導(dǎo)語：膽堿乙酰酶活性管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的研究銀杏葉提取物(EGb)對點(diǎn)燃模型幼鼠學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能，對大鼠海馬乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性的影響。方法21、35日齡SD大鼠各40只，經(jīng)初篩后隨機(jī)分為生理鹽水對照組、點(diǎn)燃對照組及EGb大、中、小劑量治療組，采用戊四氮（PTZ）誘導(dǎo)幼鼠點(diǎn)燃模型，以Y型電迷宮及生化檢測方法，觀察用藥前后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬AChE、ChAT活性的變化。結(jié)果EGb呈劑量依賴性顯著改善實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,并顯著抑制海馬AChE活性、增強(qiáng)ChAT的活性。結(jié)論EGb可以通過抑制功能腦區(qū)AChE活性、增加ChAT的活性,增強(qiáng)中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能，改善發(fā)育期癲疒間大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

【關(guān)鍵詞】銀杏葉提取物；學(xué)習(xí)記憶；乙酰膽堿酯酶；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；點(diǎn)燃模型；大鼠

EffectofextractsofGinkgobilobaleafonthelearning-memoryabilityandtheactivity

ofAChEandChATinthehippocampusinratswithkindling-inducedepilepsy

DUANFangrong,YUANBaoqiang*

(DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofextractsofGinkgobilobaleaf(EGb)onthecognitivefunctionssuchaslearningandmemoryabilitiesandpossiblemechanismsinyoungratswithkindling-inducedepilepsy,andontheactivityofacetylcholinesterase(AChE)andcholineacetyltransterase(ChAT)inrat.Methods40postnatalday21(P21)and40postnatalday35(P35)Sprague-Dawley(SD)ratswererandomlyassignedrespectivelyinto5groups:normalsaline(NS)control,kindlingepilepsymodel,high,middleandlowdosageofEGb-treatedkindlingepilepsyafterpreliminaryscreeningbyY-mazetest.Thekindlingmodelwasestablishedbyanintraperitonealinjectionofpentetrazole(PTZ).Thevariationsoflearning-memoryabilityandtheactivityofAChEandChATinthehippocampuswereobservedbyY-mazetestandbiochemistrydetermination.ResultsEGbcouldobviouslyimprovetheachievementofY-mazetestofthekindlingmodelinadose-dependentmanner,withtheactivityofAChEandChATinthehippocampusinhibitedandincreased,respectively.ConclusionEGbcanimprovelearning-memoryabilityinepilepticratsofdevelopmentalphasebyincreasingtheChATactivityandreducingtheAChEactivity,whichmaycontributetoitsactioninimprovingtheabilityofcholinergicnervoussystem.

Keywords:extractsofGinkgobilobaleaf;learning-memory;AChE;ChAT;kindlingmodel;rats

銀杏葉提取物(extractsofGinkgobilobaleaf,EGb)是從銀杏葉中利用醇溶液提取出的混合成分，主要含有銀杏總黃酮苷、銀杏內(nèi)酯和有機(jī)酸等，具有多價(jià)性藥理作用［1］。其作為一種中樞神經(jīng)賦活劑，目前國內(nèi)外已將EGb廣泛應(yīng)用于治療腦動脈硬化、腦梗死后遺癥和老年神經(jīng)精神癥狀如注意力不集中、記憶力減退、意識模糊等，在臨床上明顯地改善了腦功能不全患者的學(xué)習(xí)記憶能力，因而被認(rèn)為是一種“認(rèn)知增強(qiáng)劑”［2-4］。目前認(rèn)知問題亦是癲疒間兒童在臨床診斷和治療中的常見癥狀，但尚缺乏較好的處理措施。而關(guān)于EGb對癲疒間患者尤其是癲疒間兒童學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙影響的實(shí)驗(yàn)研究或臨床研究少見報(bào)道。本研究旨在探討EGb對癲疒間模型幼鼠認(rèn)知功能的影響及可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用EGb治療癲疒間兒童認(rèn)知功能障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物21、35日齡SD幼鼠，體重55～95g，雌雄不分，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2藥物及試劑EGb（銀杏總黃酮苷＞24%，銀杏內(nèi)酯＞6%，峰比0.8～1.0,銀杏酸＜1×10-6%），由徐州富偉生化制品有限公司惠贈；戊四氮(PTZ)購于Sigma公司；AChE、ChAT試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3儀器Y型電迷宮，張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn)；GL20C超速冷凍離心機(jī)，武漢科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；752紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);水浴箱，上海醫(yī)學(xué)儀器廠。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立參考文獻(xiàn)［5］方法。用PTZ亞驚厥劑量（32mg/kg）,腹腔注射,每天1次,連續(xù)注射28天。停藥1周后,再用相同劑量的PTZ測試。癲疒間發(fā)作行為按Racine標(biāo)準(zhǔn)分為6級,即：0級，未發(fā)作；Ⅰ級，頭面部抽搐；Ⅱ級，肌陣攣、跳起,但無直立；Ⅲ級，肌陣攣,雙前肢抬起伴有直立；Ⅳ級，強(qiáng)直-陣攣性驚厥；Ⅴ級，全身強(qiáng)直-陣攣性驚厥伴有翻滾、跌倒。凡顯示連續(xù)5次2級以上驚厥的大鼠,被認(rèn)為達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，即點(diǎn)燃模型制備成功。

1.2.2動物分組及藥物處理先用Y型電迷宮初步篩選21、35日齡大鼠各40只，然后進(jìn)行點(diǎn)燃模型的制備，造模成功后隨機(jī)分為5組(n=8)：生理鹽水組(NS組)、點(diǎn)燃對照組(PTZ組)、EGb大劑量300mg/kg治療組(PTZ+EGb1組)、EGb中劑量200mg/kg治療組(PTZ+EGb2組)、EGb小劑量100mg/kg治療組(PTZ+EGb3組)。EGb以5%的乙醇為溶劑制備成10%的混懸液，采用灌胃給藥,NS組和PTZ組給予相同體積的生理鹽水,每日1次，連續(xù)給藥7天。所有大鼠均在同一實(shí)驗(yàn)室和動物中心操作和飼養(yǎng)，以保持喂養(yǎng)、光照、噪聲等條件相同。

1.2.3學(xué)習(xí)記憶功能的訓(xùn)練與評定參照王躍春［6］方法，電流強(qiáng)度0.7mA，電壓50V，電擊延時(shí)5s。

篩選：將大鼠放入Y型迷宮箱中適應(yīng)3min后，給予適當(dāng)電擊，至其對3臂均探索進(jìn)入為止，選擇活躍、對點(diǎn)擊反應(yīng)較敏感、逃避反應(yīng)迅速者供測試用。淘汰反應(yīng)過于遲鈍或特別敏感的大鼠。

訓(xùn)練及評定：采用隨機(jī)休息不固定訓(xùn)練次數(shù)法，以大鼠在足底通電后15s內(nèi)一次性進(jìn)入安全區(qū)的反應(yīng)為正確,直至大鼠在連續(xù)10次電擊中有9次或以上正確（9/10標(biāo)準(zhǔn)）為達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，以每只大鼠達(dá)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需電擊次數(shù)表示大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績。所有訓(xùn)練在1個(gè)實(shí)驗(yàn)日內(nèi)完成。各組在造模后次日及治療后7天進(jìn)行認(rèn)知功能的評定。

1.2.4海馬AChE、ChAT活性的測定在完成認(rèn)知功能評定步驟后斷頭處死大鼠,冰臺上迅速取腦并剝離海馬,用濾紙吸去海馬上的血液,精密稱重,腦重∶生理鹽水以1∶9比例加入4℃生理鹽水制成腦勻漿,3000r/min離心10min,取上清液待測。

海馬AChE、ChAT活性的測定嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行，752型紫外分光光度計(jì)進(jìn)行比色。腦組織蛋白測定采用考馬斯亮蘭試劑盒。

設(shè)定每毫克組織蛋白樣本在37℃保溫6min,水解反應(yīng)體系中1μmol基質(zhì)為1個(gè)AChE活力單位；在pH7.2條件下，25～30℃時(shí)每分鐘轉(zhuǎn)移1nmol乙酰膽堿的能力定義為一個(gè)ChAT活力單位。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示；多組間的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，治療前后的比較采用配對t檢驗(yàn)（Paired-SamplesTTest）,不同日齡組的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-SampleTTest)；P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1點(diǎn)燃模型的建立PTZ腹腔注射1周左右大鼠陸續(xù)出現(xiàn)程度不等的疒間性發(fā)作,為Ⅰ～Ⅲ級,以后發(fā)作程度逐漸加劇,在連續(xù)注射28天后所有大鼠均達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)。大鼠的疒間性發(fā)作基本上在每次腹腔注射PTZ后5～6min出現(xiàn),一般在10min左右達(dá)到高峰,高峰過后時(shí)而表現(xiàn)安靜,時(shí)而有陣發(fā)性陣攣,一般30min后很少再有抽搐發(fā)作。PTZ點(diǎn)燃成功的大鼠,有慢性、自發(fā)性、復(fù)發(fā)性的發(fā)作過程。

2.2各組大鼠行為學(xué)測試Y型電迷宮測試結(jié)果見表1。

2.2.1治療前不管是21日齡還是35日齡的大鼠，PTZ各組與其同齡NS組相比，達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需的電擊次數(shù)明顯增多(P<0.01)，而PTZ各組之間沒有明顯差異(P>0.05)；21日齡與35日齡的PTZ各組相互比較，前者達(dá)標(biāo)次數(shù)亦明顯增多(P<0.05);21日齡與35日齡的NS組相互比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1各組大鼠Y型電迷宮試驗(yàn)達(dá)標(biāo)所需電擊次數(shù)與NS組比較：*P<0.01；與治療后PTZ組比較：#P<0.01；與PTZ+EGb2組比較：※P<0.01；與同組治療前比較：☆P<0.05；與21日齡組比較：△P<0.05。

2.2.2治療后2個(gè)日齡EGb治療組達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)的次數(shù)均明顯少于同齡PTZ組(P<0.01)；同齡EGb大、中、小劑量治療組相互比較,達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)的次數(shù)隨EGb治療劑量的減少逐漸增多，呈現(xiàn)劑量依賴性遞增(P<0.01)；各EGb組的2個(gè)年齡段之間卻未示明顯差異(P>0.05)。

21日齡、35日齡各組治療前后相互比較，EGb各劑量治療組治療后達(dá)標(biāo)次數(shù)均明顯少于治療前(P<0.01或P<0.05)；NS組、PTZ組治療前后差異無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3生化檢測不管是21日齡還是35日齡的大鼠，PTZ組與各自的NS組比較，海馬AChE、ChAT的活性都明顯降低(P<0.01)；各EGb治療組與其同齡PTZ組相比，隨治療劑量的增加，AChE活性逐漸降低、ChAT活性則逐漸提高，呈劑量依賴性(P<0.01)；各組的2個(gè)年齡段之間AChE、ChAT的活性均未示明顯差異(P>0.05)。見表2。表2各組大鼠海馬AChE、ChAT活性的比較與PTZ組比較：☆P<0.01；與PTZ+EGb2組比較：△P<0.01；與21日齡PTZ組比較：▲P>0.05

3討論

點(diǎn)燃模型作為一種最常用的癲疒間動物模型,具備慢性、自發(fā)性和復(fù)發(fā)性特征,點(diǎn)燃一旦建立,動物的這種腦細(xì)胞及驚厥行為敏感性可長期維持及至終身,較好地模擬了人類癲疒間的進(jìn)行性發(fā)展和長期反復(fù)的自限性發(fā)作形式。許多研究表明，不同形式癲疒間發(fā)作過程中常伴有海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)選擇性神經(jīng)元脫失、苔蘚纖維出芽(sprouting)和特異性突觸重建等形態(tài)學(xué)改變［7-9］，在人類復(fù)雜部分性發(fā)作和兒童期癲疒間患者亦可觀察到同樣的變化［10］,這表明點(diǎn)燃與人類癲疒間的形成可能有共同的機(jī)制，因此點(diǎn)燃模型是研究慢性癲疒間較理想的動物模型。臨床資料顯示癲疒間患者中30%～40%存在認(rèn)知功能障礙［11］，在兒童患者更為顯著，臨床上表現(xiàn)為某種程度的學(xué)習(xí)困難或?qū)W習(xí)不能、語言能力的損傷等，但臨床上對此缺乏有效的手段來改善這一現(xiàn)狀。

本實(shí)驗(yàn)采用戊四氮化學(xué)點(diǎn)燃方法,復(fù)制出了接近人類癲疒間的慢性癲疒間模型，本實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn):點(diǎn)燃組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著低于NS組,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似，說明本造模法穩(wěn)定可靠,適用于學(xué)習(xí)記憶等高級神經(jīng)功能活動的研究。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，21日齡模型鼠的行為學(xué)指標(biāo)與35日齡的相比，差異具有顯著性，與以往研究結(jié)果相一致，即癲疒間幼鼠起病越早，對學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能損傷越嚴(yán)重［12］。

目前認(rèn)為中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系極為密切，有資料表明,海馬的膽堿能系統(tǒng)直接參與信息的儲存和回憶。而AChE及ChAT是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，兩者共同維持著中樞膽堿能系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿（ACh）的動態(tài)平衡,在多種高級腦功能包括學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮重要作用，所以用AChE及ChAT的活性來反映膽堿能系統(tǒng)的功能較為可靠。許多藥理學(xué)及臨床研究已證實(shí)海馬和新皮層的膽堿能損傷可以損害大鼠和人的記憶功能。我們的研究顯示,點(diǎn)燃大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退,同時(shí)伴有海馬AChE、ChAT活性降低,提示戊四氮誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙與海馬及新皮層膽堿能系統(tǒng)的功能降低有關(guān)，這與以往的研究結(jié)果一致。在應(yīng)用銀杏葉提取物EGb治療后發(fā)現(xiàn)，EGb顯著改善了癲疒間鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，還顯著降低AChE的活性，增強(qiáng)ChAT的活性，并且在100～300mg/kg范圍內(nèi)，EGb的這種藥理作用呈劑量依賴性增強(qiáng)。表明EGb能改善癲疒間大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制可能與抑制腦AChE活性、增加ChAT的活性,從而提高ACh含量,增強(qiáng)中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能有關(guān)。諸多的研究顯示，EGb還可能通過促進(jìn)大腦海馬膽堿的再攝取、減少M(fèi)型膽堿受體和腎上腺素受體及遞質(zhì)的丟失、促進(jìn)大腦循環(huán)代謝、增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的敏感性等途徑發(fā)揮改善學(xué)習(xí)和記憶能力的功能［13］。近年來的臨床研究也發(fā)現(xiàn)EGb可明顯改善血管癡呆患者的智能障礙，這種作用可能與EGb加速神經(jīng)沖動的傳導(dǎo),易化突觸傳遞,從而有利于信息獲得、記憶鞏固和再現(xiàn)有關(guān)［14］。本實(shí)驗(yàn)中2個(gè)不同年齡段對應(yīng)組間生化指標(biāo)比較未示顯著差異，說明除膽堿能系統(tǒng)外可能還有其他機(jī)制影響癲疒間幼鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：EGb可以通過抑制學(xué)習(xí)記憶功能腦區(qū)AChE活性、增強(qiáng)ChAT活性、增強(qiáng)中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能來改善點(diǎn)燃模型幼鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，為EGb用于臨床治療癲疒間兒童認(rèn)知功能障礙提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并且進(jìn)一步拓展了EGb的藥用價(jià)值。

【參考文獻(xiàn)】

［1］危華玲.銀杏葉提取物和山楂提取物的藥理作用研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2006，18（2）：5-7.

［2］汪建龍.銀杏葉提取物在心腦血管疾病上的臨床應(yīng)用概況［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥,2003,14（4）:243-244.

［3］GertzHJ,KieferM.ReviewaboutGinkgobilobaspecialextractEGb761(Ginkgo)［J］.CurrPharmDes,2004,10(3)：261-264.

［4］WangY,WangL,WuJ,etal.TheinvivosynapticplasticitymechanismofEGb761-inducedenhancementofspatiallearningandmemoryinagedrats［J］.BrJPharmacol,2006,148(2)：147-153.

［5］王麗，OnoJ,WalsonPD.大鼠戊四唑點(diǎn)燃模型的建立［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào),1993,28(7):486-489.

［6］王躍春.Y型電迷宮在大鼠學(xué)習(xí)記憶功能測試中的合理應(yīng)用［J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2005，14(1):69-70.

［7］劉月影，袁寶強(qiáng).c-fos反義寡聚核苷酸對癲疒間發(fā)作后細(xì)胞凋亡的影響［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2006，21（15）：1017-1018.

［8］陳靜，袁寶強(qiáng).戊四氮誘導(dǎo)發(fā)育鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后海馬突觸素的變化及MK-801的影響［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26（2）：120-124

［9］MortazaviF,EricsonM,StoryD,etal.Spatiallearningdeficitsandemotionalimpairmentinpentylenetetrazole-kindledrats［J］.EpilepsyBehav,2005,7(4):629-638.

［10］MohamedA,WyllieE,RuggieriP,etal.Temporallobeepilepsyduetohippocampalsclerosisinpediatriccandidatesforepilepsysurgery［J］.Neurology,2001,56(2):1643-1649.

［11］洪霞，黃茂盛，王蓓.癲疒間患者的認(rèn)知功能狀況分析［J］.臨床神經(jīng)電生理學(xué)雜志，2002，11（2）：88-90.

［12］HermannB,SeidenbergM,BellB,etal.Theneurodevelopmentalimpactofchildhood-onsettemporallobeepilepsyonbrainstructureandfunction［J］.Epilepsia，2002,43(9):1062-1071.

［13］NathanP.Canthecognitiveenhancingeffectsofginkgobilobabeexplainedbyitspharmacology?［J］.MedHypothese,2000,55(6):491-493.

［14］DeFeudisFV,DrieuK.Ginkgobilobaextract(EGb761)andCNSfunctions:basicstudiesandclinicalapplications［J］.CurrDrugTargets,2000,1(1):25-58.