導(dǎo)語(yǔ)：二至丸合桂枝湯對(duì)三陰性乳腺癌的作用一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：探討二至丸合桂枝湯對(duì)三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞系順鉑耐藥性的影響及其分子機(jī)制作用。方法：設(shè)計(jì)并合成3條缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）siRNA，分為1#siRNA組、2#siRNA組、3#siRNA組、陰性對(duì)照組及Control組分別轉(zhuǎn)染，Westernblot篩選最適siRNA。同時(shí)利用藥物連續(xù)誘導(dǎo)法篩選順鉑耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞株(MDA-MB-231/CDDP)。制備含二至丸合桂枝湯血清，MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞株隨機(jī)分為A：空白組(轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照)、B：HIF-1αsiRNA組、C：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯組(200µg/ml含藥血清)、D：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯(200µg/ml)+順鉑(10μmol/L)組，繼續(xù)培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞侵襲情況。同時(shí)利用qRT-PCR和Westernblot分別檢測(cè)各組細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、HIF-1αmRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：3#siRNA組HIF-1α蛋白表達(dá)水平抑制最顯著，選此siRNA用于后續(xù)研究。與A組相比，C組和D組在作用24h、48h后均可顯著抑制MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞活性(P＜0.05或P＜0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.01)，且能顯著抑制細(xì)胞侵襲能力(P＜0.05或P＜0.01)，其中，D組作用效果最顯著。qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示二至丸合桂枝湯與順鉑聯(lián)合干預(yù)，可顯著下調(diào)MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)論：二至丸合桂枝湯可通過(guò)抑制HIF-1α通路，下調(diào)VEGF表達(dá)，調(diào)控TNBC細(xì)胞系的順鉑耐藥性。

關(guān)鍵詞：三陰性乳腺癌；二至丸；桂枝湯；順鉑耐藥性

HIF-1α通路三陰性乳腺癌（TNBC）靶向及內(nèi)分泌治療效果不佳，新輔助化療方案對(duì)TNBC具有較高的緩解率和良好的預(yù)后，順鉑為首選化療藥物之一，但存在順鉑耐藥性，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性是有效治療TNBC的潛在策略。缺氧誘導(dǎo)因子l（HIF-1）可促進(jìn)腫瘤增殖和血管新生；HIF-1α功能性亞基與HIF-1活性水平密切相關(guān)。二至丸合桂枝湯可介導(dǎo)HIF-1α對(duì)TNBC細(xì)胞順鉑耐受機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，但其機(jī)制仍未闡明。基于此，本研究利用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染順鉑耐藥性MDA-MB-231（MDA-MB-231/CDDP）細(xì)胞株，深入探討二至丸合桂枝湯介導(dǎo)HIF-1通路對(duì)TNBC細(xì)胞系順鉑耐藥性的調(diào)控機(jī)制，以期為二至丸合桂枝湯的臨床推廣應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞：健康SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量200±30g[購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0015]，飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動(dòng)物中心，動(dòng)物使用SYXK許可證號(hào)為(浙)2020-0024。適應(yīng)喂養(yǎng)1周。轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(貨號(hào)：iCell-h133，賽百慷)，于含青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、5%胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于恒溫培養(yǎng)箱中(37ºC，含5%CO2)。1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：二至丸合桂枝湯(女貞子、旱蓮草各10g，桂枝、芍藥、生姜各9g，炙甘草6g，大棗12枚，水煎至300ml，濃縮至1g/ml)。FBS(貨號(hào)：11011-8615，浙江天杭生物科技)；DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30243.01，Hyclone)；CCK-8試劑盒(貨號(hào)：HY-K0301，MCE)；細(xì)胞凋亡試劑盒(貨號(hào)：556547，BD)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：pc0020，Solarbio)。HIF-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、GAPDH抗體(貨號(hào)：AF1009、AF5131、AF7021，Affinity)。CMaxPlus酶標(biāo)儀(MD)；Micro17R低溫高速離心機(jī)(Thermo)；C6流式細(xì)胞儀(BD)；LightCy-cler®96實(shí)時(shí)熒光定量PCR(羅氏)；NanodroponemRNA定量?jī)x(ThermoScientific)。1.3HIF-1αsiRNA設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)染與分組：合成三條Gan-kyrinsiRNA和一條對(duì)照siRNA，具體序列如下：1#siRNA組(5'-GCUGGAGACACAAUCAUAUTT-3’)；2#siRNA組(5'-AGGAAGAACTATGAACATAAA-3')；3#siRNA組(5'-TACGTTGTGAGTGGTATTATT-3')；陰性對(duì)照組(5'-UUCUCC-GAACGUGUCACGUTT-3')。將HIF-1αsiRNA和Lipo-fectamine™2000轉(zhuǎn)染試劑在OptiMEM介質(zhì)中按照siRNA∶聚合物為1∶1(w/w)制備復(fù)合物。在50nMsiRNA濃度下向細(xì)胞中加入配合物；細(xì)胞在50%～60%融合時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA復(fù)合物。同時(shí)設(shè)置Control組，不做處理。1.4MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞株建立：順鉑連續(xù)誘導(dǎo)法篩選耐藥細(xì)胞株。MDA-MB-231細(xì)胞系取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期接種于DMEM培養(yǎng)液(含順鉑+10%FBS)，0.01、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的順鉑逐漸誘導(dǎo)，48h后換培養(yǎng)液，每2～3d傳代1次，誘導(dǎo)6個(gè)月獲得細(xì)胞株。1.5制備二至丸合桂枝湯血清：20只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，正常組：蒸餾水；給藥組：8.5g·kg-1·d-1二至丸合桂枝湯，灌胃7d。腹主動(dòng)脈收集5ml血標(biāo)本，合并清液，滅活。微孔濾膜濾過(guò)，于－80℃冰箱保存。1.6給藥處理實(shí)驗(yàn)分組：MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞株在10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞隨機(jī)分為A：空白組(轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照)、B：HIF-1αsiRNA組、C：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯(200µg/ml含藥血清)組、D：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯(200µg/ml)+順鉑(10μmol/L)組，培養(yǎng)48h。1.7Westernblot：分離目標(biāo)蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，先后加一抗和二抗孵育，免疫印跡反應(yīng)結(jié)束后，化學(xué)發(fā)光儀顯影。1.8CCK-8檢測(cè)：根據(jù)“1.6”細(xì)胞分組，培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液，加入10μl/孔CCK-8試劑，而后于450nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活性。1.9流式細(xì)胞術(shù)：于6孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml。添加500μl結(jié)合緩沖液，上清液離心并添加100μl結(jié)合緩沖液。之后分別加入5μl和10μlPI的膜AnnexinV-FITC。室溫下反應(yīng)15min，加入400μl結(jié)合緩沖液，1h內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次。1.10Transwell細(xì)胞侵襲：將5×104個(gè)細(xì)胞接種在Transwell上部隔室的無(wú)血清培養(yǎng)基中，并在下部隔室中添加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24h后棉簽擦拭基質(zhì)膠和上部隔室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色30min。倒置顯微鏡觀察。重復(fù)3次。1.11qRT-PCR檢測(cè)：按試劑盒操作說(shuō)明，加Trizol提取各組細(xì)胞總mRNA，mRNA質(zhì)量檢測(cè)完畢后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA為模板，特異性擴(kuò)增VEGF、HIF-1α，GAPDH為內(nèi)參。VEGF及HIF-1αmRNA表達(dá)量應(yīng)采用2-△△Ct方法計(jì)算。各引物序列見(jiàn)表1。

2結(jié)果

2.1HIF-1α蛋白表達(dá)在不同siRNA下的影響：利用Westernblot篩選合適的HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖1，在MDA-MB-231細(xì)胞中，相比Control組，2#、3#siRNA組的HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，且3#siRNA抑制效果比2#siRNA更好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇3#siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。圖1不同siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)情況2.2MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞活性在二至丸合桂枝湯聯(lián)合用藥下的影響：由圖2，作用24h、48h后，與A組相比，C組和D組細(xì)胞活性均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。圖2MDA-MB-231細(xì)胞活性變化情況（-x±s，n=6)2.3二至丸合桂枝湯聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞凋亡的影響：由圖3，與A組相比，各組別細(xì)胞凋亡率均有一定程度的升高，其中，D組促進(jìn)細(xì)胞凋亡效果最好，凋亡率最高。2.4二至丸合桂枝湯聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞侵襲能力的影響：由圖4，各給藥組不同程度地抑制細(xì)胞侵襲。與A組相比，細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)的是C和D組MDA-MB-231/CDDP，且D組抑制細(xì)胞侵襲能力最顯著。2.5MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中VEGF、HIF-1αmRNA及蛋白表達(dá)在二至丸合桂枝湯聯(lián)合用藥下的影響：由圖5可知，與A組相比，VEGF、HIF-1αmRNA表達(dá)均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，在各干預(yù)組MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中，C組、D組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中，降低程度最明顯的是D組細(xì)胞中HIF-1α、VEGFmRNA及蛋白表達(dá)。

討論

TNBC在中醫(yī)學(xué)屬“奶巖”“乳巖”等范疇，病位在乳房，病根在肝腎，治療的關(guān)鍵在于補(bǔ)腎益肝、調(diào)理陰陽(yáng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，二至丸合桂枝湯可通過(guò)上調(diào)5-羥色胺、抑制素B水平，有效改善絕經(jīng)前Luminal型乳腺癌患者的臨床癥狀[1]。研究表明，HIF-1αsiRNA通過(guò)Westernblot篩選而來(lái)，從結(jié)果得出，受到明顯抑制的是位于3#siRNA組MDA-MB-231細(xì)胞中的HIF-1α蛋白表達(dá)，故選用3#siRNA組HIF-1αsiRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。CCK-8檢測(cè)結(jié)果作用24h、48h后，D組可顯著抑制細(xì)胞活性且效果最好，提示二至丸合桂枝湯聯(lián)合順鉑可有效抑制MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞活性，有效改善MDA-MB-231/CD-DP細(xì)胞的耐藥性。HIF-1可調(diào)節(jié)氧代謝，HIF-1α在多種腫瘤中表達(dá)高[2]。乳腺癌細(xì)胞耐藥形成過(guò)程中HIF-1α意義特殊，利用HIF抑制劑共同給藥可逆轉(zhuǎn)耐藥。此外，VEGF在多種腫瘤疾病中作用顯著，可促進(jìn)腫瘤血管新生和癌細(xì)胞增殖[3]。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF受HIF-1α調(diào)控，可促進(jìn)VEGF表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境，進(jìn)而利于癌細(xì)胞的生長(zhǎng)浸潤(rùn)與遷移[4]。研究指出[5]，通過(guò)抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑，可提高多西他賽的化學(xué)敏感性，抵抗轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌的進(jìn)程。各干預(yù)組均可在一定程度上降低MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表達(dá)，且D組降低程度最顯著，證實(shí)二至丸合桂枝可介導(dǎo)HIF-1α通路，下調(diào)VEGF表達(dá)，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性，加大順鉑對(duì)TNBC的治療效果。HIF-1α還可活化促凋亡分子，拮抗抑凋亡分子，參與細(xì)胞凋亡[6]。研究結(jié)果證實(shí)，介導(dǎo)HIF-1α途徑抑制VEGF表達(dá)量，可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。各干預(yù)組均可上調(diào)MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞凋亡率，而HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯+順鉑組凋亡率最高，證實(shí)二至丸合桂枝湯可增加MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度，通過(guò)抑制HIF-1α表達(dá)，然后加快細(xì)胞凋亡。綜上，二至丸合桂枝湯可通過(guò)抑制HIF-1α通路，下調(diào)VEGF表達(dá)，調(diào)控TNBC細(xì)胞系的順鉑耐藥性。

作者：楊慧芬 毛娟娟 單位：杭州市中醫(yī)院 寧波市中醫(yī)院