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【摘要】探討六味地黃丸含藥血清對單純皰疹病毒核苷激酶/丙氧鳥苷(HSVtk/GCV)系統殺傷小鼠黑色素細胞瘤B16細胞株的增效作用,為提高臨床基因治療腫瘤療效提供新思路。【方法】構建并鑒定惡性黑色素瘤B16細胞HSVtk/GCV治療系統,制備六味地黃丸含藥血清及對照血清,將B16、B16/tk細胞按20%(1∶4)的比例混合制成細胞懸浮液接種于96孔培養板上,分為對照血清組、含藥血清組、對照血清聯合GCV組、含藥血清聯合GCV組,其中含藥血清組及含藥血清聯合GCV組按血清體積分數計又分高(10%)、中(5%)、低(25%)3組,GCV的終濃度為25μmol/L,按分組添加相應的含藥血清,每孔培養液總體積200μL,37℃、體積分數5%的CO2培養箱培養。48h后采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測殺傷效應。采用金正鈞Q值法分析六味地黃丸含藥血清與自殺基因治療系統聯合作用對旁觀者效應是否具有協同性?！窘Y果】MTT實驗表明聯合用藥組對B16細胞的抑制率明顯高于其他組,六味地黃丸含藥血清對B16細胞株HSVtk/GCV系統的增效作用存在量效關系：25%、5%、10%含藥血清聯合20%tk/GCV組的實際抑制率(4875%、5939%、6928%)顯著高于理論抑制率(3813%、3867%、3992%),金正鈞Q值分別為128、154、174,均大于115,具有協同增效作用

【關鍵詞】六味地黃丸/藥理學;自殺基因療法;黑色素細胞/病理學;細胞培養

惡性黑色素瘤被選擇作為腫瘤基因治療的第一個臨床試用目標,經過近20年的摸索已取得了長足的進展,其中自殺基因療法以其獨特的旁觀者效應而備受青睞[1]。目前單純皰疹病毒Ⅰ型核苷激酶(HSV1tk)自殺基因治療轉移性惡性黑色素瘤已應用于Ⅰ/Ⅱ期的臨床研究[2],但仍存在轉染效率低、靶向性不夠、治療載體的毒副作用等問題,使單純自殺基因治療難以完全治愈惡性黑色素瘤。聯合治療是提高自殺基因治療療效的方法之一。前期實驗表明[3]滋陰補腎經典名方六味地黃丸對小鼠移植性惡性黑色素瘤自殺基因治療具有增效作用,本研究擬通過體外實驗進一步論證,在構建黑色素瘤B16細胞HSV1tk自殺基因治療系統的基礎上觀察六味地黃丸對其旁觀者效應是否具有增效作用,現將結果報道如下。

1材料與方法

11實驗動物及細胞SD大鼠,體質量200～220g,雄性,健康,SPF級,廣州中醫藥大學實驗動物中心提供,合格證號：SCXK(粵)20030001,粵監證字：2007A024;小鼠惡性黑色素瘤細胞株B16購于中山大學動物中心細胞庫。

12試劑及耗材細胞培養用RPMI1640粉和25g/L含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶為Gibco公司產品,新生牛血清為奧地利PAA公司產品,青、鏈霉素合劑為杭州吉諾生物醫藥技術有限公司產品,四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、丙氧鳥苷(GCV)均為美國Sigma公司產品,細胞培養用培養板、培養瓶、培養皿、凍存管均為德國Greinerbioone公司產品,一次性微孔濾膜為美國Corning公司產品,2倍TapPCRMasterMix為天根生化科技(北京)有限公司產品,基因組DNA提取試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產品,瓊脂糖粉為美國Amresco公司產品,DNA凝膠電泳指示染料GoldView購自北京賽百盛生物工程技術有限服務公司。

13主要儀器BNA3210型CO2培養箱(日本Espec公司),JH型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠),XDS1B型倒置顯微鏡(重慶COIC公司),680型酶標儀(美國BioRad公司),XYJ801型電動離心機(江蘇省金壇市醫療儀器廠),318K型高速冷凍離心機(德國Sigma公司),JB1型磁力攪拌器(上海雷磁儀器廠新涇分廠),TP600型PCR儀(大連TaKaRa公司),DYY8C型穩流穩壓電泳系統(美國BioRad公司),GenDoc1000型凝膠成像系統(美國BioRad公司),IX71F22FL/PH型圖像采集系統(日本Olympus公司),80210398型紫外分光光度計(英國PharmciaBiotech公司)。

14惡性黑色素瘤細胞HSVtk/GCV治療系統的構建與鑒定

141惡性黑色素瘤細胞HSVtk/GCV治療系統的構建取PT67/tk細胞病毒上清液感染對數生長期的B16細胞,G418抗性篩選陽性克隆命名為B16/tk并擴大培養。

142惡性黑色素瘤細胞HSVtk/GCV治療系統的鑒定提取B16/tk細胞基因組DNA,采用PCR法對tk基因進行鑒定。引物由Invitrogen公司廣州合成部合成,上游引物：5GCAGCAAGAAGCCACGGAAGTC3,下游引物：5GTGTTGTGTGGTGTAGATGTTC3,產物片段：226bp。PCR反應體系：模板DNA05μg、上下游引物(10μmol/L)各025μL、2倍TapPCRMasterMix5μL,用ddH2O補足體積至10μL。PCR循環條件：94℃預變性5min,94℃變性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,30個循環,最后72℃延伸7min。擴增結束后,用20g/L瓊脂糖凝膠進行電泳。

143B16/tk生物活性檢測方法將B16/tk和野生型B16細胞分別以2×103、3×103、5×103個/孔細胞接種96孔板,同時加入不同濃度的GCV使終濃度分別為001、01、1、10、100、500μmol/L,以不加GCV的細胞孔作對照,每一濃度設3個復孔,倒置顯微鏡觀察殺傷效應并攝像。

15GCV工作濃度及tk+比例確定方法將B16/tk和B16按照0%、10%、20%、40%、100%比例混合,分別加入GCV，終濃度為0、625、125、25、50、100、200μmol/L,MTT法檢測殺傷效率。

16對照血清與含藥血清的制備及其對B16細胞生長影響的檢測方法

161血清制備SPF級健康SD大鼠30只,隨機分為六味地黃丸組與對照組,分別灌服六味地黃丸研磨液8mL(含生藥4g)和等容積的蒸餾水,連續灌胃4d,末次給藥后1h腹主動脈取血,制備血清,-70℃冰箱保存備用。

162分組及檢測方法體外實驗設5組(以體積分數計，下同),即10%新生牛血清組，10%對照血清組，25%含藥血清組(75%對照血清和25%含藥血清)，5%含藥血清組(5%對照血清和5%含藥血清)，10%含藥血清組,采用MTT法檢測不同濃度血清對B16細胞生長的影響,酶標儀在570nm波長處測定每孔的光密度(D)值并計算細胞抑制率：p細胞抑制(%)=(1-D測定孔/D對照孔)×100%。

17對照血清與含藥血清對B16細胞株tk/GCV系統增效作用量效關系的檢測方法按B16/tk占總細胞數的20%(1∶4)比例混合B16與B16/tk細胞,設置10%對照血清組，25%、5%、10%含藥血清組，10%對照血清聯合GCV組,25%、5%、10%含藥血清聯合GCV組。采用MTT法檢測各組細胞的抑制率,并采用金正鈞Q值法[4]分析六味地黃丸含藥血清與自殺基因治療系統聯合作用對旁觀者效應是否具有協同性。

18統計學方法采用SPSS130統計軟件處理,各組間實驗數據比較采用兩樣本均數的t檢驗,多組間比較用OneWayANOVA法。

2結果

21惡性黑色素瘤細胞HSVtk/GCV治療系統的構建與鑒定結果

211瓊脂糖凝膠電泳結果以PT67/tk細胞病毒上清液感染的B16細胞,經過抗性篩選后,PCR鑒定結果見圖1,野生型B16細胞組未見條帶,B16/tk組可見一清晰條帶,產物位于200～300bp之間。

212B16/tk生物活性測定結果倒置顯微鏡觀察野生型B16和B16/tk在添加GCV前生長狀態與數目無明顯差異,加GCV后48h觀察,B16/tk的高濃度組(10、100、500μmol/L)大部分細胞出現死亡,表現為胞膜不完整、輪廓模糊、不透亮、形狀不規則、并且碎裂成小粒狀,且密度為2×103/孔時最明顯,1μmol/L組僅見極少數細胞死亡,且細胞發生明顯增殖,其他濃度組及野生型B16細胞組均呈現明顯的細胞增殖。密度為2×103/孔的B16和B16/tk在添加10μmol/LGCV48h后的細胞形態見圖2(彩圖見第556頁)。

22GCV工作濃度及tk+比例的確定結果圖3、圖4(彩圖見第557頁)結果顯示,當GCV濃度達625μmol/L以上時對B16/tk細胞表現出一定的殺傷效應,GCV濃度達100μmol/L以上時對B16有一定的細胞毒性作用,選擇對B16/tk敏感而對B16無細胞毒性的GCV濃度(625~100μmol/L),并且發揮最大殺傷效應的最低GCV濃度作為本實驗的最適GCV工作濃度,故GCV的工作濃度確定為25μmol/L。

40%B16/tk與100%B16/tk組在較低濃度的GCV(625μmol/L)時,就能殺傷幾乎全部細胞(B16/tk與B16),即40%B16/tk細胞混合時比例太高,殺傷效應太強,聯合殺傷沒有發揮的空間;而B16與10%B16/tk組在GCV濃度很高(100μmol/L)時,殺傷效應也很弱;20%B16/tk組則既能觀察到旁觀者效應,又為中藥留有足夠的發揮空間,故后續實驗選用20%B16/tk比例混合組。

23對照血清與含藥血清對B16細胞生長的影響含藥血清孵育前,倒置顯微鏡下觀察各組細胞生長狀態良好,細胞形態與數目無明顯差異,添加相應血清后48h鏡下觀察細胞貼壁穩定,細胞密度高,生長旺盛,含藥血清組細胞數目多于10%新生牛血清組與10%對照血清組。MTT法檢測結果見表1,10%對照血清組與10%新生牛血清組對細胞作用比較差異無顯著性意義(P>005),而六味地黃丸含藥血清各組對細胞有增殖作用(均P<001)。

24各組對B16細胞株HSVtk/GCV系統增效作用量效關系的檢測結果MTT法分析各組的抑制率見表2,含藥血清聯合GCV各濃度組的實際抑制率明顯高于相應濃度的理論抑制率,金正鈞Q值分別為128、154、174,均大于115,具有協同增效作用。表1各組對B16細胞生長的影響(MTT檢測)表2各組對B16細胞株HSVtk/GCV系統

3討論

黑色素瘤是表皮基底黑色素細胞發生的惡性腫瘤,好發于頭頸部,其惡性程度高,容易復發和轉移,預后差。臨床治療以手術切除為主,放療化療效果差[5],基因治療尤其是自殺基因療法給黑色素瘤患者帶來了希望。自殺基因療法即將自殺基因導入腫瘤細胞中,其基因表達產物可選擇性地將低毒或無毒的前體藥物代謝成有毒代謝產物,這些有毒代謝產物通過干擾細胞DNA正常合成而使細胞死亡[6]。自殺基因療法有一個突出的優點“旁觀者效應”(bystandereffect),即導入自殺基因的腫瘤細胞對鄰近的未導入自殺基因的腫瘤細胞具有殺傷作用,近年來備受關注[7]。Bonnekoh等[8]在黑色素瘤自殺基因治療的模型研究中發現,腫瘤體積減少的程度(80%)與轉導效率推測的程度不成比例,考慮到可能是通過旁觀者效應殺傷未導入基因的鄰近分裂細胞,提高旁觀者效應。

HSV1tk/GCV系統是最常用的自殺基因治療系統,旁觀者效應的有無關系到HSV1tk/GCV系統治療的成敗,除極少數細胞株未發現旁觀者效應外,絕大多數細胞株均有旁觀者效應。不同細胞對該系統敏感性的差異,很大程度上與旁觀者效應的強弱有直接關系。如圖4(彩圖見第557頁)示低濃度(625μmol/L)的GCV能殺傷70%以上的100%B16/tk細胞,提示B16/tk具有生物活性,B16細胞株對GCV敏感。但是轉染效率低下卻是臨床上應用基因治療面臨的主要難題,在tk轉染低效率的情況下能獲得較強的旁觀者效應將為自殺基因的應用帶來更廣闊的前景。

為了更好地觀察六味地黃丸對旁觀者效應的增效作用,我們將B16/tk與B16細胞以不同比例混合后檢測其對GCV的敏感性,發現B16/tk所占比例在40%及以上時低濃度的GCV(625μmol/L)即可發揮極強的旁觀者效應,聯合殺傷時中藥沒有發揮藥效的空間;而B16/tk所占比例在10%時高濃度GCV(200μmol/L)也未能顯示出明顯的殺傷效應,可能是10%B16/tk組tk+比例太低,旁觀者效應太弱,另外考慮到B16/tk系統構建時G418篩選后得到的tk+克隆并非單細胞克隆,即實際混合的10%B16/tk可能并未達到10%tk+,也可能是其未能觀察到旁觀者效應的原因之一;20%B16/tk在GCV濃度為25μmol/L時對細胞生長的抑制率為349%,能觀察到一定的旁觀者效應,并且還有足夠的殺傷空間,故此六味地黃丸和自殺基因聯合殺傷藥效學實驗選用20%B16/tk的混合細胞。公務員之家

本研究中采用的中藥血清藥理學方法不僅能反映中藥及其代謝產物的藥理作用,而且能反映可能由藥物誘導機體內源性成分所產生的作用,更接近藥物在體內環境產生的真實過程,對中藥復方的藥理學研究具有明顯優勢。前期研究表明：大鼠血清本身對惡性黑色素瘤B16細胞有一定促生長作用,血清濃度在10%以內時細胞生長狀態較好,隨血清濃度的增高細胞狀態變差。借鑒此結果,本實驗選擇體積分數25%、5%、10%的含藥血清作為工作濃度。無論是細胞培養用牛血清還是含藥血清,其成分復雜,為了減少實驗中的影響因素,本研究在前期工作的基礎上加以改進。在細胞無血清培養的基礎上添加含藥血清,用對照血清作為對照組,含藥血清采用10%總體積,為了排除大鼠血清本身對細胞的影響,藥物血清不足10%者,用大鼠對照血清補足體積。

本實驗結果顯示：與單獨自殺基因組(加對照血清)或單獨含藥血清組比較,聯合用藥明顯提高了對惡性黑色素瘤細胞的旁觀者效應,差異均有顯著性意義(P<001),協同性分析顯示聯合用藥組對惡性黑色素瘤細胞的殺傷作用是一種協同效應(Q>115),這種協同效應可能源于旁觀者效應。旁觀者效應的可能機制有縫隙連接機制、免疫介導機制、細胞凋亡機制、介質機制等。體外實驗無免疫介導機制,可見六味地黃丸可能通過縫隙連接機制或細胞凋亡機制介導旁觀者效應,達到協同增效作用,具體如何調節細胞縫隙連接通訊或細胞周期與凋亡從而增強旁觀者效應還有待于進一步深入研究。

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