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1材料與方法

1.1材料

檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿。

1.2主要試劑

纖維蛋白原和凝血酶標準品購自美國SIGMA公司，Bradford蛋白質定量檢測試劑盒購自美國BioRad。其余試劑均為國產分析純。

檸檬酸鋇吸附法使用的四種溶液分別為，溶液A：1.0mol/LBaCl2溶液；溶液B：0.02mol/LTris，0.15mol/LBaCl2，0.10mol/LNaCl，pH7.4；溶液C：0.02mol/LTris，0.10mol/LNaCl，0.20mol/LNa2EDTA，pH7.4；溶液D：0.02mol/LTris，0.15mol/LNaCl，pH6.5.

1.3主要儀器

GEGeneQuant1300核酸蛋白分析儀

1.4方法

1.4.1凝血酶原提取將收集到的5份豬血漿按1～5編號，各均分為2份，其中1份采用等電點沉淀法提取凝血酶原，另1份采用檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原。

1.4.1.1等電點沉淀法豬血漿用蒸餾水稀釋10倍，用5%冰乙酸將其pH調至5.3，4℃靜置過夜，3000r/min離心15min，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，過濾備用。

1.4.1.2檸檬酸鋇吸附法豬血漿中加入溶液A，體積比為10∶1，4℃攪拌30min，靜置30min后，3000r/min離心30min，棄上清。沉淀用溶液B洗滌，3000r/min離心15min，棄上清。重復洗3次。沉淀用溶液C解吸附，4℃攪拌0.5～1h，3000r/min離心15min取上清。上清液用溶液D于4℃透析過夜。3000r/min離心15min取上清液，即為凝血酶原溶液。

1.4.2凝血酶原激活用2%Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調至7.1，加入0.25mol/LCaCl2溶液，使Ca2+終濃度為0.03mol/L，再用2%Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調至7.1，室溫靜置2h，過濾即得凝血酶溶液。

1.4.3凝血酶比活性測定根據文獻［4］提供的方法配制0.1%纖維蛋白原溶液。

凝血酶效價測定［4,5］：取凝血酶標準品，用生理鹽水配制成效價(U/mL)分別為5、6、7、8、9、10的標準品溶液。另取1×10cm的塑料試管6支，各加入0.1%纖維蛋白原溶液450μl，置37℃水浴預熱5min，再分別取已37℃預熱的上述6個濃度的標準品溶液各50μl，迅速加入上述各試管中，立即計時并搖勻，記錄凝固時間。每個濃度測2次，求平均值，做標準曲線。待測樣品用生理鹽水稀釋適當濃度，取50μl，按標準曲線的測定方法平行測定2次，求平均值，根據標準曲線或回歸方程計算樣品的效價。

根據文獻［6］，采用Bradford法測定樣品的蛋白質濃度，以牛血清白蛋白為標準品，每個樣本平行測2次，取平均值。根據公式：酶比活性=酶效價/溶液蛋白質濃度，計算凝血酶溶液的比活性。

2結果與分析

以凝血酶標準品溶液效價(U/mL)為X，對應的凝固時間（sec）為Y進行直線回歸處理，并求得直線回歸方程，所得方程式為：Y=62.9135.994X，r≈0.9948.將凝血酶樣品的凝固時間代入回歸方程，即可計算得出樣品的凝血酶效價(見表1、圖1)。

采用等電點沉淀法得到的凝血酶原經激活后，凝血酶的比活性為11.01±1.54U/mg，而采用檸檬酸鋇吸附法提取得到的凝血酶原經激活后，凝血酶的比活性可達到130.17±12.30U/mg。其比活性經配對樣本t檢驗統計學分析后，其概率P=3.54×105＜0.01，說明兩種方法得到的凝血酶比活性有顯著性差異，后者約為前者的11.8倍。從兩種方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白質濃度分析，造成兩者酶比活性差異的主要原因在于凝血酶的純度差異，凝血酶純度越高，比活性就越高。等電點沉淀法提取的凝血酶原溶液含雜蛋白較多，需要進一步純化，以提高酶的比活性。因而，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原大大優于等電點沉淀法，得到的凝血酶純度較高。

3討論

從血漿中提取的凝血酶可應用于臨床，作為局部止血的首選藥物，具有止血快、無副作用的優點。同時，凝血酶也是纖維蛋白原定量檢測試劑盒的主要成分，應用于出凝血疾病和血栓性疾病的臨床檢測［7］。由于人血漿資源的限制性，目前國內采用豬血漿提取凝血酶的報道較多，等電點沉淀法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法，凝血酶原經單獨的鈣離子激活即可得到凝血酶。表1兩種提取方法所得到的凝血酶比活性

等電點沉淀法根據蛋白質在溶液pH為其等電點的條件下溶解度最低的原理，用1%的醋酸將適當稀釋后的血漿pH調至凝血酶原的等電點5.0～5.5之間，即可使凝血酶原析出。該方法雖然操作簡便，成本較低，但得到的凝血酶含雜蛋白較多，比活性低，達不到臨床藥物和檢測試劑的純度要求，還需要進一步的純化，而純化步驟越多，酶的回收率則相應降低，不能有效的利用資源。

檸檬酸鋇吸附法則根據檸檬酸鋇能吸附依賴于維生素K的凝血因子這一特性，在檸檬酸鈉抗凝獲得的血漿中加入氯化鋇產生檸檬酸鋇，凝血酶原等因子隨之沉淀分離出來，沉淀用EDTA解吸附，離心去沉淀，上清液經透析后獲得凝血酶原溶液。雖然該方法看似操作較為復雜，但得到的凝血酶純度較高，可直接用于檢測試劑的制備，也可根據目的選擇進行中度純化，相比等電點沉淀法其回收率更高，實際上節約了成本。

另外，無論是等電點沉淀法還是檸檬酸鋇吸附法，最后含有凝血酶原的蛋白沉淀的復溶過程是影響凝血酶得率的一個關鍵步驟。在檸檬酸鋇吸附法中，用EDTA解吸附凝血酶原應在冰浴中攪拌0.5h以上，直至溶液呈現膠凍狀態為止，使凝血酶原充分溶解于緩沖液中。

【參考文獻】

［1］張智明.凝血酶的研究進展［J］.海峽藥學,2006,18(6):13.

［2］施大林,陸茂林,呂惠敏,等.豬血凝血酶的制備［J］.生物技術,2002,12(1):18.

［3］宋宏新,馬永征,李敏康.凝血酶分離純化方法的研究進展［J］.食品研究與開發,2004,25(6):6567.

［4］中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥典三部［M］.北京:化學工業出版社,1995,11281129.

［5］郝蘇麗,沈佳,徐康森.凝血酶效價測定法的改進［J］.藥物分析雜志,1995,15(1):5961.

［6］汪家政,范明.蛋白質技術手冊［M］.北京:科學出版社,2000,4247.

［7］何英武,吳瑞玲.血漿纖維蛋白原測定的方法進展及臨床意義［J］.現代中西醫結合雜志,2004,13(18):25112512.

【摘要】目的比較等電點沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原的純度。方法分別采用等電點沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原，凝血酶原經單獨鈣離子激活得到凝血酶，通過凝血酶效價測定、蛋白質濃度測定，計算出凝血酶的比活性。結果采用等電點沉淀法提取的凝血酶原經激活后得到的凝血酶比活性為11.01±1.54U/mg，采用檸檬酸鋇吸附法提取的凝血酶原經激活后得到的凝血酶比活性為130.17±12.30U/mg，經配對T檢驗，P＜0.01.結論與等電點沉淀法相比，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取得到的凝血酶原純度更高。

【關鍵詞】凝血酶原；凝血酶；等電點沉淀法；檸檬酸鋇吸附法