導(dǎo)語：糖尿病皮膚潰瘍大鼠分析論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】糖尿病;皮膚潰瘍;轉(zhuǎn)化生長因子β1;大鼠

糖尿病潰瘍是糖尿病的常見并發(fā)癥之一。益氣化瘀中藥治療糖尿病潰瘍?nèi)〉昧肆己茂熜В?］，為進(jìn)一步探討其促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制，開展了本研究。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)2月齡SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量200～250g，平均（223.05±14.91）g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第02222號(hào)。

1.2藥物益氣化瘀方由生黃芪、太子參、桃仁和地龍組成，劑量比例為2.5∶2.5∶1∶1，大鼠的劑量為11.61g/(kg·d)，減壓濃縮至濃度為含生藥2.5g/ml。拆方益氣方由生黃芪和太子參組成，大鼠的劑量為6.75g/(kg·d)，減壓濃縮至濃度為含生藥1.5g/ml。拆方化瘀方由桃仁和地龍組成，大鼠的劑量為4.86g/(kg·d)，減壓濃縮至濃度為含生藥1g/ml［2］。均由上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院制劑室按水煎醇沉工藝制備成煎劑濃縮，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩A性成纖維細(xì)胞生長因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）貝復(fù)濟(jì)，珠海東大生物制藥有限公司產(chǎn)品（批準(zhǔn)號(hào)：國藥準(zhǔn)字S10980077）。

1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1）一抗，SantaCruz公司產(chǎn)品（Sc146），工作濃度1∶80；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，北京中山生物工程公司產(chǎn)品（ZB2301）；化學(xué)發(fā)光底物，Pierce公司產(chǎn)品；NC膜（0.45μm），Millipore公司產(chǎn)品。

1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器RM2145切片機(jī)，Leica公司產(chǎn)品；IMS細(xì)胞圖像分析儀，上海申騰信息技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MVCP410攝像機(jī)，Panasonic公司產(chǎn)品；BH2顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；DYY8C電泳儀、DYCZ24D電泳槽和DYCZ40D轉(zhuǎn)印槽，均為北京六一儀器廠產(chǎn)品；721分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠產(chǎn)品。

1.5糖尿病潰瘍大鼠模型建立實(shí)驗(yàn)前12h禁食，定量飲水。將1％鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）溶液，以60mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射2d。3d后動(dòng)物血糖濃度大于16.7mmol/L及尿糖為（++++）時(shí)，即成糖尿病鼠模型。參照付小兵等［3］全層皮膚缺損法制成動(dòng)物體表潰瘍模型，將糖尿病大鼠用鹽酸氯胺酮（100mg/kg）腹腔注射麻醉后背部備皮，在脊椎兩側(cè)分別作直徑15mm的圓形標(biāo)記，在無菌條件下，用外科方法切除標(biāo)記處全層皮膚，止血后用無菌紗布覆蓋，即成糖尿病潰瘍模型。造模后每只大鼠每日予青霉素40萬U肌肉注射，連續(xù)4d。

1.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法60只大鼠先隨機(jī)抽取10只為正常對(duì)照組；其余50只大鼠建立糖尿病潰瘍模型，成模后再隨機(jī)分為益氣化瘀組、益氣組、化瘀組、貝復(fù)濟(jì)組和模型組。各組于造模后次日開始給藥，換藥前均以1/5000呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面。正常對(duì)照組及模型組外敷單層生理鹽水紗布，生理鹽水灌胃，1次/d；益氣化瘀組、益氣組和化瘀組外敷單層生理鹽水紗布，中藥灌胃，1次/d；貝復(fù)濟(jì)組灌服等量生理鹽水，外敷以貝復(fù)濟(jì)浸透紗布（60U/cm2），按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，然后均在創(chuàng)面上加蓋兩層消毒干紗布，用膠布“豐”字形固定。連續(xù)用藥7d，用藥后第8天，分別將動(dòng)物麻醉（鹽酸氯胺酮），取局部創(chuàng)面新生肉芽組織為所需實(shí)驗(yàn)樣品。

1.7實(shí)驗(yàn)方法

1.7.1免疫組織化學(xué)SP法及圖像分析每組隨機(jī)抽取8個(gè)標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)樣本，取4μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟，PBS沖洗3次，3min/次；3％H2O2室溫20min，PBS沖洗3次，3min/次；檸檬酸鹽緩沖液中微波處理（98℃）2次，10min/次；10%正常血清封閉內(nèi)源性非特異性抗原，室溫30min，一抗4℃過夜，PBS沖洗3次，3min/次；生物素化羊抗兔IgG1∶200，37℃30min，PBS沖洗3次，3min/次；StreptavidinHRP1∶200，37℃30min，PBS沖洗3次，3min/次；DAB顯色8～12min，水洗；蘇木素襯染，水洗，吹干，樹脂封片。顯微鏡下觀察，有棕黃染色者為陽性。采用IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，對(duì)各組免疫組化切片進(jìn)行圖像分析。根據(jù)各組切片中的染色條件，在統(tǒng)一閾值下進(jìn)行。在10倍物鏡下，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，輸入圖像，測定各組在統(tǒng)一光度下陽性細(xì)胞的總面積。

1.7.2Westernblotting法每組隨機(jī)抽取6個(gè)標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)樣本，分別取大約200mg組織制備樣品，提取創(chuàng)面肉芽組織總蛋白，各樣品取30μg上樣，Marker取10μl上樣（上樣前按說明書進(jìn)行預(yù)處理），進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉封閉，分別與特異性的TGFβ1抗體進(jìn)行孵育，充分洗滌后孵育HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體，電化學(xué)發(fā)光，X線攝片。用QuantityOne4.3.1（Biorad）軟件對(duì)照片進(jìn)行掃描分析，測定蛋白表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，以方差分析比較各組間TGFβ1表達(dá)水平的差異。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)法檢測各組創(chuàng)面肉芽組織中TGFβ1的表達(dá)水平模型組TGFβ1表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；益氣化瘀組TGFβ1表達(dá)量高于益氣組、化瘀組、貝復(fù)濟(jì)組和模型組（P＜0.05或P＜0.01），與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組的TGFβ1表達(dá)量也明顯高于模型組（P＜0.01），與貝復(fù)濟(jì)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

2.2Westernblotting法檢測各組創(chuàng)面肉芽組織中TGFβ1的表達(dá)水平模型組TGFβ1表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；益氣化瘀組TGFβ1表達(dá)量明顯高于益氣組、化瘀組、貝復(fù)濟(jì)組和模型組（P＜0.01），與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；益氣組和化瘀組明顯高于模型組（P＜0.01），益氣組和化瘀組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1各組創(chuàng)面TGFβ1的表達(dá)（略）

Table1TGFβ1expressionofskinulcersinratswithdiabetes

*P＜0.05,**P＜0.01,vsuntreatedgroup;△P＜0.05,△△P＜0.01,vsnormalcontrolgroup;▲P＜0.05,▲▲P＜0.01,vsYiqiRecipetreatedgroup;□P＜0.05,□□P＜0.01,vsHuayuRecipetreatedgroup;■P＜0.05,■■P＜0.01,vsbFGFtreatedgroup.

圖1術(shù)后第7天各組大鼠肉芽組織中TGFβ1的表達(dá)水平（SP,×100）（略）

Figure1ExpressionofTGFβ1ingranulationtissueoftheratsinsixgroupssevendaysafterskinlesion(SP,×100）

A:YiqiHuayuRecipetreated;B:YiqiRecipetreated;C:HuayuRecipetreated;D:Untreated;E:bFGFtreated;F:Normalcontrol.

YiqiHuayuRecipetreated;B:YiqiRecipetreated;C:HuayuRecipetreated;D:Untreated;E:bFGFtreated;F:Normalcontrol.

圖2術(shù)后第7天各組6個(gè)大鼠肉芽組織樣本中TGFβ1的表達(dá)水平（Westernblotting）（略）

Figure2ExpressionofTGFβ1ingranulationtissueoftheratsinsixsamplessevendaysafterskinlesion(Westernblotting)

3討論

糖尿病潰瘍的發(fā)生、發(fā)展和變化是“因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正”的過程，其病本虛標(biāo)實(shí)，正氣不足，氣陰兩虛為其本，濕熱互結(jié)，氣血瘀滯為其標(biāo)?！疤摗?、“瘀”是糖尿病患者創(chuàng)面難以愈合的關(guān)鍵。唐漢鈞教授在長期臨床和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，認(rèn)為只有氣血足、瘀滯祛除，才能斷生腐之源，生肌長皮，故以“祛瘀生新”為指導(dǎo)，提出“祛瘀生肌”、“補(bǔ)虛生肌”理論，臨床以益氣化瘀法為主

治療糖尿病取得良好的臨床療效［4］。隨著近年來分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合機(jī)制的研究日趨深入。多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)作用是該過程中的關(guān)鍵因素之一［5］。各種生長因子參與了傷口愈合的調(diào)控，在組織修復(fù)中有決定意義。其中TGFβ的主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的合成及細(xì)胞凋亡，是一類對(duì)創(chuàng)面修復(fù)有重要調(diào)控作用的多功能的生長因子［6］。TGFβ主要分為三個(gè)亞型。遭受創(chuàng)傷后，TGFβ1、2、3的表達(dá)開始增加，其中TGFβ1的表達(dá)時(shí)程變化與微小血管形成有一致性，說明TGFβ1對(duì)血管形成有影響作用。TGFβ2、3的表達(dá)持續(xù)時(shí)間較長，可能參加愈合后期的組織塑性。而主要發(fā)揮增加膠原沉積，加速創(chuàng)傷愈合，同時(shí)促進(jìn)瘢痕形成作用的為TGFβ1。因此，TGFβ1在潰瘍創(chuàng)面組織中含量的變化對(duì)潰瘍發(fā)生和修復(fù)愈合發(fā)揮核心作用，其表達(dá)水平的高低直接關(guān)系到創(chuàng)面愈合的速度和質(zhì)量。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，皮膚傷口愈合包括連續(xù)而又相互重迭的3個(gè)階段，即炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期［7］。傷后第7天，即創(chuàng)傷愈合的中期，是成纖維細(xì)胞增生和膠原合成的高峰期，TGFβ1的含量在此時(shí)也達(dá)到最高值［8,9］。TGFβ1在早中期表達(dá)的升高，對(duì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白、蛋白聚糖、纖維聯(lián)接蛋白和整合蛋白，增強(qiáng)上皮細(xì)胞遷移與成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)鍵性作用，是其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的一個(gè)重要方面［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組創(chuàng)面愈合率較低，愈合時(shí)間較長，并且TGFβ1表達(dá)水平也較低（P＜0.01），提示糖尿病創(chuàng)面難以愈合可能與TGFβ1表達(dá)水平下降有密切關(guān)系。益氣化瘀組、益氣組及化瘀組的創(chuàng)面愈合率較高，愈合時(shí)間短，與模型組相比，創(chuàng)面TGFβ1的表達(dá)明顯增高（P＜0.01），且益氣化瘀組TGFβ1的表達(dá)高于益氣組及化瘀組。因此可以初步證明，在創(chuàng)傷愈合的早中期運(yùn)用益氣化瘀中藥，可能通過上調(diào)TGFβ1的表達(dá)水平而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，且益氣及化瘀中藥也分別有一定程度的作用。結(jié)合TGFβ1促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生和膠原合成的主要生物學(xué)作用，也初步印證了“化瘀生肌”和“補(bǔ)虛生肌”的學(xué)術(shù)理論。益氣化瘀組的治療效果要優(yōu)于益氣組和化瘀組。《醫(yī)林改錯(cuò)》有云：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無力，必停留而瘀?！睔鉃檠獛?，絡(luò)脈空虛，則無力推動(dòng)血行，使氣血運(yùn)行稽遲，瘀血內(nèi)生，或停留于局部而為瘀；瘀血不去，新血不生，正氣無由恢復(fù)，則正氣耗損益劇，兩者互為因果。而益氣法和化瘀法中藥配伍使用，正氣足則瘀滯除，瘀祛則新生，兩者相互為用，其作用更為顯著，體現(xiàn)了中醫(yī)相須配伍的科學(xué)性，是臨床取得療效的關(guān)鍵所在，也體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的精華。

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