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【摘要目的摘要：觀察亞硒酸鈉對大鼠腎小球系膜細胞系HBZY1表達p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和單核細胞趨化蛋白1(MCP1)的影響，從而探究硒在防治糖尿病腎病（DN）中的功能機制.方法摘要：分別以高葡萄糖、高胰島素、過氧化氫和糖基化終末產物（AGEs）刺激HBZY1細胞；先給予100nmol/L亞硒酸鈉預處理后，再分別以上述4種刺激因素孵育HBZY1細胞，分別檢測HBZY1細胞p38MAPK和MCP1的表達并比較.結果摘要：4種刺激因素均可作為獨立因素，導致HBZY1細胞p38MAPK和MCP1表達量增加；亞硒酸鈉能抑制上述4種因素所致的p38MAPK和MCP1的表達.結論摘要：亞硒酸鈉通過抑制p38MAPK和MCP1在HBZY1細胞的表達,從而有效防治DN的發生發展，表明硒在DN的防治過程中發揮積極功能.

【亞硒酸鈉；p38絲裂原活化蛋白激酶；單核細胞趨化蛋白1；系膜細胞；糖尿病腎病

【中圖號R587.24

0引言

近年來國外探究表明單核細胞趨化蛋白1(monocytechemoattractantprotein1，MCP1)和糖尿病腎病（diabeticnephropathy,DN）有密切關系［1］.p38MAPK是細胞信號傳遞的交匯點或共同通路［2-3］，但它在DN發生中的功能及其和MCP1關系仍不十分清楚；硒是機體必需微量元素之一，其缺乏可加劇DN的氧化應激，并可產生擬高血糖病理狀態，從而加劇DN的發生發展［4］.但其是否功能于p38MAPK和MCP1國內外未見文獻報道.我們分別給予高葡萄糖(HG)、高胰島素(HI)、過氧化氫(H2O2)和糖基化終末產物(AGEs)孵育HBZY1細胞，觀察HBZY1細胞p38MAPK和MCP1的表達以及亞硒酸鈉對HBZY1細胞p38MAPK和MCP1表達的影響.從而明確二者在DN形成中的功能及硒在防治DN中的功能機制.

1材料和方法

1.1材料大鼠腎小球系膜細胞系（HBZY1，中國典型培養物保藏中心CCTCC）；新生牛血清、RPMI1640培養液、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（二抗）（北京中山生物技術有限公司）；亞硒酸鈉(KarolinskaInstitute贈予)；柱離心式總RNA抽提試劑盒、RTPCR兩步法試劑盒、PCR相對分子量標準（TaKaRa公司）；PCR引物合成（上海博亞生物技術有限公司），蛋白質相對分子量標記物（BioRad公司）；磷酸化p38MAPK兔多抗（(Promega公司).

1.2方法

1.2.1細胞系HBZY1的培養HBZY1細胞常規培養于200mL/LRPMI1640培養液中，培養條件為37℃，飽和濕度50mL/LCO2，每2~3日用0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代.HBZY1細胞長滿培養瓶底40%后分為9組，以無血清培養液饑餓24h,然后按實驗分組加入刺激（及干預）因素.

1.2.2體外制備AGEs參考文獻［5］，按牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）50g/L，和葡萄糖90g/L，0.5mmol/LEDTA及0.2mmol/LPBS（pH7.4）混勻后過濾除菌，37℃恒溫培養箱卵孵育60d.0.1mol/LPBS（pH7.4）中透析48h，測定蛋白含量及熒光強度，分裝后存于-80℃冰箱保存備用.

1.2.3實驗分組分別以一定濃度HG,HI,H2O2和AGEs刺激細胞系HBZY1一定時間；先給予亞硒酸鈉100nmol/L預處理HBZY1細胞48h后，再分別以上述4種刺激因素（濃度、時間同前）孵育HBZY1細胞，同時設對照組.分組情況如下摘要：①對照組摘要：用等體積PBS培養細胞;②HG組摘要：用25mmol/L葡萄糖刺激HBZY1細胞72h;③HI組摘要：用100nmol/L胰島素刺激HBZY1細胞24h;④H2O2組摘要：用100μmol/LH2O2刺激HBZY1細胞1h;⑤AGEs組摘要：用100mg/LAGEs刺激HBZY1細胞6h;⑥亞硒酸鈉+HG組摘要：依次以100nmol/L亞硒酸鈉和25mmol/L葡萄糖分別刺激HBZY1細胞48h和72h;⑦亞硒酸鈉+HI組摘要：依次以100nmol/L亞硒酸鈉和100nmol/L胰島素分別刺激HBZY1細胞48h和24h;⑧亞硒酸鈉+H2O2組摘要：依次以100nmol/L亞硒酸鈉和100μmol/LH2O2分別刺激HBZY1細胞48h和1h;⑨亞硒酸鈉+AGEs組摘要：依次以100nmol/L亞硒酸鈉和100mg/LAGEs分別刺激HBZY1細胞48h和6h.

1.2.4RTPCR法檢測MCP1mRNA表達以柱離心式總RNA抽提試劑盒提取細胞系HBZY1總RNA，測定總RNA濃度，計算純度，A260nm/A280nm均在1.8～2.0之間.MCP1引物序列按文獻［6］摘要：上游引物摘要：5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′；下游引物摘要：5′AGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3′，擴增片段長度258bp.βactin引物序列摘要：上游引物摘要：5′TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3′;下游引物摘要：5′TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3′，擴增片段長度228bp.以兩步法RTPCR試劑盒進行反轉錄擴增，擴增條件摘要：94℃變性30s，55℃退火1min,72℃延伸1min,共35個循環，72℃最后延伸7min.每次PCR反應至少重復3次.PCR產物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳，結果經圖象分析系統掃描存圖，并對目的條帶進行密度分析.

1.2.5Westernblot法檢測p38MAPK蛋白表達培養的細胞系HBZY1，經4℃胞漿蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12000g4℃離心10min，沉淀加入4℃預冷核蛋白提取液，震蕩混勻，冰浴1h，再12000g4℃離心30min，取上清為核蛋白，其蛋白濃度經考馬斯亮藍法定量.磷酸化p38MAPK表達量采用Westernblot法檢測，核蛋白中加入等體積2×上樣緩沖液煮沸5min.進行10mol/LSDSPAGE，將蛋白轉至PVDF膜后用5g/LBSA室溫下封閉2h，分別用1∶2000抗磷酸化p38MAPK兔多抗4℃孵育過夜，用PBS充分洗滌，再用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG1∶5000，37℃孵育1h，用PBS充分洗滌，DAB顯色試劑盒顯色.結果經圖象分析系統對目的條帶進行掃描存圖并進行密度分析.

統計學處理摘要：資料采用SAS8.0進行統計分析，組間兩兩比較用非參數統計分析，P%26lt;0.05即認為有統計學差異.

2結果

2.1細胞系HBZY1MCP1mRNA表達細胞系HBZY1MCP1mRNA表達以βactin作為內參照物調整后進行半定量分析，HG，HI，H2O2和AGEs均可作為獨立因素使細胞系HBZY1MCP1mRNA表達量均明顯增加（P%26lt;0.01，表1，圖1）.

表1各組細胞系HBZY1MCP1RTPCR和磷酸化p38MAPKWesternblot半定量結果（略）

2.2細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表達細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表達以βactin作為內參照物調整后進行半定量分，HG，HI，H2O2和AGEs均可作為獨立因素激活p38MAPK，使細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表達明顯增加（P%26lt;0.01，表1，圖2）.

圖1RTPCR法檢測各組細胞系HBZY1MCP1mRNA和βactinmRNA表達（略）

圖2Westernblot法檢測各組細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白和βactin蛋白表達（略）

2.3細胞系HBZY1MCP1mRNA表達細胞系HBZY1MCP1mRNA表達以βactin作為內參照物調整后進行半定量分析.亞硒酸鈉預處理后，再分別給予以上4種刺激因素孵育細胞系HBZY1，可見MCP1mRNA表達量分別較相應未經亞硒酸鈉預處理各組明顯減少（P%26lt;0.01，表1，圖1）.

2.4細胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表達的影響HBZY1細胞磷酸化p38MAPK蛋白表達以βactin作為內參照物調整后進行半定量分析.先以亞硒酸鈉預處理細胞系HBZY1后，再分別給予上述4種刺激因素刺激細胞系HBZY1，可見磷酸化p38MAPK蛋白表達量分別較相應未經亞硒酸鈉預處理各組顯著減少（P%26lt;0.01），但和對照組比較仍有顯著差異（P%26lt;0.01，表1，圖2）.

3討論

本探究結果顯示HG,HI,H2O2和AGEs均可單獨誘導細胞系HBZY1，使其MCP1mRNA表達量明顯增加.4種刺激素誘導HBZY1細胞MCP1mRNA表達增加的機制，結合文獻和實驗結果我們認為有以下幾點摘要：①高糖有直接刺激MCP1mRNA及蛋白表達增高的功能，該功能是PKC，MAPKs所介導，這可能是DN時腎小球中單核巨噬細胞浸潤的重要原因;②大量AGEs可以和系膜細胞上的AGEs受體（RAGE）相互功能，使IκB磷酸化而導致NFκB激活；新近的探究表明［8］，AGEs和AGEs受體（RAGE）相互功能可消耗細胞內谷胱甘肽，產生大量的氧自由基，從而導致細胞內信號傳導改變，激活核轉錄因子NFκB/AP1.同時NFκB也是調節RAGE表達的一個啟動子，它的位點1和位點2的激活可使RAGE表達上調，NFκB的激活作為一種正反饋，又進一步促進了AGEs和RAGE的結合，導致NFκB的持續活化，而活化的NFκB可以上調MCP1mRNA和蛋白表達，從而在糖尿病所致腎臟損害中發揮重要功能;③過氧化氫可導致系膜細胞氧化應激加劇，誘導細胞內ROS產生，從而迅速激活NFκB，上調MCP1表達，在DN發生發展早期起重要功能［8］;④HI可能是通過激活PKC，MAPKs信號通路，引起系膜細胞氧化還原狀態發生變化，使細胞內ROS產生增加，導致NFκB激活，從而使MCP1表達上調.

MCP1介導糖尿病腎小球損傷.MCP1不僅對血液中單核細胞有很強的趨化活性，也能通過激活轉錄因子NFκB和AP1來誘導非炎癥細胞產生細胞因子和黏附分子，在誘導單核細胞遷入內皮下間隙及滲入腎小球的過程中起重要功能［7-8］；同時，滲入到腎小球的單核巨噬細胞反過來又刺激局部腎小球細胞，在巨噬細胞衍化生長因子如PDGF和TGFβ等功能下導致系膜增生和細胞外基質聚集；此外通過炎癥細胞因子功能，還可上調黏附分子和趨化因子的分泌，從而進一步有利于白細胞滲入到腎小球［7］.近年來通過細胞實驗及對人和實驗動物DN的探究發現，MCP1在DN的發病機制中起重要功能.

p38MAPK可被多種細胞外刺激激活，導致細胞生長、增殖、分化和調控某些因子表達［9-11］.本探究以糖尿病時存在的4種應激因素孵育大鼠腎小球系膜細胞系HBZY1，可見p38MAPK被激活，磷酸化表達增加.

硒是機體必需微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成部分，缺硒可出現擬高血糖癥病理狀態，引起白蛋白尿和腎小球硬化，從而加劇DN的發生發展；補充硒不僅可預防氧化應激，而且可防止腎臟損傷［4,12］.本探究結果還顯示，亞硒酸鈉具有類似p38MAPK抑制劑所產生的功能，其機制可能是摘要：①通過保護系膜細胞免遭氧化損傷而抑制MCP1的分泌；②通過抑制p38MAPK信號通路而抑制MCP1在系膜細胞的表達.表明亞硒酸鈉可能通過抑制p38MAPK而延緩DN的發生發展，但亞硒酸鈉是否通過抗氧化而抑制p38MAPK亦或功能于信號通路的其它環節尚需進一步深入探索，提示硒在防治DN發生發展過程中發揮著積極功能.

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