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摘要：目的對鄰二氮菲-Fe2+氧化法進行改良，使其在用于自由基清除劑篩選時更為有效和更為敏感。方法在不同的pH環境、不同的保溫時間及不同的測定波長條件下進行對比實驗。結果鄰二氮菲-Fe2+絡合物在pH4.5的環境下及510nm的測定波長時有較大的吸光度，30min的保溫時間使各管有較大并較為穩定的吸光度。結論通過對鄰二氮菲-Fe2+氧化法的實驗改良能提高該方法篩選自由基清除劑的靈敏度。

關鍵詞：自由基清除劑；鄰二氮菲；羥自由基

機體在代謝過程中產生多種自由基，包括超氧陰離子自由基（O-2·）、羥自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等，其中以·OH化學性質最活潑。一定數量的氧自由基可為機體所用，但過多的氧自由基將作用于體內蛋白質、核酸、脂類等生物分子，造成細胞結構和功能受損，進而導致體內代謝紊亂引起疾病。因此，自由基清除劑的合成及尋找成為當前醫藥研究的主要方向之一，而中藥的天然、豐富及低毒更受人們的青睞。目前人們測定自由基清除劑清除羥自由基的方法有很多，其中鄰二氮菲-Fe2+氧化法操作簡單，設備要求不高，易于推廣和應用。本實驗對該方法進行了若干改良。

一、材料與方法

1.1試劑維生素C（鄭州羚銳制藥有限公司生產）、鄰二氮菲（天津市科密歐化學試劑有限公司生產，分析純）、硫酸亞鐵銨（廣東光華化學廠有限公司生產，分析純）、過氧化氫（廣東汕頭市西隴化工廠生產，分析純）、磷酸二氫鉀（上海市國藥集團化學試劑有限公司）、無水乙醇和氫氧化鈉（湖南匯虹試劑有限公司生產，分析純）。

1.2儀器752N紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司生產），DK-600S三用恒溫水浴箱（上海精密實驗設備有限公司生產）。

1.3方法以維生素C作為自由基清除劑，用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應產生的·OH。H2O2/Fe2+體系產生的·OH將鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+，使鄰二氮菲-Fe2+對536nm波長的最大吸收減弱，A536明顯降低。當反應體系中存在·OH清除劑時，此氧化過程受抑制，A536則降低不明顯，并可通過A536值比較·OH清除劑的清除能力［5］。對該實驗進行三個方面的改良：一是將反應環境由pH7.4改為pH4.5的酸性環境；二是將37℃保溫時間由60min改為30min；三是測定吸光度的波長由536nm改為510nm。實驗過程中分別在pH7.4的磷酸緩沖液及pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液的環境下進行對照實驗；在保溫5～60min的時間范圍內、536nm和510nm波長分別測定吸光度，比較兩種pH條件下吸光度的差異。反應中依次加入鄰二氮菲、緩沖液、自由基清除劑維生素C、Fe2+及H2O2為加藥管；不加維生素C為氧化管；不加維生素C及H2O2為對照管。

1.4統計學處理組間采用t檢驗，數據以±s表示。

二、結果

2.1不同測定波長及不同pH環境下的比較從表1可以看出，鄰二氮菲-Fe2+絡合物的最大吸收波長為510nm，而最佳酸堿環境為pH4.5。表1不同測定波長及不同pH環境下的比較(略）

2.2不同保溫時間及不同pH環境下的比較圖1顯示了pH7.4時不同保溫時間對A510的影響，對照管吸光度于15min時達高峰，隨后緩慢下降；而加藥管和氧化管吸光度一開始便呈現急劇下降的趨勢。圖2顯示了pH4.5時不同保溫時間對A510的影響，對照管吸光度于30min時達高峰，此后處于基本穩定狀態；加藥管和氧化管吸光度均于30min后才出現較明顯的下降。公務員之家

2.3各管之間吸光度的變化值（ΔA）比較從表2可以看出，隨著保溫時間的延長，各管之間的ΔA逐漸加大，但pH4.5時的ΔA加藥管-氧化管，在30min時最大，此后較為穩定。表2各管之間吸光度的變化值（ΔA）比較（略）

三、討論

實驗表明，鄰二氮菲-Fe2+絡合物在酸性條件下（pH4.5）比較穩定，有較高的吸光度，并且最大吸收波長為510nm。而保溫時間也是實驗中的一個重要環節，保溫到某一時間時，各管的吸光度較大，同時各管之間的吸光度變化值（ΔA）也較大，有利于自由基清除劑的甑選。從實驗中觀察到，在pH4.5的條件下，對照管保溫到30min有最大的吸收峰，加藥管也有較大的吸光度，使加藥管與氧化管之間ΔA（ΔA加藥管-氧化管）達到最大，該值更能說明自由基清除劑的作用強弱，是判斷自由基清除劑的重要指標，并且還能反映該方法的靈敏度。而在pH7.4時，加藥管和氧化管一開始便呈現急劇下降的趨勢，雖然兩管吸光度有所差異，但ΔA加藥管-氧化管較pH4.5時要小得多，不具有說服力，也降低了反應的靈敏度。綜上所述，采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法衡量自由基清除劑的作用時，最佳反應條件為pH4.5，測定波長為510nm，37℃保溫時間為30min。

【參考文獻】

［1］趙克然,楊毅軍,曹道俊.氧自由基與臨床［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2000:34.

［2］金鳴,蔡亞榮,李金榮,等.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產生的羥自由基［J］.生物化學與生物物理進展,1996,23（6）:553.