導(dǎo)語：抗汞引起腎細(xì)胞凋亡研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的探討血紅素氧合酶-1（HO-1）對汞引起腎細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機(jī)制。方法64只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、單純?nèi)竟M、HO-1誘導(dǎo)組和HO-1抑制組，每組16只。先分別腹腔注射生理鹽水、空白液、血晶素、鋅原卟啉Ⅸ（ZnPPⅨ）預(yù)處理，8h后處死各組內(nèi)半數(shù)鼠取腎查HO-1表達(dá)水平與活性，余鼠除對照組注射生理鹽水外，其余3組均腹腔注射HgCl2（2mg·kg-1），24h后檢測血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）及腎內(nèi)總抗氧化能力（TAOC）、丙二醛（MDA）、Bcl-2蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果與對照組比較，單純?nèi)竟MTAOC降低而MDA、Cr、BUN、Bcl-2表達(dá)水平和AI均明顯增加（P<0.01），HO-1抑制組除Bcl-2表達(dá)受抑外，其余指標(biāo)的變化與單純?nèi)竟M相似，但更為顯著。HO-1誘導(dǎo)組與單純?nèi)竟M及HO-1抑制組比較，TAOC及Bcl-2表達(dá)均顯著升高，而MDA、Cr、BUN及AI則明顯降低（均P<0.01）。結(jié)論HO-1通過抗氧化、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平而對抗汞引起腎細(xì)胞凋亡的作用。

【關(guān)鍵詞】血紅素氧合酶-1;腎;汞;凋亡;大鼠

氯化汞（HgCl2）是一種腎毒性藥物，常用于制作急性腎功能衰竭的動物模型。近年研究揭示，汞能促進(jìn)細(xì)胞線粒體產(chǎn)生大量H2O2等活性氧，后者進(jìn)一步誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在汞所致的急性腎衰中起著重要作用［1-2］。血紅素氧合酶-1（HO-1）是一種抗氧化酶，廣泛參與各種組織細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激時的防御機(jī)制，是機(jī)體拮抗氧化應(yīng)激損傷最重要的內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，但HO-1能否抑制汞介導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡及急性腎損傷罕見報道。為此，我們擬應(yīng)用血晶素與鋅原卟啉Ⅸ（Zn-PPⅨ）分別特異性誘導(dǎo)與抑制HO-1，以探明HO-1對HgCl2引起大鼠腎細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

血晶素、ZnPPⅨ為Sigma公司產(chǎn)品。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（TAOC）、兔抗鼠多克隆HO-1IgG抗體及Bcl-2IgG抗體、SABC免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑等均購自武漢博士德生物工程有限公司。TUNEL法凋亡檢測試劑盒購于Boehringer公司，其它試劑均為分析純。

1.2動物分組與標(biāo)本采集

選用健康雄性Wistar大鼠64只（體重250～310g），隨機(jī)分為4組:對照組、單純?nèi)竟M、HO-1誘導(dǎo)組和HO-1抑制組，每組16只。預(yù)先分別給各組大鼠腹腔注射等量生理鹽水、空白液（由0.1mmol·L-1NaOH和0.1mmol·L-1PBS液按體積比1∶24配制而成的混合溶液）、溶于空白液中的血晶素（30mg·kg-1）及ZnPPⅨ（20mg·kg-1），8h后，每組均任挑8只處死，取腎臟，一部分腎置于4%的中性甲醛液中固定作HO-1免疫組化染色，其余部分于-80℃保存待測HO-1活性。余鼠除對照組經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水外，其余3組均經(jīng)腹腔注射HgCl2（2mg·kg-1）溶液，動物自由進(jìn)食飲水，24h后各組大鼠經(jīng)2%戌巴比妥鈉40mg·kg-1腹腔注射麻醉，開腹經(jīng)下腔靜脈抽血檢測肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），然后迅速摘出腎臟，取部分腎組織置于4%的中性甲醛液中固定，剩余腎組織于-80℃保存待測各項生化指標(biāo)。

1.3免疫組化檢測

取上述甲醛液固定腎組織，常規(guī)石蠟包埋切片（厚6μm），二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，于1g·L-1TBS中微波修復(fù)抗原10min，再置于3%H2O2中15min，滅活內(nèi)源性酶，PBS液反復(fù)沖洗3次，采用SABC法按試劑盒說明書分別滴加HO-1或Bcl-2抗體（抗體滴度均為1∶200），DAB顯色，封片，400倍鏡下隨機(jī)選擇5個不重疊視野觀察腎小管上皮細(xì)胞，胞漿見棕色顆粒者為陽性染色細(xì)胞。HO-1蛋白表達(dá)量采用CD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)測定平均光密度值表示，Bcl-2蛋白表達(dá)量采用陽性染色指數(shù)（PI）表示，PI（%）=陽性染色細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)所有細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4生化指標(biāo)檢測

血Cr、BUN分別采用苦味酸法和二乙酰法，按試劑盒說明書測定。腎組織TAOC和MDA采用化學(xué)比色法，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。另取各腎組織標(biāo)本約0.5g，加蔗糖Tris緩沖液制成組織勻漿，差速離心法分離微粒體，考馬亮藍(lán)法測定蛋白濃度，根據(jù)HO-1降解血紅素生成膽紅素的原理，參照何潔［3］的方法測定HO-1活性，以1mg蛋白1h催化血紅紅蛋白降解生成膽紅素的量表示腎組織HO-1活性（nmol·mg-1·h-1）。

1.5TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

腎組織經(jīng)4%中性甲醛液固定過夜，脫水，透明，石蠟包埋，切片（厚6μm），置于包被有多聚賴氨酸的載玻片上，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，400倍光鏡下觀察，胞核染成棕黃色者為凋亡細(xì)胞，每張切片選10個不重疊視野，每個視野連續(xù)計數(shù)100個腎小管上皮細(xì)胞，以凋亡細(xì)胞所占的百分比作為凋亡指數(shù)（AI）。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)均為計量資料，以x-±s表示，組間比較采用F及q檢驗，應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2.1腎組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)與活性

免疫組化染色顯示，僅HO-1誘導(dǎo)組出現(xiàn)HO-1明顯表達(dá)，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中，表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞胞漿普遍被染成棕褐色，對應(yīng)的HO-1活性也顯著升高。而其余3組腎內(nèi)HO-1表達(dá)較少，染色極淺，對應(yīng)的HO-1活性也較低，其中HO-1抑制組HO-1活性顯著降低。組間比較見表1。表1各組HO-1蛋白表達(dá)與活性水平比較（略）

2.2腎組織及血生化指標(biāo)檢測結(jié)果

與對照組比較，單純?nèi)竟M及HO-1抑制組TAOC降低而MDA、Cr、BUN均明顯升高，HO-1誘導(dǎo)組則TAOC明顯升高（P<0.01），MDA、Cr、BUN雖有升高趨勢，但無顯著性差異（P>0.05）。與單純?nèi)竟M比較，HO-1誘導(dǎo)組TAOC明顯升高，而MDA、Cr、BUN均顯著下降，HO-1抑制組則相反，TAOC明顯下降，而MDA、Cr、BUN均顯著升高。H

O-1誘導(dǎo)組與HO-1抑制組間各指標(biāo)均有顯著性差異（均P<0.01）。見表2。表2各組血生化檢測結(jié)果比較（略）

2.3Bcl-2蛋白表達(dá)

對照組腎內(nèi)幾乎不表達(dá)Bcl-2，單純?nèi)竟MBcl-2陽性染色細(xì)胞在近曲小管較常見，遠(yuǎn)曲小管相對較少，HO-1誘導(dǎo)組腎小管Bcl-2陽性染色細(xì)胞顯著增多，而HO-1抑制組腎小管Bcl-2陽性染色細(xì)胞則較少，各組間比較見表3。表3各組Bcl-2蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況比較（略）

2.4細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

對照組腎內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)少見。單純?nèi)竟M見凋亡細(xì)胞，主要為近曲小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，與之相比較，HO-1誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡明顯減少，而HO-1抑制組細(xì)胞凋亡則顯著增多，組間比較見表3。

3討論

腎臟是無機(jī)汞攻擊的主要靶器官，但汞致腎損傷的確切分子機(jī)制尚未完全闡明。已有研究顯示，給予HgCl2能夠顯著增加腎內(nèi)H2O2等活性氧生成［4］，降低腎內(nèi)重要抗氧化劑谷胱甘肽的含量，并降低腎內(nèi)超氧化物歧化酶的活力，同時生成過量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛［5-6］。當(dāng)給予外源性抗氧化劑或自由基清除劑，則可明顯減輕HgCl2所致的腎損傷，從而提示促氧化應(yīng)激是汞致急性腎損傷的重要機(jī)制［5］，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，活性氧除直接引起生物膜脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致細(xì)胞不可逆損傷外，還可通過激活P38MAPK等多途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］。本研究結(jié)果也顯示，單純?nèi)竟M較對照組腎內(nèi)TAOC顯著降低，MDA生成增多，出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加和腎功能降低，從而證實了HgCl2的氧化應(yīng)激性腎損傷機(jī)制。HO-1是近年倍受重視的細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶，本質(zhì)上屬于應(yīng)激蛋白，能在各種氧化應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)適應(yīng)性表達(dá)，發(fā)揮抗氧化等多種細(xì)胞保護(hù)作用。HO-1的抗氧化性源于其對促氧化的游離血紅素的降解及生成具有強大抗氧化能力的膽紅素，后者能非特異性清除多種自由基［8］。本研究結(jié)果顯示，預(yù)先應(yīng)用血晶素誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)及活性升高后，可明顯升高腎組織TAOC，降低MDA生成，抑制細(xì)胞凋亡并改善腎功能，而預(yù)先抑制HO-1蛋白的活性，則會加重汞所致的氧化應(yīng)激損傷，增加細(xì)胞凋亡并使腎功能惡化，從而支持抗氧化作用是HO-1抗汞所致細(xì)胞凋亡和腎功能損傷的重要機(jī)制。

曹秉振等［9］報道，汞可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、激活caspase-3，從而引起大鼠小腦顆粒細(xì)胞凋亡。本研究中，我們也對腎組織內(nèi)Bcl-2的變化作了檢測，結(jié)果顯示，預(yù)先誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)可以顯著上調(diào)腎內(nèi)Bcl-2表達(dá)，反之，抑制HO-1表達(dá)則下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平。Bcl-2是迄今發(fā)現(xiàn)最重要的抗凋亡蛋白之一，主要通過抑制Bax的促凋亡作用、維持細(xì)胞鈣穩(wěn)定、抑制細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞漿等，最終抑制由凋亡蛋白酶（caspase）激活所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［10］。因此，HO-1上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平可能是其抗汞致腎細(xì)胞凋亡的另一重要機(jī)制，至于HO-1如何上調(diào)Bcl-2表達(dá)尚不清楚。文獻(xiàn)資料提示，HO-1通過降解血紅素生成的另一重要產(chǎn)物CO可能是其抗細(xì)胞凋亡作用的重要執(zhí)行者［11］。

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