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摘要:本文針對(duì)植物組織培養(yǎng)中常見(jiàn)的褐變現(xiàn)象,詳細(xì)地分析了其產(chǎn)生的機(jī)理及影響因素,并提出了相應(yīng)的對(duì)策,為科研和生產(chǎn)提供了一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。

關(guān)鍵詞:植物組織培養(yǎng)，褐變，對(duì)策

目前，在許多植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，常遇到褐變問(wèn)題。褐變主要發(fā)生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)中也經(jīng)常發(fā)生。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細(xì)胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對(duì)許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)與分化，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡。本文探討植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的影響因素、機(jī)理及防范措施，對(duì)我們進(jìn)行科學(xué)研究或工廠生產(chǎn)，包括植物組織的培養(yǎng),原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞和植物器官的培養(yǎng)都有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1褐變產(chǎn)生的影響因素

影響植物組織培養(yǎng)褐變的因子是復(fù)雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等不同，褐變的程度也有所不同。

1.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養(yǎng)中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質(zhì)含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關(guān)。

1.2外植體部位及生理狀態(tài)外植體的部位及生理狀態(tài)不同其褐化程度不同，同時(shí)，不同時(shí)期和不同年齡的外植體在培養(yǎng)中褐變的程度也不同。

1.3培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分中的無(wú)機(jī)鹽、蔗糖濃度、激素水平等對(duì)褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系。

1.4培養(yǎng)條件溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng)，均可加速被培養(yǎng)組織的褐變。不利環(huán)境條件都能造成細(xì)胞的程序化死亡，溫度是誘導(dǎo)程序化死亡的主要因素[1]。

2褐變產(chǎn)生的機(jī)理

2.1非酶促褐變

非酶促褐變是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等[1]將生長(zhǎng)正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培養(yǎng)基中，組織周?chē)绕涫墙佑|培養(yǎng)基部分發(fā)生褐變，但培養(yǎng)基中沒(méi)有看到擴(kuò)散的褐化物質(zhì)。當(dāng)溫度升高時(shí)繼代保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)發(fā)生此類現(xiàn)象。但這種褐變?nèi)舨扇∵m當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了[3]。

2.2酶促褐變

目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變?nèi)缤话愕拿复俜磻?yīng)，其發(fā)生必須具備三個(gè)條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過(guò)程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來(lái)看，表明PPO活性的高低是引起培養(yǎng)材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒(méi)食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質(zhì)都是PPO的底物。

在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時(shí)存在并不發(fā)生褐變，是因?yàn)樵谡５慕M織細(xì)胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細(xì)胞的液泡內(nèi)，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時(shí)，則為酶創(chuàng)造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進(jìn)行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，最后形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變。

3防止外植體產(chǎn)生褐變的對(duì)策

從理論上講,酶促褐變可以通過(guò)以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質(zhì)——氧；二是捕捉或減少聚合反應(yīng)的中間產(chǎn)物；三是抑制有關(guān)的酶。實(shí)際操作上，下列措施是被認(rèn)為行之有效的。

[NextPage]3.1適當(dāng)外植體的選擇

取材時(shí)應(yīng)注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴(yán)重。冬季的芽不易生長(zhǎng)，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無(wú)菌苗不同組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)表明，莖最容易誘導(dǎo)出愈傷組織，培養(yǎng)2周后長(zhǎng)出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導(dǎo)出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)出的愈傷組織全部褐變。

3.2對(duì)外植體的處理

通過(guò)對(duì)較易褐變的外植體材料的預(yù)處理能減輕醌類物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時(shí)，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，使組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中。若仍有酚類物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基2-3次，當(dāng)外植體的切口愈合后，酚類物質(zhì)減少，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預(yù)處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導(dǎo)率。

3.3適宜的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的成分與褐變程度有關(guān)，要考慮所選培養(yǎng)基的狀態(tài)和類型。

3.3.1適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹(shù)組織培養(yǎng)防止褐變所進(jìn)行的試驗(yàn)中，4種培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果最好，MS的效果較差，結(jié)果證明低濃度的無(wú)機(jī)鹽可促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對(duì)玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現(xiàn)象加重。

3.3.2適當(dāng)和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時(shí)，愈傷組織較堅(jiān)硬，增殖緩慢，易產(chǎn)生褐變。培養(yǎng)基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時(shí)，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。

3.3.3培養(yǎng)基的硬度在一定范圍內(nèi)，瓊脂用量大，培養(yǎng)基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)的擴(kuò)散速度的緣故。

3.3.4培養(yǎng)基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來(lái)水,褐變嚴(yán)重,甚至?xí)霈F(xiàn)褐變死亡[8]。這可能是配制培養(yǎng)基的水改變了培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。

3.3.5培養(yǎng)基的pH值在水稻體細(xì)胞培養(yǎng)中，pH值為4.5-5.0時(shí)MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時(shí)，愈傷組織嚴(yán)重褐變[9]。一般來(lái)說(shuō)，酸性環(huán)境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過(guò)程的發(fā)生[10]。

3.3.6培養(yǎng)條件如溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng)，光照會(huì)提高PPO的活性，促進(jìn)多酚類物質(zhì)的氧化，從而加速被培養(yǎng)的組織褐變。高濃度CO2也會(huì)促進(jìn)褐變，其原因是環(huán)境中的CO2向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，細(xì)胞內(nèi)CO32-增多，CO32-與細(xì)胞膜上的CO32-結(jié)合，使有效CO32-減少，導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)瓦解，酚類物質(zhì)與PPO相互接觸，產(chǎn)生褐變[11]。因此，初期培養(yǎng)要在黑暗或弱光下進(jìn)行。

3.4添加褐變抑制劑和吸附劑

褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養(yǎng)基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過(guò)程均為消耗性的，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對(duì)外植體無(wú)毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細(xì)胞的培養(yǎng)基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結(jié)合，從而降低了其活力。陳學(xué)森等[13]在對(duì)植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用的研究中也證實(shí)了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一種吸附性較強(qiáng)的無(wú)機(jī)吸附劑，能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物在培養(yǎng)過(guò)程中分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強(qiáng)，一般在培養(yǎng)基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過(guò)程中應(yīng)注意，盡量用最低濃度的活性炭來(lái)對(duì)抗褐變的產(chǎn)生，因?yàn)榛钚蕴康奈阶饔檬菦](méi)有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時(shí)，也會(huì)吸附培養(yǎng)基中的其他成分，對(duì)外植體的誘導(dǎo)分化會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細(xì)胞器的保護(hù)劑，可用于防止褐變[15]。

3.5進(jìn)行細(xì)胞篩選和多次轉(zhuǎn)移

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)常進(jìn)行細(xì)胞篩選，可以剔除易褐變的細(xì)胞。在外植體接種1-2天后應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，能減輕酚類物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問(wèn)題。

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