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【摘要】目的觀察內(nèi)皮細(xì)胞在損傷修復(fù)過程中微絲骨架系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，研究阻斷微絲功能對內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)的影響。方法以培養(yǎng)單層內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，采用免疫熒光染色和3H-TdR摻入法，研究微絲功能對創(chuàng)面愈合及細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果內(nèi)皮細(xì)胞在損傷修復(fù)過程中伴隨微絲特殊而有序的變化。用細(xì)胞松弛素B破壞微絲，可不同程度抑制創(chuàng)面的愈合及細(xì)胞增殖，并呈一定的時間—劑量依賴關(guān)系。結(jié)論微絲功能在內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)過程中起重要作用，可通過直接或間接效應(yīng)影響DNA合成，從而影響修復(fù)過程。

【關(guān)鍵詞】內(nèi)皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合細(xì)胞骨架

Effectsofmicrofilamentsontherepairofendothelialmonolayerswound

【Abstract】ObjectiveToobservethemorphologicalchangesofmicrofilaments，andtoinvestigatethewoundclosureandcellproliferationafterthedisruptionofmicrofilaments.MethodsAninvitrowoundmodel，immunofluorescencemicroscopyand3H-TdRincorporationmethodswereusedinthisstudy.ResultsAspecificandsequentialchangesinmicrofilamentsoccourredduringwoundhealing.WhenthemicrofilamentsweredisruptedwithcytochalasinB，thewoundclosureandcellmigrationweregreatlydelayed.Theendothelialcell3H-TdRincorporationwasalsoinhibited，whichshowedtimeanddosedependentrelationship.ConclusionTheseresultssuggestthatthemicrofilementsystemmightbecriticaltowoundhealing，andthecytoskeletalsystemmightdirectlyorindirectlyparticipateintheregulationofcellproliferationandwoundhealing.

【Keywords】endothelialcellwoundhealingcytoskeleton

創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，許多因素參與了這一過程的調(diào)節(jié)。研究表明，細(xì)胞骨架系統(tǒng)（cytoskeletonsystem）不僅決定細(xì)胞的形態(tài)和運動，還參與控制細(xì)胞的生長、分化及細(xì)胞內(nèi)外的信息傳遞［1］。因此在創(chuàng)傷修復(fù)過程中細(xì)胞骨架系統(tǒng)可能起著重要作用。微絲系統(tǒng)是細(xì)胞骨架的主要成分，本實驗擬采用體外培養(yǎng)單層內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察微絲在損傷修復(fù)過程中的相應(yīng)變化，以及阻斷微絲功能對損傷修復(fù)過程及細(xì)胞增殖的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立參考文獻(xiàn)的方法分離和培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞［2］，以含20％FCS的DMEM（Gibco）液每2d換液1次。創(chuàng)傷模型的建立參考文獻(xiàn)報道［3］，內(nèi)皮細(xì)胞接種在含蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，生長匯合成單層內(nèi)皮細(xì)胞后，去除蓋玻片中央1.5mm內(nèi)皮細(xì)胞，制成創(chuàng)面。用裝有網(wǎng)格測微計的倒置相差顯微鏡觀測創(chuàng)面閉合速度，并計算某時刻創(chuàng)面閉合指數(shù)100×［1-(某時刻創(chuàng)緣間寬度/原始創(chuàng)緣間寬度）］。創(chuàng)緣間距離取3處不同點測量，重復(fù)3次，取平均數(shù)。

1.2細(xì)胞處理內(nèi)皮細(xì)胞生長匯合成單層內(nèi)皮細(xì)胞后，分為實驗組和對照組，每組每種濃度復(fù)設(shè)12孔。實驗組分別在損傷前1h各加入終濃度為0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml和1.2μg/ml的細(xì)胞松弛素B（Sigma公司），對照組加等量的培養(yǎng)基。該藥物于使用前用含20％FCS的DMEM配制，每2d換液1次并加相應(yīng)濃度的細(xì)胞松弛素B。分別記錄不同濃度藥物作用下創(chuàng)面閉合速度和時間，以及不同時刻創(chuàng)面閉合指數(shù)。

1.3微絲的熒光染色分別于損傷前、損傷后不同時間取出培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片進(jìn)行染色。以4％多聚甲醛+TritonX-100固定10min，0.1M甘氨酸處理10min，加rhodamine-phalloidin（1∶20，MolecularProbes）染色40min，PBS沖洗3次×3min，加甘油/PBS（1∶1）封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.43H-TdR摻入量測定用含20％FCS的DMEM懸液以0.2×105/ml細(xì)胞密度接種于24孔板，培養(yǎng)至匯合，換成無血清DMEM培養(yǎng)24h后分為實驗組和對照組，每組每種濃度復(fù)設(shè)12孔。實驗組于損傷前1h每孔加濃度為1.2μg/ml的細(xì)胞松弛素B，而對照組于損傷前后不加藥物，分別于損傷后8h、24h及48h收集樣本。在收集樣本前4h加1μci/孔的3H-TdR。自動液閃爍記錄儀測定樣本3H-TdR的每分鐘脈沖數(shù)（CPM）。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)以(x±s)表示，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t檢驗。

2結(jié)果

2.1單層內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)過程中細(xì)胞形態(tài)及微絲骨架的改變內(nèi)皮細(xì)胞接種至培養(yǎng)板后，4～5d生長匯合成單層內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞呈典型的鵝卵石樣外觀，呈緊密連接，無重疊。此時微絲骨架主要分布在細(xì)胞膜下的致密周圍帶和核旁中央束，見圖1。單層內(nèi)皮損傷后3h左右，內(nèi)皮細(xì)胞開始呈極性鋪展，伸長并向創(chuàng)區(qū)遷移。此時致密周圍帶開始減少，微絲發(fā)生重排，大多朝向創(chuàng)緣呈極性排列，見圖2。24h后致密周圍帶大部分消失，中央出現(xiàn)張力纖維。

圖1正常內(nèi)皮細(xì)胞微絲分布熒光照片

圖2創(chuàng)緣內(nèi)皮細(xì)胞微絲分布熒光照片

2.2細(xì)胞松弛素B引起的微絲骨架改變及對創(chuàng)面閉合的影響當(dāng)以0.2μg/ml細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞時，可使致密周圍帶消失，中央束減少。此時內(nèi)皮細(xì)胞向創(chuàng)區(qū)遷移明顯被遲滯，平均速度為(13.1±4.1)μm/h，而對照組平均速度為(23.3±3.5)μm/h，明顯慢于正常對照組（P<0.05，n＝12）。隨著細(xì)胞松弛素B濃度的增加，創(chuàng)面閉合速度也變慢，對創(chuàng)面閉合指數(shù)的影響呈時間—劑量依賴性，見圖3。當(dāng)以1.2μg/ml細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞時，微絲結(jié)構(gòu)被破壞，并聚集成致密片狀物。此時單層內(nèi)皮細(xì)胞失去緊密鵝卵石樣外觀，出現(xiàn)細(xì)胞間隙，呈不規(guī)則扁平狀。

圖3細(xì)胞松弛素B對創(chuàng)面閉合的時間—劑量依賴關(guān)系曲線

2.3阻斷微絲功能對內(nèi)皮細(xì)胞3H-TdR摻入量的影響損傷后8h，實驗組內(nèi)皮細(xì)胞的3H-TdR摻入量與對照組比較差異無顯著性（P>0.05，n=12）。傷后24h及48h，內(nèi)皮細(xì)胞的3H-TdR摻入量比傷后8h顯著升高（P<0.05，n=12），而以細(xì)胞松弛素B處理的細(xì)胞則表現(xiàn)出明顯的抑制作用，見圖4，與對照組相比，差異有非常顯著性（P<0.01，n=12）。

圖4阻斷微絲功能對損傷單層內(nèi)皮細(xì)胞3H-TdR摻入量的影響與對照組相比，*P＜0.05；

與損傷后8h相比(n=12)，**P＜0.05

3討論

創(chuàng)傷愈合過程是對損傷的一種含有多種細(xì)胞活動的有序反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞是愈合的主要修復(fù)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖及新血管形成是創(chuàng)傷愈合的基礎(chǔ)，許多因子均參與了這個過程的調(diào)節(jié)［1］。內(nèi)皮細(xì)胞的許多功能都與細(xì)胞骨架有關(guān)或通過細(xì)胞骨架介導(dǎo)的［4］。細(xì)胞骨架與細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)分子相互連接而成為細(xì)胞形態(tài)支持、細(xì)胞間黏附、細(xì)胞運動和跨膜信息傳遞的基礎(chǔ)。修復(fù)過程中，調(diào)節(jié)因子如細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞骨架變化對內(nèi)皮細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響修復(fù)過程的調(diào)控。

本實驗以單層內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，研究了內(nèi)皮細(xì)胞在修復(fù)過程中其微絲骨架的形態(tài)與結(jié)構(gòu)變化，并觀察阻斷微絲功能對創(chuàng)面愈合及細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、伸展和增殖伴隨著微絲骨架特殊而有序的改變。伸展和遷移的內(nèi)皮細(xì)胞中致密周圍帶明顯減少，微絲發(fā)生重排，并朝向創(chuàng)緣方向排列。當(dāng)以細(xì)胞松弛素B破壞微絲結(jié)構(gòu)時，可不同程度地抑制創(chuàng)面閉合及細(xì)胞的增殖，并呈一定的時間—劑量依賴關(guān)系。提示：微絲功能在內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)過程中起重要作用，可能通過直接或間接效應(yīng)影響DNA合成，參與修復(fù)過程的調(diào)節(jié)。

微絲系統(tǒng)的重要功能之一是為細(xì)胞間黏附，細(xì)胞與基質(zhì)黏附以及各種細(xì)胞運動提供所需動力［5］，其動力來源于動力蛋白及ATP酶，并需Ca2+、Mg2+的參與。向創(chuàng)區(qū)移行、伸展的細(xì)胞致密周圍帶明顯減少，可能為降低細(xì)胞間緊密連接和細(xì)胞間黏附，減少內(nèi)皮細(xì)胞維持緊密單層細(xì)胞的能力［6］，從而有利于細(xì)胞的運動。而且微絲也發(fā)生重排，從不規(guī)則方向到沿細(xì)胞運動軸向排列，其作用可能是細(xì)胞移行時指引胞體向前牽拉并錨于粘著斑上［7］。細(xì)胞骨架系統(tǒng)對愈合過程中細(xì)胞的分化、增殖可能起重要的調(diào)節(jié)作用。創(chuàng)傷時，內(nèi)源性生長因子、炎性介質(zhì)或其它調(diào)節(jié)因子作用于細(xì)胞膜，通過膜中相應(yīng)受體或蛋白質(zhì)引起細(xì)胞內(nèi)cAMP、IP3以及Ca2+、CaM等第二和第三信使系統(tǒng)鏈鎖反應(yīng)，激活蛋白激酶類［8］，最后調(diào)節(jié)到細(xì)胞骨架系統(tǒng)及其結(jié)合蛋白質(zhì)上，使細(xì)胞骨架系統(tǒng)按細(xì)胞生理和周期的需要，發(fā)揮其獨特的功能，參加細(xì)胞的活動。調(diào)節(jié)因子還可能通過膜表面的整合素（integrin）跨膜與細(xì)胞內(nèi)的微絲系統(tǒng)發(fā)生聯(lián)系［9］，將胞外刺激信號傳給膜下微絲系統(tǒng)，繼續(xù)傳導(dǎo)至核膜及核內(nèi)骨架，調(diào)控基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞的分化、增殖及細(xì)胞行為的改變。因此，對細(xì)胞骨架系統(tǒng)在創(chuàng)傷修復(fù)過程中作用的不斷認(rèn)識，將有助于進(jìn)一步理解創(chuàng)傷愈合過程的調(diào)控機制。

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