導(dǎo)語：血氨濃度測定方法學(xué)分析論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的：建立紫外分光光度法檢測血液中的氨濃度的方法，為臨床肝性昏迷、肝性腦病、重型肝病、尿毒癥等代謝障礙疾病的診斷提供參考。方法：血液離體后，立即加入定量過量的鎢酸鈉及硫酸溶液，使蛋白沉淀的同時，血液中的氨與硫酸形成硫酸銨而存留于血濾液中，再以酚-次氯酸鈉顯色后于波長630nm處測定光密度OD值（以空白校正）。結(jié)果：血氨在20～60μmol/L范圍內(nèi)濃度與OD之間呈良好的線性。結(jié)論：此方法快速、簡便，適合臨床檢測血氨的濃度。

【關(guān)鍵詞】血氨；方法學(xué)；光密度

正常人體內(nèi)游離血氨（bloodammonia，BA）含量極低（正常值20～60μmol/L）［1］，其主要來源于體內(nèi)蛋白質(zhì)在代謝過程中產(chǎn)生的氨基酸，以及經(jīng)脫氨作用分解而來的內(nèi)源性氨，正常情況這種氨可形成酰胺及合成其他含氮化合物而不斷地被轉(zhuǎn)化；另一來源是蛋白質(zhì)類食物在腸道內(nèi)經(jīng)細(xì)菌分解而成的外源性氨，正常情況下此氨經(jīng)門靜脈進入肝臟被合成為脲，經(jīng)腎臟排出體外。然而在發(fā)生代謝障礙性疾病，如肝性昏迷、肝性腦病、重型肝炎、尿毒癥等由于氨不能正常代謝排出體外而引起B(yǎng)A升高。肝功能極度衰竭或血液不能正常地流經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)換等嚴(yán)重肝臟疾病，氨不能從循環(huán)中及時清除均可使血氨增高［1］。高BA有神經(jīng)毒性，BA的測定對于肝硬化門脈高壓、肝昏迷、Reve’s綜合征及兒科的一些先天性代謝紊亂等病的診斷、觀察和預(yù)后判斷有著重要意義［2］。BA的測定方法有微量擴散法、比色法、離子交換法、氨電極法、酶法等。筆者在結(jié)合本實驗室現(xiàn)有條件，參考國內(nèi)外有關(guān)文獻建立快速、準(zhǔn)確的檢測BA方法，為臨床該類疾病的診斷、治療提供參考。

1儀器與試劑

1.1儀器

電子天平COBS120型（朝鮮COBS公司），紫外分光光度儀HP8453（美國惠普），離心沉淀器800型（上海手術(shù)儀器廠），YKHI型液體快速混勻器（江西醫(yī)療器械廠），DHW420三用電熱恒溫水箱（北京東霞科學(xué)儀器廠）。

1.2試藥

鎢酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號030906），硫酸銨（重慶北碚化學(xué)試劑廠，批號050329），亞硝基鐵氰化鈉（上海三愛思試劑公司，批號20020204），苯酚（重慶北碚化學(xué)試劑廠，批號：20000924），氫氧化鈉（重慶川江化學(xué)試劑廠，批號20000312），次氯酸鈉（重慶川東化工集團化學(xué)試劑廠，批號20040904），硫酸銨（重慶北碚化學(xué)試劑廠，批號050329），硫酸（重慶川江化學(xué)試劑廠，批號20000105），所用試藥均為分析純，水為新制無氨蒸餾水。

2方法與結(jié)果

2.1儲備溶液的配制［2］

無氨水的制備：參照文獻［3］取重蒸水1000mL，加稀硫酸1mL與高錳酸鉀試液1mL，蒸餾即得備用。

酚顯色劑：精取亞硝基鐵氰化鈉25.00mg，與適量苯酚混合后加無氨水至100mL,過濾即得。

堿性次氯酸鈉溶液：精取250mg次氯酸鈉，氫氧化鈉2500mg，溶于100mL無氨水中即得。

0.5mol/L硫酸溶液、5mmol/L硫酸銨溶液參照文獻方法［3］配制。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精取“2.1”項的硫酸銨儲備液20、200、500、1000、1500、2000、4000μL置于50mL容量瓶，立即加無氨水至刻度即得10、20、50、100、150、200、400μmol/L的硫酸銨系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取“2.2”項的硫酸銨系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL，分別加入10%的鎢酸鈉溶液、0.5mol/L硫酸溶液各0.5mL，渦旋震蕩1min，4000r/min離心5min，分取上清液1mL，依次加入酚顯色劑和堿性次氯酸鈉溶液各1mL，渦旋1min后置37℃水浴20min，以空白管校正后于630nm處測定OD值；將所測得的吸收度OD值對濃度進行線性回歸處理得回歸方程：OD=0.0017C+0.23，相關(guān)系數(shù)r=0.9964，根據(jù)(NH4)2SO4與游離氨的定量關(guān)系，即得游離氨濃度在5～200μmol/L的定量線性范圍（見圖1）。

2.4臨床樣本的測定

參考國內(nèi)外有關(guān)文獻，經(jīng)優(yōu)化后測定BA的方法為：離體血液立即加入過量定量的10%鎢酸鈉及0.5mol/L硫酸溶液，使蛋白沉淀的同時，血液中的氨與硫酸形成硫酸銨而存留于血濾液中，再以酚次氯酸鈉顯色劑顯色后于波長630nm處測定OD值，即可定量測定BA。

2.5方法的回收試驗

按“2.2”項的方法分別配制高、中、低（400、200、40μmol/L）的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，各取1mL分別加入1mL無氨正常血漿，混勻后精密量取1mL按2.4項下的方法分別精密加入0.5mL10%鎢酸鈉和0.5mol/L硫酸溶液各0.5mL，以下按準(zhǔn)曲線項下相應(yīng)的方法處理并分別測定其OD值，將測得的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測得量與回收率，結(jié)果見表1。表1血氨回收試驗（略）

2.6精密度試驗

配制低、中、高（25、50、75μmol/L）3個濃度含無氨正常血漿的硫酸銨溶液各3份，日內(nèi)4℃冷藏保存，每間隔1h按2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法測定1次，連續(xù)測定5次。另取相同樣品18℃冷凍保存，每日測定1次，連續(xù)測定5日。所得OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得游離氨濃度，結(jié)果見表2。表2血氨精密度試驗（略）

2.7穩(wěn)定性試驗

取硫酸銨溶液適量配制成75μmol/L含無氨正常血漿的硫酸銨溶液，分別置于4℃冰水浴和18℃條件下儲藏保存，每次平衡5min后各取1mL樣品，按“2.6”精密度試驗項下的測定方法，4℃下保存的標(biāo)本在1d內(nèi)每間隔2h測定1次，每次平行測定5份，直至14h共測定8次；18℃條件下保存的標(biāo)本每天定時測定1次，每次平行測定5份，連續(xù)測定7d，將測得的OD值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算游離氨的實際含量，結(jié)果見表3。由表可知新鮮血中游離氨極不穩(wěn)定，常溫和4℃冷藏保存均不穩(wěn)定，宜在2h內(nèi)測定，在18℃下保存也宜在24h內(nèi)測定。表3血氨穩(wěn)定性試驗（略）

2.6臨床應(yīng)用

選擇我院近2年來的住院患者，除外肝、膽、腎疾病患者。腦梗塞患者28例，其中男16例，女12例，平均年齡（55.8±10.5）歲；腦溢血患者25例，其中男15例，女10例，平均年齡（60.4±15.4）歲；腦炎患者10例，其中男6例，女4例，平均年齡（39.8±13.5）歲。全部病例均經(jīng)臨床及CT和（或）MRI檢查。對照組25例，經(jīng)檢查全部健康正常，其中男13例，女12例，平均年齡（57.2±14.3）歲。全部患者均在昏迷期及恢復(fù)期各采取肘靜脈血1～2mL，肝素抗凝，立即用上述方法測定血氨，對照組也同時采血測定血氨。

結(jié)果對照組血氨含量為（56.53±29.15）μmol/L，腦梗塞組昏迷期血氨含量為（179.00±108.59）μmol/L，恢復(fù)期為（66.89±26.67）μmol/L，昏迷期與對照組經(jīng)χ2檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.68，P<0.05），恢復(fù)期與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.42，P>0.05）。腦溢血組昏迷期血氨含量為（146.97±72.41）μmol/L，恢復(fù)期為（60.46±24.39）μmol/L，昏迷期與和對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.78，P<0.05），恢復(fù)期與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.68，P>0.05）。腦炎組昏迷期血氨含量為（197.17±62.10）μmol/L，恢復(fù)期為（59.83±39.59）μmol/L，昏迷期與對照組顯著增高（χ2=9.72，P<0.05），而恢復(fù)期與對照組相比差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.95，P>0.05）。

3討論

由表3結(jié)果表明：標(biāo)本放置時間越長，其血氨濃度越高，主要原因可能是血液細(xì)胞自身代謝或部分微生物代謝后產(chǎn)生氨致使其血氨濃度升高。為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確應(yīng)注明標(biāo)本的采集時間并立即送檢，送檢標(biāo)本迅速測定（30min內(nèi)），同時進行平行質(zhì)控監(jiān)測。病人標(biāo)本采集后如不能立即測試，應(yīng)在2～8℃冷藏最多3h測定，18℃冷凍保存最多24h測定。

正常情況下，體內(nèi)大部分氨經(jīng)過尿素循環(huán)形成尿素自尿中排出，部分為機體再利用，不會產(chǎn)生蓄積，而在尿素循環(huán)障礙疾病時則將出現(xiàn)血氨蓄積，在新生兒當(dāng)血氨大于150μmol/L、嬰幼兒大于80μmol/L、成人大于70μmol/L可確定為高氨血癥［45］。血氨可干擾腦的能量代謝，腦組織在氨的生成中需消耗某些輔酶、高能磷酸及大量α酮戊二酸，引起高能磷酸化合物濃度的降低，過量氨還可能抑制丙酮酸脫氫酶活力而影響乙酰CoA的生成和乙酰膽堿的合成，干擾三羧酸循環(huán)，氨還可抑制Na+K+ATP酶，直接影響鉀、鈉在神經(jīng)細(xì)胞膜上的正常分布，干擾神經(jīng)傳導(dǎo)活動，當(dāng)腦組織炎癥、缺血、缺氧時就影響了氨的代謝使氨增高。腦缺血后可導(dǎo)致生化代謝方面的變化，影響氨的平衡，腦組織內(nèi)氨水平增高。有實驗表明，大鼠在腦循環(huán)中斷5min后，其缺血的皮層氨含量從對照值的0.28mmol/L升高到1.12mmol/L。在腦組織內(nèi)，氨的解毒主要靠α酮戊二酸的氨化作用以及氨與谷氨酸結(jié)合生成谷氨酰胺，但后者的反應(yīng)需要消耗ATP，在缺血情況下α酮戊二酸的氨化起主要作用。同時昏迷患者常常禁食，致使液體攝入減少或用脫水劑過量，從而致使血氨顯著增高。此外，由于感染、高熱等增加機體代謝，也使內(nèi)源性血氨增高。國外學(xué)者KanamoriK等研究了小鼠體內(nèi)的氨、谷氨酰胺以及谷氨酰胺合成酶與腦病的關(guān)系，表明腦病與氨相關(guān)［6］。國內(nèi)李英杰等［7］測定22例腦梗塞患者的血氨和CSF氨含量，結(jié)果表明急性期血氨和CSF氨顯著高于對照組（P<0.01）梗塞面積與氨含量明顯相關(guān)。本文病例監(jiān)測結(jié)果：患者組昏迷期血氨水平顯著高于恢復(fù)期和對照組（P<0.01），亦表明這一病理規(guī)律，提示對于腦血管病及腦炎患者、昏迷期患者，應(yīng)注意檢查血氨，以了解患者的氨代謝情況。

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