導(dǎo)語(yǔ)：姜黃素衍生物C212對(duì)白血病細(xì)胞的作用一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要:目的探討姜黃素衍生物c212對(duì)白血病細(xì)胞的周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用。方法K562細(xì)胞分為低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(分別含1.5，3.0，4.5和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212)，HL－60細(xì)胞分為低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(分別含0.8，1.6，2.4和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212)。用噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位與細(xì)胞周期，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)p53、p21和p27的表達(dá)水平。結(jié)果姜黃素衍生物C212對(duì)K562細(xì)胞24，48和72h的半抑制濃度(IC50)分別為(12.47±0.19)，(3.63±0.06)和(2.00±0.07)μmol·L－1;對(duì)HL－60細(xì)胞24，48和72h的IC50分別為(1.84±0.08)，(1.07±0.03)和(0.76±0.01)μmol·L－1。與對(duì)照組相比，4.5μmol·L－1姜黃素衍生物C212作用于K562細(xì)胞1，2和3h后，膜電位耗散的細(xì)胞從(2.43±0.78)%依次增加到(6.73±0.60)%，(18.30±0.54)%，(31.87±0.83)%;2.4μmol·L－1姜黃素衍生物C212作用于HL－60細(xì)胞1，2和3h后，綠色熒光部分細(xì)胞所占百分比比例從(2.27±0.57)%增加至(9.07±0.69)%，(15.37±0.77)%，(26.87±0.91)%。干預(yù)24h后，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別有(10.71±2.46)%，(25.45±2.10)%，(24.84±2.11)%的K562細(xì)胞和(13.85±2.12)%，(18.03±3.07)%，(21.40±1.94)%的HL60細(xì)胞阻滯于G2/M期。姜黃素衍生物C212劑量依賴性地上調(diào)周期調(diào)控蛋白p53、p27和p21蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論C212一方面通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞線粒體膜電位的耗散，促使細(xì)胞凋亡;另一方面，可通過上調(diào)周期負(fù)調(diào)控蛋白水平，阻滯細(xì)胞周期，抑制白血病細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞:姜黃素衍生物C212;抗白血病;增殖抑制;線粒體膜電位

白血病是一類起源于造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病［1］。姜黃素及其衍生物能夠明顯抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)［2－3］。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一種新型的姜黃素衍生物C212可明顯抑制K562和HL－60細(xì)胞的增殖。本研究旨在探討姜黃素衍生物C212對(duì)白血病細(xì)胞的周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用。

1材料與方法

1材料藥品與試劑姜黃素衍生物C212，純度:＞95%，本課題組對(duì)姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造合成。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;JC－1細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物公司生產(chǎn);β－actin單克隆抗體，美國(guó)SantaCruz公司生產(chǎn);抗p21、p53等一抗，均為美國(guó)CST公司生產(chǎn);BCA蛋白定量試劑、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠/兔免疫球蛋白G(IgG)二抗，均為美國(guó)Pierce公司生產(chǎn)。儀器CX31P－OC－1普通光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品;MicroplateReader450酶標(biāo)儀、EPS600穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，均為美國(guó)Bio－Rad公司產(chǎn)品;FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司產(chǎn)品;免疫印跡成像系統(tǒng)，美國(guó)Carestream公司產(chǎn)品。細(xì)胞株人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562細(xì)胞，人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL－60細(xì)胞，均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)［4］K562和HL－60細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素100U·mL－1和鏈霉素100μg·mL－1(1%雙抗)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于開展本實(shí)驗(yàn)研究。2.2細(xì)胞分組與給藥方法25.00，12.50，6.25，3.13，1.56，0.78和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212分別作用于K562細(xì)胞和HL－60細(xì)胞24，48和72h，用于檢測(cè)姜黃素衍生物C212對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。將4.5和2.4μmol·L－1姜黃素衍生物C212(高劑量實(shí)驗(yàn)組)分別作用于K562細(xì)胞和HL－60細(xì)胞1，2和3h，并設(shè)置未加藥空白對(duì)照組，用于檢測(cè)姜黃素衍生物C212對(duì)線粒體膜電位的影響。將K562細(xì)胞分為低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(分別含1.5，3.0，4.5和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212處置)，HL－60細(xì)胞分為低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(分別含0.8，1.6，2.4和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212處置)，作用24h后，檢測(cè)姜黃素衍生物C212對(duì)細(xì)胞周期及周期調(diào)控蛋白表達(dá)的影響。2.3觀察指標(biāo)2.3.1用MTT法檢測(cè)C212對(duì)K562和HL－60細(xì)胞的增殖抑制作用［4］取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞和HL－60細(xì)胞，稀釋至4×104cell·mL－1，接種于96孔板，每孔180μL，分別加入25.00，12.50，6.25，3.13，1.56和0.78μmol·L－1的姜黃素衍生物C21220μL作為實(shí)驗(yàn)組及相同濃度的二甲基亞砜(DMSO)作為對(duì)照組，設(shè)置背景對(duì)照，每組均設(shè)定3個(gè)平行孔。藥物作用24，48和72h后，每孔加入5mg·mL－1MTT20μL，于37℃繼續(xù)孵育4h，以8000r·min－1離心5min，棄上清液，每孔加入DMSO150μL，震蕩10min，甲臜溶解后，于570nm處測(cè)定光密度(OD)值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(OD對(duì)照組－OD實(shí)驗(yàn)組)/(OD對(duì)照組－OD背景孔)×100%。2.3.2用JC－1染色檢測(cè)C212對(duì)K562和HL－60細(xì)胞線粒體膜電位的影響［5］細(xì)胞分組和給藥方法同“2.2”，以1000r·min－1離心5min，收集細(xì)胞，重懸于1×IncubationBuffer500μL，37℃孵育20min。離心后，棄上清液，1×Incuba-tionBuffer洗2次，1×IncubationBuffer500μL重懸后轉(zhuǎn)移至流式管，4℃避光保存，在60min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，JC－1是線粒體膜電位依賴性探針，線粒體膜電位正常時(shí)，其富集于線粒體以多聚體形式存在，發(fā)紅色熒光;當(dāng)線粒體膜電位耗散時(shí)，JC－1以低聚體形式存在，發(fā)綠色熒光。JC－1紅綠熒光的比值變化反應(yīng)C212對(duì)線粒體膜電位的影響。2.3.3用碘化丙啶(PI)染色檢測(cè)C212對(duì)白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響［6］細(xì)胞分組和給藥方法同“2.2”，以1000r·min－1離心5min，收集細(xì)胞，重懸于預(yù)冷的75%的乙醇5mL中，在－20℃下，固定24h。以5000r·min－1離心5min，棄上清液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗1遍，將細(xì)胞重懸于PI染色液(50μg·mL－1)，于室溫避光染色30min。將其轉(zhuǎn)移至流式管中，于4℃避光，保存在冰上，并在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。2.3.4用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)C212對(duì)p53、p21和p27蛋白水平的影響［4］細(xì)胞分組和給藥方法同“2.2”，收集細(xì)胞，用RIPA冰上裂解30min，以1.2×104r·min－1離心5min，收集上清細(xì)胞裂解液，進(jìn)行BCA定量后，進(jìn)行DSA－PAGE分離蛋白樣品后，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1h，1×TBST洗3遍，4℃一抗孵育過夜，1×TBST洗3遍，HRP－IgG室溫孵育1h，1×TBST洗3遍后，進(jìn)行顯影。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPadPrism軟件和Origin8.5軟件進(jìn)行One－wayanalysisofvariance實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。結(jié)果用x珋±s表示。結(jié)果1C212對(duì)K562和HL－60細(xì)胞的時(shí)量效關(guān)系隨著時(shí)間延長(zhǎng)，黃素衍生物C212對(duì)K562和HL－60細(xì)胞的抑制率逐漸增加，其對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性，其中6.25μmol·L－1黃素衍生物C212作用于K562和HL－60細(xì)胞24，48和72h后，抑制率分別為(37.05±0.48)%，(59.61±1.66)%，(67.02±0.72)%和(63.63±1.23)%，(80.76±0.45)%，(90.43±1.73)%。黃素衍生物C212對(duì)K562和HL－60細(xì)胞24，48和72h的半抑制濃度(IC50)分別為(12.47±0.19)，(3.63±0.06)，(2.00±0.07)μmol·L－1和(1.84±0.08)，(1.07±0.03)，(0.76±0.01)μmol·L－1，且HL－60細(xì)胞對(duì)黃素衍生物C212更加敏感，具有比K562更低的IC50。結(jié)果見圖1。2姜黃素衍生物C212誘導(dǎo)線粒體膜電位的耗散4.5μmol·L－1姜黃素衍生物C212作用于K562細(xì)胞1，2和3h及空白對(duì)照組的綠色熒光部分細(xì)胞所占百分比分別為(6.73±0.60)%，(18.30±0.54)%，(31.87±0.83)%和(2.43±0.78)%;2.4μmol·L－1姜黃素衍生物C212作用于HL－60細(xì)胞1，2和3h及空白對(duì)照組的綠色熒光部分細(xì)胞所占百分比分別為(9.07±0.69)%，(15.37±0.77)%，(26.87±0.91)%和(2.27±0.57)%。與空白對(duì)照組相比較，高劑量實(shí)驗(yàn)組能夠快速耗散白血病細(xì)胞的線粒體膜電位，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。3各組白血病細(xì)胞(K562和HL－60)細(xì)胞周期比較隨著姜黃素衍生物C212濃度的不斷增加，G2/M期的K562和HL－60細(xì)胞比例也明顯隨之增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，細(xì)胞被阻滯在G2/M期，見表1。4各組白血病細(xì)胞K562中p53、p21和p27蛋白表達(dá)水平的比較1.5，3.0，4.5μmol·L－1組和空白對(duì)照組白血病細(xì)胞p53蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.69±0.04，0.66±0.03，0.72±0.02和0.38±0.02，p27蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.60±0.03，0.73±0.03，0.92±0.05和0.33±0.02，p21蛋白相對(duì)表達(dá)量分別0.60±0.01，0.97±0.06，1.02±0.02和0.29±0.01。與空白對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞中p53、p21和p27的水平均顯著性增加，呈劑量依賴性(均P＜0.05)。結(jié)果見圖2。討論在細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)中，可以觀察到因線粒體膜的破裂，各種離子自由通過線粒體膜，使膜電位發(fā)生變化，細(xì)胞色素C(Cyt－C)被釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究顯示，姜黃素衍生物C212能夠引起白血病細(xì)胞線粒體膜電位的耗散，預(yù)示著其可能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，誘導(dǎo)細(xì)胞的衰老在抑制癌癥發(fā)生發(fā)展的初期具有重要意義［7］。p53/p21通路在調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞衰老中表現(xiàn)出重要作用［8］。p53蛋白是重要的抑癌因子之一，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及DNA損傷等重要過程［9］。p21基因是p53關(guān)鍵的下游靶標(biāo)分子之一，能調(diào)控腫瘤細(xì)胞衰老的起始。p21與p53共同組成細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，能降低受損傷DNA復(fù)制的機(jī)會(huì)，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。p53和p21蛋白在白血病細(xì)胞中的總表達(dá)率可達(dá)50%，所以，同時(shí)調(diào)控2種蛋白水平可以提高預(yù)測(cè)白血病預(yù)后的價(jià)值。另外，p27蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控的生物學(xué)功能，提示其可能作為一個(gè)抑癌候選基因，并且有報(bào)道說明了p27與白血病有著相關(guān)密切的聯(lián)系［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素衍生物C212能夠上調(diào)p53、p21和p27的表達(dá)，使受損傷的DNA不能進(jìn)入復(fù)制狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，姜黃素衍生物C212可能通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的衰老來抑制增殖。

作者：沈云珠 劉碧 黃曉威 許建華