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摘要:目的驗證以問題為基礎(pbl)教學法在提高學生處理聚合酶鏈反應(PCR)污染能力方面的作用。方法以PCR假陽性為實例,采用PBL教學法引導學員合理設立空白對照,通過重復試驗探究污染來源。結果學員在思維引導幫助下逐步發現PCR污染來源于引物污染,并對試驗方法及理論有了清晰的認識。結論以實例講解為基礎的PBL教學法可有效提高學生認識和處理PCR污染的能力。

關鍵詞:以問題為基礎教學法;實例講解;定量聚合酶鏈反應;引物污染

隨著生物科技的發展,以聚合酶鏈反應(PCR)為主的核酸試驗應用越來越廣泛[1],實驗室質量控制和生物安全是PCR技術初學者應掌握的重要內容[2]。不論是中學、大學實驗課的學生還是實驗技術方面的初學者對避免核酸污染等質量控制的意識均不強。由于PCR耗時較長,注意力不易集中[3],容易受核酸污染,必須設計空白對照才能及時發現假陽性結果[4],但枯燥的理論講解學生不易接受,教學效果不好。以問題為基礎(PBL)教學法是一種基于“問題”為中心的教學模式,是目前國際上較為流行的一種教學法。案例選擇和問題設計是PBL教學法的主要切入點,對初學者理解抽象問題非常有幫助。本文圍繞在一次PCR教學試驗中發現空白對照管中有核酸污染的實例,遂把PBL教學法應用于枯燥的對照重復試驗,理清了發現和判定核酸污染來源的過程,學生們反映教學效果很好,理解較為深刻。

1資料與方法

1.1學生情況及試驗事件

小班教學,學生5人,教學過程發現空白對照管有核酸擴增,于是采用PBL教學法[5],以實例為引導,設計教學試驗,結合實際圖表,啟發學生分層思維,最終引導學生們找到污染源。

1.2一般資料

組織來源為6份液氮凍存的SD大鼠肝臟組織。大鼠來源的Yes相關蛋白(YAP)引物兩種,分別由美國Invitrogen和中國上海生工公司設計合成,均具有較好的特異性。

1.3儀器與試劑

熒光定量PCR儀為RocheLightCycle(2.0)系統,軟件版本3.5。采用Trizol總RNA試劑提取總RNA,取材器械、凍存管及雙蒸水(ddH2O)均經1%二乙基焦碳酸酯水處理。反轉錄試劑盒(DRR03S)及熒光定量PCR試劑盒(DRR041S)均購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司。

1.4方法

PBL教學法采用案例選擇、問題設計、思維導圖、情景教學等,以實例為線索,以學生為主導。

1.5試驗技術方法

RNA提取應用Trizol、氯仿、異丙醇提取,75%乙醇洗滌RNA沉淀。應用凝膠電泳法(瓊脂糖)鑒定RNA未被降解,以紫外分光光度計對RNA樣品進行純度分析和定量。反轉錄合成cD-NA按試劑盒配制反應體系。1.6統計學處理采用LightCycler數據分析軟件對數據進行分析處理。直觀比較Ct值[6],Ct值越大,起始模板數越低。

2結果

2.1以實例為引導,使學生直觀認識什么是核酸污染

PCR擴增試驗結束后發現“空白對照管”的反應曲線清晰可見,說明該反應體系內有核酸擴增,可推斷空白對照管反應體系內存在核酸污染。通過反應曲線圖學生們對“假陽性”有了直觀認識。

2.2問題出在哪里?

引導學生自問自答空白對照管中含有3種成分:ddH2O、引物及PCR試劑,其中ddH2O的配制、分裝、加樣過程操作較多,比較容易污染,而且ddH2O較引物和PCR試劑更容易獲取,應作為首先排除對象。

2.3與學生一道設計驗證試驗

選用新的ddH2O作為對照,重復試驗,同時原ddH2O同步參與重復試驗,試驗反應條件不變,引物不變,挑選擴增曲線較好的7號樣品作為cDNA模板,觀察在含新ddH2O的反應體系中是否有核酸擴增,結果見表1。通過比較PCR結束后的Ct值可比較反應體系的起始模板核酸量,Ct值越大,核酸量越小。

2.4ddH2O污染的可能性很小

學生們一致認為,B管和D管均無模板,但均有核酸擴增,Ct值差別不大(即起始模板數差別不大),所以2個反應體系均有核酸污染,且污染程度相近。因B、D這2管分別為不同的ddH2O,2次配制的ddH2O均有污染的可能性較小。特別是B、D這2管的Ct值相近,污染程度相同,故暫不考慮污染源是ddH2O。另外,學生們認為,A管和C管有相等數量模板,ddH2O不同,因Ct值差別不大,說明起始模板數差別不大,同樣說明2次配制的ddH2O無明顯差別。因此,前、后2次ddH2O均被污染的可能性均很小,綜合分析后考慮為ddH2O以外的試劑有污染。

2.5教員思維引導,學生制訂方案

教員提示:試驗所用引物一般來自2家公司,每次所用引物是經過分裝的。學生們思考后認為,分裝引物過程存在污染的可能,如需驗證引物污染,可以選取未開封、未分裝的原引物。另外,可選用另一家公司的引物同時做對照,發現原引物出廠時已被污染。進一步重復試驗,試驗條件不變,目的是驗證原分裝引物中是否有核酸污染。見表2。Ct值很大說明起始模板的核酸量很小,Ct值為0.00,說明反應體系內不含核酸模板。

2.6引物

1(首次試驗分裝后的引物)為污染源學生們逐條分析:H管含標準模板,擴增同前,提示引物2可用。F管、G管無擴增,說明ddH2O、PCR試劑、引物1'(新開封的引物1原裝液)及引物2(另一家引物公司設計及制備的引物)均無核酸污染。E管反應體系未加入cDNA模板但仍有核酸擴增,考慮引物1有污染,結合E管擴增曲線Ct值遠遠大于有標準模板擴增的H管,說明起始模板數很小,這符合試驗中引物加樣量較小的實際情況。全體學生一致認為,分裝引物1內的核酸污染是污染源,推測是引物分裝或加樣過程中污染。

3討論

在分子生物學教學實踐中,有關PCR中核酸污染的內容是一個難點。在理論層面,學生們基本掌握核酸污染方式中最重要的是氣溶膠污染[7],因此,包括PCR在內的核酸試驗被要求在生物安全柜內進行操作。在污染源分型上亦不難理解,常見污染類型包括:(1)標本污染,包括收集標本的容器污染,標本密封不嚴造成交叉污染及核酸提取過程中吸樣槍污染。(2)PCR試劑污染[8],包括加樣槍、容器、ddH2O等溶液被PCR核酸模板污染。(3)PCR產物污染,有報道PCR產物污染離心機,導致氣溶膠顆粒在離心機氣流作用下進入到未蓋嚴的離心管中[9-10]。本文通過激發學生的逆向思維分析,主動了解污染類型及污染可能來源,使孤立的試驗方法變得系統,使試驗教學更生動、高效,增強了學生的主動性,提高了學習效率。教學中常常強調PCR污染的監測可通過對照試驗來實現,陰性對照尤為重要,每次PCR務必做陰性對照,包括不加模板的空白對照、不加引物的空白對照及模板和引物均不加僅有試驗試劑的空白對照等。但學生們沒有切身感受,常有僥幸心理,為了減少試驗步驟、節省時間會省略部分甚至全部陰性對照的配制。本研究就是沒有設置無引物的對照,所以導致無法在發現假陽性的第一時間判斷污染的來源。本教學試驗中發現空白對照有DNA擴增,污染來源不明,當無法準確判斷污染源時需進一步設計對照試驗,以找出污染源。進一步的試驗仍需要設立空白對照,根據下一步試驗結果確定或排除某類污染源,最后通過試驗驗證污染源。引物污染較隱蔽,對試驗結果的影響容易被忽視,只有設立良好的空白對照,才能及時發現假陽性和判定假陽性的來源。引物污染具有不易被發現的特殊性[11-12],由于擔心原裝引物內有污染,試驗中學生們拓展思維,應用了2個不同的引物進行PCR擴增,一個是新開封的引物原裝液,另一個是另一家引物公司設計及制備的引物,從2個層級搜尋污染源,最終發現是分裝的引物內有核酸污染,可能是在分裝過程或使用過程中被污染。這期間,學生參與了試驗設計方案,對設計過程及試驗過程均透徹理解。教學中教員進一步強調,鑒于核酸污染的發生率較高,并且所導致的后果嚴重,PCR實驗室內應采取相應的措施防范污染。一些單位參照美國PDCA[P策劃(P)、實施(D)、檢查(C)、處置(A)]質量管理循環體系,在控制實驗室污染方面已經取得明顯效果[13]。另外,通過加強PCR分析前的質量控制[14]、對實驗室進行環境監測,均有利于提高檢測結果的準確性[15]。以上諸多措施均是避免PCR污染的有效方法,但如果不設空白對照卻無法發現污染源,如果空白對照不夠全面,亦無法判定污染來源。空白對照的設立是PCR發現和判定假陽性的關鍵,是避免試驗結果受核酸污染影響的重要手段。PBL教學法的目的是提高學生發現問題、解決問題的能力,因此,設計問題要緊密結合PCR的實際,由淺入深、層層推進,讓學生能夠思路清晰、邏輯清楚地完成實驗流程,從而解決試驗中的問題。本文應用PBL教學法加實例教學,把復雜的PCR污染問題逐步轉化為層次分明、邏輯清楚的科學問題,突破傳統教學模式。在試驗教學過程中,教師由知識的傳授者轉變為邏輯分析的引導者,通過學生自主學習和理解解決疑難問題。

作者：王成 趙剛 孔亞林 蒲猛 戴競耀 劉承利 單位：空軍特色醫學中心 肝膽外科 外科學教研室