化鐵溶液0.1mL。在700nm處測定反應液吸光度值。吸光度值越大，表示還原力越強。

2.2.3脂質(zhì)體氧化法將大豆卵磷脂分散于去離子水中，20kHz超聲波處理30min，周圍以冰水冷卻，制得大豆磷脂濃度為0.8%的人工脂質(zhì)體。取脂質(zhì)體1mL，加入供試品溶液適量，以10mmol·L-1乙酸銅溶液20μL催化氧化反應，混勻后放置于回轉(zhuǎn)式恒溫水浴振蕩器上，于暗處37℃、100r·min-1進行開口氧化，每隔一定時間，取氧化液0.5mL，加純化水至5mL，于235nm處測定其吸光度，以摩爾消光系數(shù)ε=26000(mol)-1·L·cm-1計算脂質(zhì)體體系中共軛二烯氫過氧化物的生成量。

2.2.4抗羥自由基(·OH)作用實驗在5mL具塞試管中加Tris-HCl緩沖液1.0mL，加入供試品溶液適量、亞甲基藍溶液1.0mL、過氧化氫溶液0.50mL、硫酸亞鐵溶液0.50mL，加純化水稀釋至刻度。用直徑1cm比色皿，以純化水作空白，于663nm波長處測定吸光度(A)，其清除率可用下式計算:

A樣:加入清除劑后測得的反應體系吸光度值;A未損:指示劑本身的吸光度值;A損:未加清除劑時反應體系吸光度值。

3結果

3.1烏蕨總黃酮體外抗氧化活性見表1。樣品還原力和總抗氧化值均以吸光度(A)值表示。

由表1可見，烏蕨總黃酮具有較強的抗氧化活性，可提高羥自由基的清除率，抑制卵磷脂氧化產(chǎn)物的生成。

3.2烏蕨總黃酮與抗氧化活性相關性分析以羥自由基清除率(X1)、還原力(X2)、CD抑制率(X3)和總抗氧化值(X4)為橫坐標，烏蕨總黃酮含量(Y)為縱坐標，采用SPSS13.0軟件對表1結果進行線性關系考察，得方差分析表(表2)和回歸標準殘差正態(tài)P-P圖(圖1)。

由表2和圖1可知，P<0.01，自變量(Xn)與因變量(Y)服從正態(tài)分布，證明烏蕨總黃酮含量與抗氧化活性之間存在顯著的線性關系。進而對其進行多元線性回歸分析，得回歸系數(shù)分析表(表3)。

在95%可信區(qū)間內(nèi)，線性相關系數(shù)r=0.9995。

證明回歸方程真實、可靠，具有統(tǒng)計學意義。可用于替代實驗點對實驗結果進行分析。

由此得擬合方程:Y=-17.453+11.015X1+36.458X2+35.917X3+12.790X4，經(jīng)標準化后，擬合方程:Y=0.152X1+0.410X2+0.391X3+0.048X4。

4討論

自由基是生物體生化反應的普遍介質(zhì)。現(xiàn)代研究表明，許多疾病如心腦血管疾病、肝硬化、癌癥以及人體衰老等過程都與自由基的作用有關[12]。目前在醫(yī)療和食品領域使用較多的是合成抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)等，對生物體有潛在的毒副作用。黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，具有抗衰老、增強機體免疫力等多種藥理活性作用。其主要通過酚羥基與自由基進行抽氫反應生成穩(wěn)定的半醌自由基，從而中斷鏈式反應，達到抗氧化作用，且高效、低毒[13~15]。因此，越來越受到國內(nèi)外醫(yī)藥工作者的重視。

本實驗表明，烏蕨總黃酮具有較強的還原力、抗脂質(zhì)體氧化和清除自由基等作用，且隨提取液濃度的增加，其抗氧化性能逐漸增強，兩者在6~42mg·mL-1濃度范圍內(nèi)均呈正相關。因此，筆者推斷黃酮類化合物可能是其抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎。

作為臨床常用的心腦血管輔助治療藥物蘆丁，無論在清除自由基、還原力，還是在總抗氧化作用等方面，體外抗氧化作用均不及烏蕨總黃酮。一方面，蘆丁作為黃酮苷類，其水溶性大大增加，有利于其捕捉溶劑體系超負氧離子，但同時，3-OH也是黃酮類成分抗氧化活性的必需基團，而蘆丁3位成苷，降低了整個分子的共平面性[16]，而烏蕨總黃酮是由多種黃酮類化合物組成的復合體，具有協(xié)同作用，因此，體外抗氧化作用強于蘆丁。

但其活性成分有待進一步研究，以期為該植物資源的開發(fā)利用及其藥理作用機制的研究提供參考。