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摘要：實驗研究了不同種類、不同濃度的植物生長調節物質組合和其他四種理化因子對長春花懸浮培養細胞生長的影響。以前的實驗結果表明：單因子以2，4-D效果最好。其中以2，4-D的最佳濃度為0.5mg/L。而本次實驗的結果表明:組合因子比單因子更有利于細胞的生長，以0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA為最佳。在其它的四種理化因子中，1/2MS、MS和B5培養基有利于細胞的生長。蔗糖的最佳濃度為30g/L；葡萄糖在研究范圍內隨著濃度的增加，生長速度也在增加。最適于長春花的PH值為5.0-5.4。

關鍵詞：長春花細胞懸浮培養植物生長調節物質理化因子

一、引言

長春花（Catharanthusroseus(L.)G.Don）屬于夾竹桃科（Apocynaceae）長春花屬[1]。為多年生草本。原產于非洲東南部，現在我國各地均有栽培。長春花用途廣泛，主要含具有抗腫瘤作用的生物堿——長春堿和長春新堿等[2]。長春花組織和細胞培養的研究已經有很多年，多數應用于大量細胞生產和植物的再生，以成分分析、提取為主，應用于次生代謝產物的提取卻很少[3]。

長春花的懸浮培養的就是植物細胞工業化的必經步驟和固體培養基相比，細胞懸浮培養具有繁殖速度快、能大規模培養和提供大量均勻一致的植物細胞培養物的特點。然而長春花細胞的懸浮培養技術并不完善，在國內外很少有此類報道。懸浮細胞培養受到許多外界條件的影響。如激素、溫度、光照、營養、PH值等。本文就這方面選取了不同的植物生長調節物質種類、濃度組合以及其他的四種理化因子來培養懸浮細胞，以便獲得細胞快速增殖的最佳培養條件。

二、材料與方法

1．材料

長春花（Catharanthusroseus(L.)G.Don）取自中科院武漢植物園

2．愈傷組織的誘導

取春天4月份的長春花幼嫩的葉片，為誘導及大量繁殖，必須對外植體進行挑選[4]，用自來水沖洗1-2個小時，濾紙吸干，用75%的酒精侵泡30S后，用0.1%的升汞消毒8min，無菌水沖洗數遍。切成0.5cm×0.5cm的小塊。接種于含0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA（本文所用的生長調節劑購于上海，配成1mg/mL的母液）、瓊脂7g/L、蔗糖30g/L的MS固體培養基上（PH=5.8，高壓滅菌）在光強為40umol/ms12-14h/d.溫度為25±2℃條件先誘導[5]。

3．愈傷組織的篩選及細胞懸浮系的建立[6]

誘導出的愈傷組織接種于含50ml固體培養基的150ml的三角瓶中，每瓶的接種量約3g。愈傷組織每25天繼代一次。經3-5次繼代后，選擇生長均一、質地疏松、分散性好的愈傷組織轉入液體培養基中。每150ml三角瓶中分裝40ml的液體培養基（同上的固體培養基去掉瓊脂，以下的實驗沒有特別說明的都是該種培養基）。每次接種量約為2g。懸浮培養采用旋轉式搖床，轉速為120r/min。置于光照下培養。

4．細胞干重的測定

細胞懸浮周期為25天。培養結束后，經減壓過濾后測其鮮重。然后收集培養物置于60℃烘箱中烘干至恒重稱其干重。換算成每天每升培養基增加的細胞干重毫克數，即mg/Ld.表示細胞的生長速度。實驗重復三次，取其平均值計算結果。

三、結果與討論

1．激素組合對長春花細胞懸浮培養生長的效應

（1）2，4-D和6-BA組合對培養細胞生長的效應

表42，4-D和NAA組合對培養細胞生長的效應

2，4-D（0.5）+6-BAx（mg/L）

0.05

0.1

0.2

0.5

1.0

2.0

5.0

干重增加（mg/L）

2352

5008

8200

10109

6095

5832

4000

生長速度（mg/Ld）

95

201

328

405

244

234

160

由表4可以看出，2，4-D和6-BA組合使用比單獨一種更有利于細胞的生長。當組合中6-BA在0.05-0.5范圍內，細胞生長速度隨著濃度的增加而增加。在0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA時，細胞的生長速度最快。而在6-BA在0.5-2.0mg/L時，隨著6-BA的增加，其生長速度不斷地下降。

（2）2，4-D、NAA和6-BA組合對培養細胞生長的效應

表52，4-D、NAA和6-BA組合對培養細胞生長的效應

2，4-D（0.5）+NAA（0.5）+6-BAx（mg/L）

0.05

0.1

0.2

0.5

1.0

2.0

5.0

干重增加（mg/L）

2503

4313

6532

9205

9826

10294

8653

生長速度（mg/Ld）

101

173

262

369

394

412

347

由表5可以看出：2，4-D、NAA和6-BA三種激素組合時，更有利于細胞培養的生長，且在研究范圍內較單因子有著更明顯的效果。在研究范圍內的最佳濃度為0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA。

2．其他理化因子對長春花懸浮培養細胞生長的效應

（1）不同種類培養基對對培養細胞生長的效應

在長春花細胞的懸浮培養中，分別采取了1/4MS、1/2MS、MS、B5、White、N6六種不同的培養基〔6〕，實驗結果如下：

表6不同種類培養基對對培養細胞生長的效應

培養基種類

1/4MS

1/2MS

MS

B5

White

N6

干重增加（mg/L）

9776

12526

10294

11328

8310

死亡

生長速度（mg/Ld）

392

501

412

454

333

——

由表6可以看出1/2MS、MS和B5培養基對細胞的生長比較適合。而在N6培養基中細胞全部死亡。在不同培養基中的細胞生長的速度情況不同是由于作為氮源的狀態不同，含量不同所造成的。

（2）不同蔗糖濃度對細胞生長的效應

表7不同蔗糖濃度對細胞生長的效應

不同蔗糖濃度（g/L）

10

20

30

40

50

干重增加（mg/L）

死亡

2587

5278

10294

9775

7829

生長速度（mg/Ld）

——

104

212

412

391

314

由表7可以看出，在MS培養基中，隨著蔗糖濃度的升高，生長速度逐漸增大，說明在低濃度時，糖是細胞生長的限制性基質〔7〕。甘煥遠等〔8〕在總結前人和自己的工作的基礎上提出了培養基中蔗糖常常是使培養物生長達到最高的碳源。同時還發現隨著糖濃度的增加會導致干重的增加，而細胞數量并不顯著增加[9]。實驗也證明了蔗糖的濃度為30g/L時，細胞生長最快。低于或高于此濃度，其細胞生長速度都將下降。

（3）不同葡萄糖濃度對細胞生長的效應

表8不同葡萄糖濃度對細胞生長的效應

不同葡萄糖濃度（g/L）

10

20

30

40

50

干重增加（mg/L）

死亡

2150

4415

6040

7281

8801

生長速度（mg/Ld）

——

87

177

242

292

353

由表8和上面兩個示意圖可以看出，在MS培養基中，在實驗所研究的范圍內，隨著葡萄糖濃度的升高，細胞生長速率隨之增加。而且較之于蔗糖相比，增長更明顯。此外還發現葡萄糖下的愈傷組織比蔗糖下的要疏松、均勻而且細小顆粒多。

（4）不同PH值對細胞生長的效應

表9不同PH值對細胞生長的效應

不同PH值

3.8

4.2

4.6

5.0

5.4

5.8

6.2

6.6

干重增加（mg/L）

4734

5948

8597

12808

16741

10294

7224

4636

生長速度（mg/Ld）

190

238

344

513

550

412

289

186

由表9和上面兩個示意圖可以看出：PH值對細胞的生長影響十分明顯。在研究范圍內PH值在5.0-5.4時最適于長春花細胞的生長。PH值過大或過小都對愈傷組織的生長產生明顯的抑制，在整個實驗過程中培養基的PH值在小范圍內呈先降低后升高的變化趨勢[10]，這種變化趨勢主要是由于NO3-和NH4+之間供應和吸收的不平衡[11]。在研究范圍內的最適PH值為5.4。

四、結論

從以上的實驗部分可以看出：不同的理化因子對長春花培養細胞有不同的影響。其中植物生長調節物質是培養基中的關鍵物質，對植物細胞培養起著重要而明顯的調節作用，本實驗的結果也得到了驗證。植物生長調節物質的種類以及濃度對不同的植物有著不同的效果。在長春花細胞的懸浮培養中，組合因子比單因子更有利于細胞的生長，以0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA效果最佳，細胞生長速度最快。從結果可以看出不是植物生長調節物質的濃度越高、種類越多效果就越明顯。對不同的植物應選擇相應的種類和適宜的濃度。另外，不同的培養基在長春花細胞的懸浮培養中也有不同的效果。這主要是由于培養基的組分不同。其中1/2MS、MS和B5這三種培養基較有利于細胞的生長。這可能是由于這三種培養基中的氮元素相對于其他的培養要少一些的原因，而更有利于長春花細胞的生長。蔗糖和葡萄糖是培養基中碳素和能量物質的來源。同時對保持培養基的滲透壓也有重要的作用。但在培養基中糖的含量不宜過高，一般在2-4%為宜。PH值是細胞培養的重要的外界環境，對細胞的生長起著重要的作用，不宜過高也不宜過低，本實驗研究的長春花的最適PH值為5.0-5.4。

參考文獻

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