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摘要：目的建立五味保肝丸定性定量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法薄層色譜法定性鑒別五味子和丹參的存在，高效液相色譜法確定降酶丸中五味子甲素含量。結(jié)果定性鑒別五味子和丹參，方法簡(jiǎn)便，圖譜清晰；高效液相色譜法測(cè)定含量，結(jié)果準(zhǔn)確，陰性無干擾。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)方法可作為降酶丸的定性定量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：五味保肝丸；薄層色譜；高效液相色譜；五味子甲素

五味保肝丸由五味子、丹參等中藥組成，是我院傳統(tǒng)中藥自制制劑(魯衛(wèi)藥制字Z02080175)，具有斂陰、活血、降酶功效，用于乙型肝炎、轉(zhuǎn)氨酶升高等病癥，臨床應(yīng)用近30年，療效確切。為控制該制劑質(zhì)量，除常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目外，實(shí)驗(yàn)研究五味子、丹參兩味藥的薄層色譜法鑒別方法，以及該制劑主要藥效成分五味子甲素含量范圍，為該制劑質(zhì)量控制指標(biāo)提供定性定量實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1主要儀器、試劑與藥材

1.1主要儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀(美國(guó))，JA2003型電子分析天平(上海)，KQ100型超聲波清洗器(昆山)。

1.2主要試劑

五味子甲素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純(美國(guó))，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3主要藥材

五味保肝丸由本院制劑室提供，其他實(shí)驗(yàn)用藥材取自本院中藥庫(kù)，經(jīng)鑒定五味子為木蘭科植物五味子Schisandchinensis(Turcz.)Bail的干燥成熟果實(shí)，丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.干燥根及根莖。陰性對(duì)照品實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)制。

2薄層色譜定性鑒別

2.1五味子定性鑒別

取五味保肝丸2g，研碎，加氯仿30ml，超聲提取30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)勇确?ml使溶解，作為供試品溶液；另取缺五味子的處方比例量的其他藥材細(xì)粉2g，按上述方法，制成五味子陰性對(duì)照液。再取五味子甲素對(duì)照品，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述三種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(30℃～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，五味子陰性對(duì)照液無此斑點(diǎn)。

2.2丹參定性鑒別

取五味保肝丸3g，研碎，加乙醚20ml，超聲處理10min，過濾，濾液揮干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，作為供試品溶液；另取缺丹參的處方比例量的其他藥材細(xì)粉2g，按上述方法，制成丹參陰性對(duì)照液；再取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯(19：1)為展開劑，展開、取出、晾干。日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，丹參陰性對(duì)照液無此斑點(diǎn)。

3五味子甲素含量測(cè)定

3.1色譜條件

色譜柱：AgilentODS柱(4.6mm×150mm，5μm)。柱溫：30℃，流動(dòng)相：甲醇-水(80：20)，流速：1.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm。理論板數(shù)按五味子甲素計(jì)應(yīng)不低于3000，五味子甲素峰與相鄰峰分離度符合要求。

3.2對(duì)照品溶液制備

精密稱取減壓干燥至恒重的五味子甲素對(duì)照品6.32mg，加甲醇使溶解，并定容至25ml；制成濃度為0.2528mg/ml的對(duì)照品溶液。

3.3樣品液制備

取五味保肝丸適量，粉碎過四號(hào)篩，置硅膠于干燥器中干燥24h后備用。取樣品粉末約2g，精密稱定，置150ml具塞三角燒瓶中，準(zhǔn)確加入氯仿50ml，稱重，超聲提取40min，水浴溫度45℃。提取液放至室溫，再稱定重量，用氯仿補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10ml，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状挤执稳芙舛ㄈ苡?0ml容量瓶中，得樣品液。

3.4陰性對(duì)照溶液制備

取不含五味子的處方比例量的其他藥材細(xì)粉，照“2.3”項(xiàng)方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.5系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下條件，將對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液分別進(jìn)樣10μl進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖在相應(yīng)的保留時(shí)間處均有最大吸收峰，供試品溶液相鄰峰無干擾；陰性樣品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明該制劑中其他組分對(duì)五味子甲素的測(cè)定無干擾。

3.6線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”步對(duì)照品溶液2ml，加甲醇定容10ml。分別準(zhǔn)確吸取上述溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0μl依次進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，五味子甲素進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為:五味子甲素Y=2643.253X-3.756，r=0.9999(n=5)，線性范圍0.1264～1.5168μg。

3.7精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”步對(duì)照品溶液(濃度為0.2528mg/ml)2μl，按“2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積RSD為1.42%(n=5)。精密度良好。

3.8穩(wěn)定性考察

精密吸取對(duì)照品溶液(濃度為0.2528mg/ml)2μl，分別于配制后0、2、4、8、16、24h進(jìn)樣，測(cè)定面積的RSD為1.81%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定研細(xì)的同一批(090901)樣品粉末2.0g共5份，按“2.3”項(xiàng)方法制備5份樣品溶液，各吸取10μl進(jìn)樣，測(cè)定面積的RSD值為0.99%(n=5)。表明方法重復(fù)性較好。

3.10加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取已知含量五味子樣品液(五味子甲素濃度為0.04136μg/μl)5.0ml6份，分別精密加入濃度為0.2528mg/ml的對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，并分別用甲醇定溶至10.0ml。分別進(jìn)樣10μl，測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。表1加樣回收測(cè)定結(jié)果

3.11樣品含量測(cè)定結(jié)果

取5批五味保肝丸(降酶丸)樣品，批號(hào)分別是：100312、100427、100604、100712、100802，按“2.3”步方法分別制備樣品液，并進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算，5批樣品五味子甲素含量分別為0.3075、0.3121、0.2976、0.2684、0.2713mg/g。按5批樣品含量測(cè)定結(jié)果，暫定降酶丸中五味子甲素含量不低于0.250mg/g。

4討論

五味保肝丸的主要藥效成分為五味子，其主要有效成分為五味子甲素、五味子乙素。《中國(guó)藥典》以五味子甲素含量作為五味子藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]，因此，以五味子甲素含量作為該制劑的制備工藝和質(zhì)量控制指標(biāo)是可行的。

五味子甲素為脂溶性成分，能溶于乙醇、甲醇，極易溶于苯、氯仿、乙醚。因此，在提取樣品中一般都采用乙醚、氯仿、石油醚等有機(jī)溶劑超聲提取后，揮干有機(jī)溶劑，殘?jiān)蛹状级ㄈ輥碇苽錁悠啡芤骸１緦?shí)驗(yàn)采用氯仿超聲提取，甲醇定容來制備樣品溶液，五味子甲素加樣回收率為97.64%，RSD=1.41%(n=6)，效果滿意。

HTLC法測(cè)定五味子及其制劑中有效成分常用的流動(dòng)相多用不同比例的甲醇-水[2～4]，也有用乙腈-水[5，6]，乙腈-甲醇-水[7]和甲醇-四氫呋喃-水[8]。對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明，選用甲醇-水(80：20)，供試品溶液相鄰峰分離度能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

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