胃蛋白酶范文
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篇1
據報道，測定血清胃蛋白酶原進行胃癌早期診斷的普查以及胃癌的預防干預計劃，已在日本、芬蘭、挪威等國家實行。日本利用胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ在大面積的人群中進行普查，使胃癌的早診率提高到了90％。
以往的研究表明，血清胃蛋白酶原水平可反映不同部位胃黏膜的形態和功能，聯合測定胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ比值(PGR)被視為胃黏膜的“血清學活檢”。
在正常人血清中的胃蛋白酶原Ⅰ濃度是胃蛋白酶原Ⅱ的6倍。胃蛋白酶原Ⅰ正常參考值范圍為67～200 微克/升。
胃蛋白酶原Ⅰ
胃蛋白酶原Ⅰ>200微克/升：提示可能與飲食、藥物的刺激或幽門螺旋桿菌感染以及胃潰瘍、十二指腸潰瘍有關。
胃蛋白酶原Ⅱ正常參考值范圍
胃蛋白酶原Ⅱ>15微克/升：提示可能與幽門螺旋桿菌感染、胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及胃竇部的疾病有關；
胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值（PGR）正常參考值范圍為>7.5。
PGR
眾多流行病學證據表明，胃癌患者胃蛋白酶原Ⅰ較健康者明顯下降，胃蛋白酶原Ⅱ因為分布較廣、變化不大。而胃癌患者PGR明顯降低，是胃癌的高危信號。可見，血清胃蛋白酶原的測定是普查中篩選胃癌的良好指標。
臨床上，若血清胃蛋白酶原呈現“陽性”結果，需再進一步進行多種腫瘤標志物的聯合檢測。這樣常可在臨床癥狀出現之前數月鑒別出復發和轉移。胃蛋白酶原陽性者應每年檢查一次胃鏡，并進行密切隨訪，以早期發現變化，早期在內鏡下進行治療，以達到根治的目的。
篇2
【關鍵詞】 胃蛋白酶原； 萎縮性胃炎； 胃癌 ；應用價值
Application value of serum pepsinogen detection in early diagnosis of gastric cancer SHI Ling-ling， ZHANG Ying-bo， DONG Lin. Department of Clinical Laboratory， Sanmenxia Central Hospital， Sanmenxia 472000， China
【Abstract】 Objective To investigate the application value of serum pepsinogen detection in early diagnosis of gastric cancer. Methods A total of 89 cases stomach illness were treated as the experimental group， and 40 cases of healthy people as the health control group. Results The levels of pepsinogenⅠ（PGⅠ） and ratio between PGⅠand PGⅡ（PGR） in the atrophic gastritis and gastric cancer groups were all lower than the healthy control group， and the differences were statistically significant （P
【Key words】 Pepsinogen； Atrophic gastritis； Gastric cancer； Application value
全球每年約有1萬例胃癌新發病例， 居癌癥最常見死因的第二位[1]。在我國胃癌是常見的惡性腫瘤之一， 發病率和病死率一直居我國惡性腫瘤之首， 早期發現和早期綜合治療是降低病死率的關鍵措施[2]。為探討血清胃蛋白酶原（PG）檢測在我國胃癌和癌前病變篩查中的應用價值， 本文采用免疫比濁分析法進行血清PG水平檢測， 通過血清PG檢測分析胃病患者血清胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ水平和胃黏膜病變的關系以及臨床應用價值。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 2012年5月～2013年12月本院門診及住院患者89例， 其中胃癌組17例， 男10例， 女7例， 平均年齡（48.6±11.8）歲；胃潰瘍組29例， 男19例， 女10例， 平均年齡（46.3±10.6）歲；萎縮性胃炎組23例， 男16例， 女7例， 平均年齡（47.8±11.2）歲；淺表性胃炎組20例， 男12例， 女8例， 平均年齡（45.9±10.4）歲；所有患者均經胃鏡及病理學診斷確診。健康對照組40例， 男26例， 女14例， 平均年齡（51.7±14.2）歲， 為本院體檢科健康體檢者， 均無肝、腎、胃等疾病及病史。各組患者一般資料比較， 差異無統計學意義（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 檢測方法 受檢者清晨空腹抽血并分離血清， 提取0.5 ml血清于-20℃冰凍保存備用。血清PGⅠ、PGⅡ含量用日立7600-020全自動生化分析儀膠乳增強免疫比濁法檢測， 試劑盒、校準品和質控品均由北京萬泰公司提供。
1. 3 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件進行統計分析。計量資料以均數± 標準差（ x-±s）比較， 采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；組間比較采用方差分析。P
2 結果
2. 1 淺表性胃炎組和胃潰瘍組血清PGⅠ水平和PGR顯著增高， 與健康對照組比， 差異有統計學意義（P
2. 2 胃癌陽性檢出率 聯合檢測PGⅠ和PGⅡ， 胃癌陽性檢出率為88.23%， 萎縮性胃炎陽性檢出率為73.91%， 胃潰瘍陽性檢出率為13.79%， 淺表性胃炎陽性率為5.00%， 而健康對照組檢出率僅為2.50%。在這五組中胃癌陽性檢出率最高， 萎縮性胃炎次之， 淺表性胃炎陽性檢出率最低。見表2。
3 討論
PG是胃蛋白酶的前體， 分為PGⅠ和PGⅡ。PGⅠ和PGⅡ由胃體黏膜的主細胞和頸黏液細胞分泌， 但PGⅡ也可由胃竇的幽門腺和十二指腸的Brunner腺分泌[3]。胃黏膜發生病變時， PG分泌細胞受累， 血清PG水平也發生相應變化。因此， 血清PG水映了不同部位胃黏膜的形態和功能[4]， PGI是檢測胃泌酸腺細胞功能的指針， 胃酸分泌增多PGI升高， 分泌減少或胃粘膜腺體萎縮PGI降低；PGII與胃底黏膜病變的相關性較大（相對于胃竇黏膜）， 其升高與胃底腺管萎縮、胃上皮化生或假幽門腺化生、異型增值有關；PGⅠ/PGⅡ比值進行性降低與胃黏膜萎縮進展相關。因此， 聯合測定PGⅠ和PGⅡ比值可起到胃底腺黏膜“血清學活檢”的作用[5]。胃癌預防亞太地區共識與指南中第15條：低血清PGⅠ水平和低PGⅠ/PGⅡ比例反映了胃萎縮， 低血清PG可作為萎縮性胃炎的一個替代標志物。第16條：低血清PGⅠ水平和低PGⅠ/PGⅡ比例可作為鑒別胃癌高危人群的標志物[6]。而在前面的檢測中萎縮性胃炎陽性檢出率僅次于胃癌的陽性檢出率， 據報道有80%以上的胃癌伴有萎縮性胃炎， 而大約10%的萎縮性胃炎可發展為胃癌[7]， 檢測PG含量可反映胃黏膜狀態及功能情況。上世紀90年代日本在臨床試驗的基礎上， 血清PG作為慢性萎縮性胃炎的標志物已被納入胃癌的篩查項目中， 結果顯示PG檢測有利于檢出早期胃癌。
近幾年來， 國內外大量資料報道[8， 9]因受檢人群、地區差異及檢測方法等的不同， 血清胃蛋白酶原檢測篩查胃癌早期臨界值存在很大區別。目前大多報道均以日本Miki 等[5]提出的PGⅠ≤70 μg/L和PGⅠ/PGⅡ≤3.0作為臨界值， 靈敏度和特異度分別為77%和73%；而萎縮性胃炎患者PGⅠ/PGⅡ比值的臨界值在HP陰性受試者中為6.0， 而在HP陽性受試者中為3.0。本文采用膠乳增強免疫透射比濁法檢測PGⅠ、PGⅡ含量及PGR， 萎縮性胃炎組PGⅠ及PGR值分別是（56.29±20.14）μg/L和（4.52±1.57）明顯低于健康對照組（81.92±26.22）μg/L和（7.82±1.59）， 而檢測發現胃癌患者和萎縮性胃炎患者中PGⅠ
綜上所述， 血清PGⅠ、PGⅡ及PGR檢測方便、快捷， 適合大范圍人群。篩查出陽性患者， 通過PG水平的檢測可反映胃黏膜變化， PGⅠ
參考文獻
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篇3
關鍵詞 嬰兒生理性腹瀉 復方胃蛋白酶散 寶樂安
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.01.163
生理性腹瀉多見于6個月以下的嬰兒，其外觀虛胖，常有濕疹，出生后不久即腹瀉，每天大便次數多，甚至十幾次，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，一般沒有特殊腥臭味。生理性腹瀉的嬰兒除大便次數增多外，多無其他癥狀，食欲好，無嘔吐，生長發育不受影響，添加輔食后，大便即逐漸轉為正常。但是長時間的生理性腹瀉容易繼發細菌性腸炎，肛周糜爛，嚴重者可發生脫水、生長發育遲緩［1］，偶爾也可發生短暫的腸絞痛，致使患兒長時間哭鬧，因此嬰兒生理性腹瀉也需要積極的治療。應用復方胃蛋白酶散聯合寶樂安治療嬰兒生理性腹瀉，取得滿意的療效，現報告如下。
資料與方法
2006年4月～2011年5月收治生理性腹瀉患兒68例，男30例(44.1%)，女38例(55.9%)。＜1個月患兒38例(55.9%)，1～4個月患兒23例(33.8%)，4～6個月患兒7例(10.3%)，期中純母乳喂養患兒54例(79.4%)，混合喂養13例(19.1%)，人工喂養1例(1.47%)。患兒表現多為生后1周左右開始出現腹瀉，每天大便次數多，甚至十幾次，大便稀黃，呈蛋花洋或者黏液稀便，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，并有酸奶味，一般沒有特殊腥臭味，患兒多伴有腹脹，排氣多，多不影響食欲及生長發育，多數病例大便常規多次均未檢出白細胞、紅細胞，個別病例白細胞＜3個/HP，脂肪球若干個，糞便細菌培養均為陰性。
治療方法：所有病例均采用復方胃蛋白酶散聯合寶樂安治療。①＜1個月：復方胃蛋白酶散0.5g/次，2次/日。寶樂安0.25g/次，2次/日。②1～4個月：復方胃蛋白酶散0.5g/次，3次/日。寶樂安0.25g/次，3次/日。③4～6個月：復方胃蛋白酶散0.6g/次，3次/日。寶樂安0.375g/次，3次/日。用溫開水送服，療程2周，用藥后由專人負責復查，并記錄用藥后3天、7天、14天腹瀉癥狀的演變恢復(腹瀉次數、大便性狀、是否腹脹以及用藥后有無不良反應)。
療效判斷標準：①顯效：治療3天糞便性狀及次數恢復正常，全身癥狀消失；②有效：治療7天糞便性狀及次數明顯好轉，全身癥狀明顯改善；③無效：治療14天糞便性狀、次數及全身癥狀均無好轉，甚至惡化。總有效率為顯效+有效。
結 果
結果顯示，治療3天后總有效率89.7%，7天總有效率92.6%，14天總有效率97.1%。治療效果，見表1。
討 論
生理性腹瀉多見于6個月以下的嬰兒，其外觀虛胖，常有濕疹，出生后不久即腹瀉，每天大便次數多，甚至十幾次，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，一般沒有特殊腥臭味。生理性腹瀉的嬰兒除大便次數增多外，多無其他癥狀，食欲好，無嘔吐，生長發育不受影響，添加輔食后，大便即逐漸轉為正常。嬰兒的消化能力有一定的限度，如果給嬰兒吃的食物超過其承受能力，就會發生腹瀉。比如，將牛奶里的水分蒸發掉一半，制成所謂蒸發奶，然后用這種奶不加稀釋地喂養嬰兒，就可能有部分嬰兒因奶內營養成分太高而發生腹瀉。母乳的成分由于民族、飲食習慣、健康狀況以及個體差異而有很大差別，有的母乳汁內含的營養成分不足，造成嬰兒營養不足，而有的母乳汁內含的營養成分超過嬰兒的需要，其多余的部分便隨腹瀉而排出體外。如果生理性腹瀉是由人工喂養造成的，那么只要注意調整喂養習慣即可；如果生理性腹瀉是由母乳原因造成的，解決的根本辦法就是換奶，當改吃牛奶或其他乳品后一般都能奏效，藥物治療是不能解決根本問題的。
復方胃蛋白酶散是助消化藥，用于小兒積食，食后腹脹：食乳即瀉［2］，大便清稀、綠便：小兒消化不良等。復方胃蛋白酶散為復方制劑，主要成分是胃蛋白酶、白術(土炒)、山藥、雞內金、山楂。其組分為每1g含胃蛋白酶活力不得少于32U。復方胃蛋白酶常用于因食蛋白性食物過多所致的消化不良；炒白術補氣健脾；炒山藥健脾補血；雞內金主治食積不化，消化不良，小兒疳積：山楂消食化積。
寶樂安其有效成分東海酪酸菌-CGMCC0313-1菌株［3］，可以分泌腸黏膜再生和修復的重要營養物質酪酸，修復受損傷的腸黏膜，消除炎癥，營養腸道。并能促進雙歧桿菌等腸道有益菌的生長，抑制痢疾志賀氏菌等腸道有害菌的生長，恢復腸道菌群平衡，減少胺、氨、吲哚等腸道毒素的產生及對腸黏膜的損害，恢復腸道免疫功能和正常的生理功能。同時，還可以分泌多種促進營養物質消化吸收的酶以及多種維生素類有益物質。
復方胃蛋白酶散與寶樂安聯合治療嬰兒生理性腹瀉，無配伍禁忌，促進消化，補充腸道有益菌，患兒用藥3天療效明顯，療程達2周效果更佳顯著，具有顯著的協同作用。
參考文獻
1 沈曉明,王衛平.兒科學.北京:人民衛生出版社,2008.
篇4
關鍵詞：胃排空功能；胃蛋白酶；缺氧誘導因子-1α；萎縮性胃炎；香砂六君子湯；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.011
中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）01-0047-05
Effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Emptying Function， Pepsin Activity and Expression of HIF-1α in Chronic Atrophic Gastritis of Rats with Deficiency Spleen and Stomach DUAN Yun-yan1，2， CHENG Ying-xia1，2， WANG Qiang1， LI Lan-zhen2， WANG Qing-sheng1， ZHENG Shi-duo2， LU Peng-cheng2， LEI Zuo-han3， LIU Xue-song1， LIU Zhen-hua1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Lanzhou 730020， China； 3. Gansu Chinese Medicine Hospital， Lanzhou 730020， China）
Abstract： Objective To study effects of Xiangsha Liujunzi Decoction （XSLJZ） on gastric emptying function， pepsin activity and expression of HIF-1α gene and protein of gastric mucosa in chronic atrophic gastritis （CAG） of rats with deficiency of spleen and stomach. Methods Rats were randomly divided into normal group and model group. The models of CAG rats with deficiency of spleen and stomach type were induced by synthetic methods. After the modeling， models rats were divided into model group， positive control group and XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups. Normal group and model group were given 10 mL/kg distilled water every day for gavage； XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups were given 24， 12， and 6 g/kg XSLJZ Decoction for gavage； positive control
group was given 0.30 g/kg Vatacoenayme for gavage， for successive 120 d. Gastric emptying function and pepsin activity were detected， and HIF-1α gene and protein expression in gastric mucosa were detected by RT-qPCR and IHC. Results Compared with the normal group， the gastric emptying function and pepsin activity in the model group were much lower （P
Key words： gastric emptying function； pepsin； HIF-1α； atrophic gastritis； Xiangsha Liujunzi Decoction； rats
慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）作為消化系統常見病，尤其在CAG伴有腸上皮化生和異常增生時，易引起繼發性胃癌，嚴重威脅生命質量。就其臨床病癥特點而言，中醫認為CAG多以脾胃虛弱、氣機或氣血失調為主要病機，故治療多以健脾益氣、理氣和胃為大法。香砂六君子湯出自《古今名醫方論》。臨床應用顯示，香砂六君子湯及其加減方治療CAG療效顯著[1-2]。本研究通過觀察香砂六君子湯對脾胃虛弱型CAG大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性及胃竇黏膜缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表達的影響，探討該復方防治CAG的作用機制。
1 實驗材料
1.1 動物
2月齡SPF級健康Wistar大鼠54只，體質量（160±10）g，甘肅中醫藥大學醫學實驗中心，動物合格證號SCXK（甘）2011-0001-0001010。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級實驗室，雌雄各半，分籠飼養，濕度45%～55%，室溫（23±2）℃，喂養滅菌標準飼料和消毒純凈水，自由飲水進食。本實驗動物處理相關程序遵守中國國家健康與醫學研究委員會動物道德準則，并得到甘肅中醫藥大學動物實驗倫理委員會的批準。
1.2 藥物
香砂六君子湯以人參、白術、茯苓、陳皮、姜半夏、炒砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制（飲片均購自蘭州復興厚中藥材有限責任公司，并經甘肅中醫藥大學藥學院中藥生藥學教研室楊扶德教授鑒定合格），第1次加10倍量蒸餾水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，濾出藥液加熱濃縮至每1 mL藥液含原藥材2 g，冷卻后置4 ℃冰箱備用，使用時稀釋至所需濃度；維酶素片，新鄉恒久遠藥業有限公司，0.2 g/片，批號20140108。
1.3 主要試劑與儀器
脫氧膽酸鈉，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，批號SLBC0243V；吲哚美辛，上海信誼黃河制藥有限公司，批號120702；氨水，白銀良友化學試劑有限公司，批號120102；乙醇，天津市富宇精細化工有限公司，批號120100107；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（批號20140813）、胃蛋白酶測定試劑盒（批號20140821），南京建成生物科技有限公司；β-actin、HIF-1α引物，寶生物工程（大連）有限公司；Trizol試劑（批號AK7208-1）、反轉錄和實時定量PCR試劑盒（批號0000036802），Promega Corporation；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L），批號ZB-2301，北京中杉金橋生物科技有限公司；Anti-HIF-1α antibody（批號B3301），美國ImmunoWay公司。DF110型電子分析天平，江蘇常熟衡器工業公司；XYJ80-2離心機，廣東塘廈駿越機電設備廠；HH-4數顯恒溫水浴箱，江蘇省金壇市友聯儀器研究所；Benchmark Plus酶聯免疫檢測儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測定儀、S1000TM逆轉錄儀、Chemi DOC XRS凝膠成像分析系統、CFX96TM Optics Module PCR儀，美國BIO-RAD公司；BX51/BX52型Olympus系統顯微鏡，日本Olympus公司。
2 實驗方法
2.1 造模與分組
除空白組8只大鼠正常飼養不予造模外，其余46只大鼠參照文獻[3]方法造模。造模組采用復合慢性損傷因素聯合作用：①60%乙醇，每3 d空腹灌胃1次（前1 d晚上撤除飼料），每次8 mL/kg；②20 mmol/L脫氧膽酸鈉灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；③每日配制0.1%氨水作為大鼠日常飲用水自由飲用，并記錄每日飲用量；④0.05%吲哚美辛灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；⑤采用饑飽失常喂養法：2 d足量喂養，1 d禁食。連續造模40周。待綜合法造模30周時，每隔1周隨機抽檢大鼠，取胃黏膜組織做病理檢查并判定胃黏膜萎縮病理變化，評價CAG模型大鼠胃黏膜萎縮病理形成后開始治療。將CAG大鼠按體質量編號，采用隨機數字表法分為模型組、陽性對照組和香砂六君子湯高、中、低劑量組，每組8只。
2.2 給藥
香砂六君子湯高、中、低劑量組每日分別給予24、12、6 g/kg香砂六君子湯藥劑灌胃（相當于60 kg成人劑量的12、6、3倍）；對照組每日給予0.30 g/kg維酶素藥劑灌胃（相當于60 kg成人劑量的6倍），等效劑量按人與動物系數折算[4]。連續給藥120 d。每日給藥體積為10 mL/kg。空白組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。
2.3 標本采集與檢測
胃排空率實驗參照文獻[5]方法，于末次給藥后禁食不禁水24 h后，分別隨機抽取各組大鼠8只，給予半固體營養糊2 mL，30 min后用烏拉坦1 g/kg麻醉采血后，迅速打開腹腔，結扎幽門和賁門后取出胃，清除胃表面的血漬，第1次稱重（胃總重），后剪開胃體，洗去胃內容物，用濾紙吸干水分第2次稱重（胃凈重），計算胃排空率[1-（胃總重-胃凈重）÷所給糊重×100%]。胃黏膜組織勻漿制備：麻醉處死后低溫條件下快速剖取胃黏膜組織，以冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，用組織重9倍生理鹽水勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存，待測胃組織蛋白酶活性。
2.4 胃黏膜組織缺氧誘導因子-1α基因表達檢測
取適量胃竇組織，用Trizol法抽提總RNA：將保存于-80 ℃冷凍冰箱中各組大鼠胃竇組織稱取50 mg組織塊置于研缽中，加入1 mL Trizol，研磨均勻，于冰上孵育 5 min 后，4 ℃、12 000×g離心5 min；移入離心管中，冰上孵育5 min后加0.2 mL氯仿，震蕩后4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液移至新離心管，加0.5 mL異丙醇，震蕩，冰上孵育10 min后，4 ℃、12 000×g離心 10 min，棄上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震蕩后4 ℃、8000×g離心10 min，棄上清液后室溫下干燥，加入 50 μL DEPC 處理水溶解RNA。核酸定量分析儀測定其OD260/OD280均在1.8～2.0之間，經總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測符合純度要求，可用于后續PCR。
香砂六君子湯出自《古今名醫方論》，主治因脾胃虛弱，氣機阻滯，痰濁、濕毒內生而生“痞滿”之效方，亦是體現“健脾理氣和胃”治則治法的經典方劑。方中人參補中益氣，健脾養胃；白術健脾燥濕；茯苓健脾滲濕；白術、茯苓合用，能增強健脾除濕功能，促進脾胃運化；木香、砂仁芳香健脾和胃，理氣消痞而止痛；陳皮、姜半夏燥濕化痰，理氣降逆；甘草調胃和中，具有補脾和胃、緩急止痛、調和諸藥作用。本方是中醫臨床治療CAG的有效方劑。
中醫認為，脾（胃）主司運化水谷，主要涉及機體消化吸收功能。從現代醫學病理生理學的角度分析，正常胃黏膜具有分泌胃酸和胃蛋白酶的功能以促進攝入物質的初步消化和排空，而CAG患者常因胃黏膜慢性炎性反應，組織充血水腫而胃動力障礙，或因壁細胞數量逐漸減少，胃黏膜腺體發生不同程度萎縮，常伴有分泌功能降低[9]，臨床則出現納呆少食、運化遲滯、噯氣胃脹等消化功能障礙的典型癥狀。胃蛋白酶是由胃黏膜主細胞所分泌并存在于胃液中的一種消化性蛋白酶，具有促進機體消化食物的功能。研究表明，CAG患者因胃腺體細胞發生不同程度的萎縮，其胃液分泌量和胃蛋白酶減少，同時因胃液pH值改變，胃蛋白酶的活性亦減弱，進而導致胃體化學消化功能降低，從而出現納呆少食、運化遲滯及胃脘脹滿之證[10]。同時從病理學角度分析，CAG病程中主要存在胃黏膜慢性炎性反應及不典型增生等變化，而且HIF-1α與慢性炎性反應的關系密切。HIF-1α是廣泛存在于機體細胞中的一種轉錄調節因子[11]，該基因由低氧誘導并介導細胞對缺氧微環境進行適性反應，缺氧時HIF-1α表達顯著上調[12]，由此啟動60余種下游因子的轉錄以使細胞逐漸適應有氧到缺氧的轉變，而且HIF-1α與炎癥反應關系密切，多種致炎細胞因子如白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、前列腺素E2及脂多糖均能激活HIF-1α的轉錄活性[13]，參與創傷修復重塑及炎癥等過程。
本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠一般生存情況較差，胃排空功能、胃蛋白酶活性顯著降低，而HIF-1α基因和蛋白表達水平顯著升高，說明大鼠CAG病程中存在胃排空功能紊亂，胃蛋白酶活性下降，而且因胃黏膜組織萎縮、炎性病變表現為缺氧條件下黏膜組織中HIF-1α基因和蛋白高表達；經藥物治療后并與模型組比較，香砂六君子湯組大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性顯著升高，HIF-1α基因和蛋白表達下調，且以香砂六君子湯高劑量作用顯著，提示香砂六君子湯通過調節胃排空功能，促進胃蛋白酶活性、下調缺氧環境中胃黏膜組織HIF-1α基因和蛋白表達的途徑以防治脾胃虛弱型CAG。
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篇5
關鍵詞：中性蛋白酶：復合蛋白酶；水解度：固定化酶；苦味值
中圖分類號：TQ936.1
文獻標識碼：A
文章編號：1672-979X(2010)09-0305-03
用蛋白酶催化水解蛋白質，可提高其溶解性和熱穩定性，防止酸沉淀，還可以改進食品的風味。蛋白質水解物可用于各類食品和方便食品調味料中。酶法水解蛋白質具有效率高、條件溫和、營養成分不破壞等優點，是目前國內外用于食品生產的主要方法。但酶法水解蛋白質會產生主要由疏水氨基酸組成的小分子多肽，有苦味，影響了產品的口感。目前國內食品企業主要使用丹麥諾維信公司的復合蛋白酶和風味酶，用國產酶制劑生產的蛋白質水解物苦味較重。用低成本工藝生產水解度高的低苦味或無苦味的蛋白質水解物，是目前急需解決的問題。固定化酶具有穩定性好，帶入雜質少等優點，僅需簡單過濾即可重復使用，可降低生產成本。本研究以酪蛋白為實驗材料，用固定化蛋白酶制備蛋白質水解物，探索水解度高、苦味少、成本低、雜質少，能達到食品工業質量要求的蛋白質水解物制備方法。
1材料
中性蛋白酶(neutral protease，NP)從本實驗室保藏的產蛋白酶菌株提取；復合蛋白酶(protamex，PM)丹麥諾維信公司產；其它試劑均為國產分析純。
2方法
2.1溶液配制
酪蛋白溶液：取酪蛋白5 g，加蒸餾水60 mL，3 mol／L氫氧化鈉1.8 mL，沸水浴加熱至溶解，調pH 7.0，定容至100 mL：茚三酮溶液：取茚三酮1.0 g，果糖0.06 g，用95％乙醇溶解并定容到100 mL：三氯乙酸溶液：取三氯乙酸1.8 g，無水乙酸鈉2.99 g，冰乙酸1.89 mL，加蒸餾水溶解并定容至100 mL。
2.2固定化載體的制備
取殼聚糖1.0 g，加蒸餾水200 mL，冰乙酸4 mL，37℃振蕩4 h至溶解。調pn 7.0，析出殼聚糖，加25％戊二醛2 mL，37℃振蕩反應4 h，所得活化殼聚糖用蒸餾水充分洗滌15次以上，吸干水分后于－20℃保存。
2.3固定化酶的制備
活化殼聚糖加蛋白酶溶液，30℃振蕩反應30 min后，離心去上清，沉淀用蒸餾水洗滌10次以上，得固定化酶。
2.4酶活性測定
取5％酪蛋白0.0 mL，加入酶液100 gL，50℃振蕩反應10 min，加入900 p_L三氯乙酸溶液終止反應，離心后取上清測A275，計算酶活性。
固定化酶活性回收率(％)=固定化酶總活性／游離酶總活性×100％。
酶活性定義：在上述反應條件下，每1 min產生的氨基酸和肽的A275增加值相當于1ug酪氨酸A所需的酶量為1個酶活性單位(u)。
2.5苦味值的評定
參考陶紅等的方法，蛋白質水解液由有經驗者品嘗，評定結果分為1～5級，順序為：無苦味，微苦，較苦，苦，很苦。
2.6蛋白質水解度(degreeofhydrolysis，DH)的測定
取蛋白質水解液100ul(以未水解蛋白質溶液為對照)，加磷酸氫二鈉.檸檬酸緩沖液(pH 5A)800ul，茚三酮100ul，混勻后沸水浴加熱15 nm，冷卻15 nlh后測A，參考趙新淮等的方法計算DH。
3結果與分析
3.1固定化酶活性回收率
取活化殼聚糖0.15g，加入NP 1 mL(2580U／mL)，反應后分別測定上清液和固定化酶的酶活性。結果表明，上清液剩余酶活性為14.2％，固定化中性蛋白酶(INP)酶活性回收率為59.9％；取活化殼聚糖0.2 g，加入PM l mL(2 360U／mL)，反應結果表明，上清液剩余酶活性為23.8％，固定化復合蛋白酶(IPM)酶活性回收率為35.0％(圖1)。上清液剩余酶活性和固定化酶活性之和低于出發酶液的總活性，可能是因固定化酶受空間結構限制，不能與底物自由接觸；IPM酶活性回收率很低，可能是因諾維信PM由多種不同的酶組成，其中某些酶不能被活化殼聚糖固定。
3.2固定化酶的穩定性
50℃下用固定化酶分解5％酪蛋白10 h。離心回收固定化酶，洗滌后再重復使用9次。結果表明，使用10次后INP和IPM的酶活性仍分別保存70.0％和79.8％，表明2種固定化酶都具有較高的穩定性。
3.3固定化酶法制備低苦味蛋白質水解物
3.3.1用INP和IPM制備低苦味蛋白質水解物分別取1NP O.15，0.30，0.45，0.60 g和IPM 0.8，1.2，1.6，2.0，4.0 g，分別加5％酪蛋白10mL，50℃反應6h，離心取上清，測DH。結果表明，蛋白質水解物的DH隨固定化酶用量增加而增加，其中用INP制備，DH快速增加，可達到26.5％(圖2)，苦味值2級：用IPM制備，DH增加緩慢，低于10％(圖3)，苦味值4級；用IPM制備，DH和苦味值的質量指標均較低，可能是因IPM中只有諾維信復合蛋白酶的一部分，固定化的酶中還有一部分未充分表現其活性，所以酶切位點大量減少。
3.3.2比較用INP和游離PM制備的低苦味蛋白質水解物取INP 0.45 g和PM 50 mg，分別加5％酪蛋白10 mL，于50℃反應1，2，4，6，8 h，離心，測上清水解度。結果表明，DH隨著反應時間的延長而增加，INP制備的蛋白質水解物的DH快速增加，游離PM制備蛋白質水解物的DH緩慢增加(圖4)，反應8h后兩者DH都達到25％，苦味值都是2級，但后者的苦味稍低于前者。表明用INP和游離PM制備所得蛋白質水解物的DH和苦味值基本相同。
4討論
篇6
【關鍵詞】 尿NAG;mALB;α1-MG;β2-MG;糖尿病腎病;診斷價值
糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最常見的慢性并發癥之一,也是糖尿病致死的重要原因,早期無明顯的癥狀和體征。糖尿病對腎小球、腎小管的損傷一直是糖尿病腎病研究的重點[1]。約30%～40%的1型糖尿病和5%～20%的2型糖尿病患者在病程高達10～15年間發生糖尿病腎病,因此糖尿病腎病的早期診斷是防止DN的關鍵[2]。本文通過檢測2型糖尿病患者尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿微量白蛋白(mALB)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、尿α1-微量球蛋白(α1-MG)的含量,以探討對DN的早期診斷價值。
1 資料與方法
1.1 一般資料 將95例受試者分為健康對照組(為門診健康體檢人群)和病例組(均為2型糖尿病患者)。健康對照組55例,男25例,女30例。年齡19～70歲,平均(43.4±14.4)9歲,均已證實無糖尿病、腎臟疾病及其他內分泌疾病。病例組40例,按世界衛生組織(WHO)診斷標準[3]確診的2型糖尿病患者,男31例,女9例,年齡39～71歲,平均(48.8±9.81)歲。
1.2 標本收集 所有入選本組實驗者均留取新鮮晨尿10 ml,以1500 r/min離心5 min后取上清液進行檢測。
1.3 儀器、試劑及檢測方法 選用的儀器為“上海棱光技術有限公司”生產的S22PC可見分光光度儀、“北京普朗有限公司”生產的9602-DNM酶標分析儀。檢測項目的試劑盒均由“上海德波生物有限公司”提供。尿NAG測定采用對硝基苯酚(PNP)比色法檢測,尿mALB、β2-MG、α1-MG測定均采用酶聯免疫法檢測。檢測結果的判斷:尿NAG>15.7 U/L、mALB>20 mg/L、β2-MG>0.30 mg/L、α1-MG>15 mg/L均為陽性結果。
1.4 統計學方法 資料處理使用Excel2003中文版將回收的資料建立數據庫,運用SPSS 16.0 統計學軟件包進行統計學處理。統計描述:計數資料用頻數、百分比;計量資料用均數±標準差(x±s)表示;統計推斷:連續性變量先進行正態性和方差齊性檢驗,不符合正態分布的變量采用Log10轉化后使其符合正態分布后再進行分析;然后進行t檢驗及Logistic多元回歸分析。采用雙側檢驗,檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 病例組四項指標陽性率明顯高于健康對照組。病例組尿NAG異常38例(95.0%);尿ALB異常32例(84.2%);尿α1-MG異常20例(50.0%);尿β2-MG異常19例(47.5%)。尿NAG陽性率最高。兩組各指標檢測結果見表1。
2.2 病例組四項檢測指標高于健康對照組,差異具有統計學意義,(P
2.3 是否有早期DN為因變量,尿NAG、mALB、β2-MG、α1-MG為自變量進行Logistic回歸分析,結果尿NAG進入方程,其敏感性最高,差異具有統計學意義(P
表1
兩組四項指標檢測結果比較的陽性率(例,%)
組別例數NAGmALb β2-MG α1-MG
健康對照組551(1.8)0(0)0(0)0(0)
住院病例組4038(95.0)32(84.2)19(47.5) 20(50.0)
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.04.93
作者單位:830001烏魯木齊市人民醫院腎病研究室
表2
健康對照組與病例組之間四項指標水平比較(x±s)
組別例數 Lg10 NAGLg10 (mALb×10)Lg10(β2-MG×10) Lg10α1-MG
健康對照組55 0.95±0.2542.85±0.394 0.82±0.323 0.73±0.283
病例組40 1.58±0.286 4.31±0.837 1.48±0.5241.28±0.339
P值
表3
Logistic多元回歸模型分析
項目 BOR95%CIP值
Lg10 NAG14.952 3.12×106 20.474-4.74×1011 0.014
Lg10 (mALb×100)1.3033.6810.384-35.2970.259
Lg10(β2-MG×100) 0.411 1.5080.104-21.8570.763
Lg10α1-MG 4.361 78.316 0.284-2.16×1040.128
2.4 ROC曲線、診斷試驗 LgNAG確診早期DN,曲線下面積為0.972,95%可信區間是0.932～1.001(P
表4
項目 曲線下面積95%CIP值
LgNAG0.972 0.932-1.011
圖1
3 討論
DN是糖尿病的嚴重并發癥,是糖尿病患者死亡的重要原因之一。能夠早期發現DN,對于臨床早期治療有一定意義。NAG為大分子糖蛋白,相對分子量為(130～140)×103,腎臟是合成和存儲NAG的主要器官,血漿中半衰期僅為5 min,且血漿中的NAG不能被腎小球濾過。當近端腎小管受損時NAG活性明顯增高,預示近端腎小管上皮細胞受損,溶酶體破裂釋放NAG,因此尿NAG是反映腎小管損害的敏感且特異的指標[4]。尿mALb正常情況下腎小球濾過膜存在電荷選擇屏障的靜電同性排斥作用,尿mALb不能通過腎小球濾過膜,而各種炎性反應、代謝異常和免疫損傷均可導致濾過膜上負電荷減少,靜電排斥力下降,造成尿mALb從尿中漏出增多,是早期腎損傷的敏感指標[5]。正常人體內的β2-MG的生成和釋放速度是非常恒定的,且能自由通過腎小球濾過膜。原尿中的99.9%的β2-MG可被近端腎小管上皮細胞重吸收和降解。當腎近曲小管輕微受損時,對β2-MG的重吸收下降,尿β2-MG含量就增加,當腎臟損傷影響到腎小管重吸收功能時尿β2-MG升高[5]。α1-MG為人體內的一種糖蛋白,較廣泛存在于人的體液中。健康狀況下,體液中的α1-MG可自由通過腎小球濾膜,在近曲小管吸收或代謝。據報道[6],腎小管重吸收的功能下降1%時,尿中β2-MG的排出量可增加30%,α1-MG也有所升高。當發生糖尿病腎病時,β2-MG、α1-MG均升高,其升高幅度與腎功能受損程度相關。尿mALB檢測是較公認的糖尿病腎病早期診斷的指標之一,但由于其對腎小管損傷診斷不敏感,不可避免地存在著漏檢漏診現象。目前逐漸認識到糖尿病不僅會累及腎小球,還會累及腎小管間質結構,且腎功能惡化的程度與腎小管間質纖維化程度密切相關,腎臟病的發生、發展、預后轉歸過程中,腎小管間質損害起著極其重要的作用[6]。糖尿病時腎小管的損傷先于腎小球的損傷[7],在糖尿病損害早期,腎小球濾過壓增高,濾過膜負電荷減少和裂孔變化使蛋白質濾出增加,使溶酶體激活,導致尿NAG升高,并隨病程的延長損傷率上升[8] 。本文資料表1、表2顯示:病例組四項指標陽性率及檢測含量明顯高于健康對照組,病例組陽性率分別為尿NAG(95.0%);尿ALB(84.2%);尿α1-MG(50.0%);尿β2-MG(47.5%),差異具有統計學意義(P
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篇7
主要從四個方面來分析：
第一，成本。根據公開資料顯示，摩拜的單車成本大約3 000元/輛，而ofo的單車成本含維護大約270元/輛。
在客單價上，摩拜的收費為1元/30分鐘。如果作為城市公共交通末梢和微循環的自行車出行場景，即500米到3千米的騎行距離，客單價在2元以內。ofo校內0.01元/分鐘，0.04元/千米，校內客單價大約在0.1元以內。在校外，ofo雙號牌的車，收費是0.04元/分鐘，0.16元/公里，客單價大約在0.5元。
結合單車成本和客單價，排除天氣等原因，假設實際出行為300天，每輛摩拜單車的使用頻率1天5次，大約1年可以收回成本。由于學生單車出行的習慣比較普遍，假設ofo每天使用頻率大約10次，那一輛ofo大約270天就能收回成本。
第二，覆蓋密度。這是ofo真正凸顯成本優勢的地方。如果尋車的距離在500米以上，尋車時間超過6分鐘，人們對騎車接駁公共交通的需求將大幅下降。為了確保500米范圍內有車，則需要對城市運營區域內500米半徑對應的每0.79平方千米的面積進行覆蓋。按廣州市環城高速內人口密度20 000人/平方千米計算，假設每100人中1人選擇騎車，在廣州環城高速210.13平方千米的范圍內，則需運營42 025輛自行車。假設通過數據分析優化調度能夠實現20%的自行車滿足80%的需求，那么廣州環城高速內合適的投放量是16 810輛。要實現這個投放量，摩拜的成本是5 043萬元，ofo的成本是453.87萬元。
篇8
關鍵詞 魚鱗；明膠；酶解產物；生物活性
中圖分類號 TS20 文獻標識碼 A 文章編號 1673-9671-(2012)062-0228-01
魚鱗是有鱗魚加工的主要副產品之一，占魚體重量的1%-5%。目前對魚鱗的開發利用主要有以下幾個方面：提取魚鱗膠，作為食品、化妝品等原材料，具有抗氧化和降低血壓、降低血液總膽固醇、抗衰老等功效；制備魚鱗水解液，除水解出大量的氨基酸外還會產生具有特定功能的肽；提取魚銀，作為一種昂貴的生物試劑，用于珍珠裝飾業和油漆制造業；低值淡水魚的魚鱗可用來開發魚鱗涼粉、魚鱗凍膏、干制魚鱗等食品，制作成各種工藝品；提取卵磷脂；提取鳥嘌呤，用于治療白血病。
1 材料與儀器
1.1 實驗材料
冷凍羅非魚魚鱗；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；胃蛋白酶；酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶。
1.2 實驗儀器
真空泵、旋轉蒸發器；紫外可見分光光度計；冷凍干燥機；氨基酸自動分析儀；精密增力電動攪拌器
2 實驗方法
2.1 魚鱗明膠提取
魚鱗50.00 g按照設定的提取時間、溫度、液料比提取，經鐵篩過濾，濾液用105℃干燥，得到明膠。
2.2 明膠酶解產物活性研究
2.2.1 明膠的酶解
不同蛋白酶對同一底物的水解效果不同，本實驗選用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別對明膠進行水解。
2.2.2 抗氧化活性的測定
1）羥自由基清除作用。試管中依此加入硫酸亞鐵1mL，水楊酸-乙醇1 mL，樣品1 mL，H2O2 1 mL，將混合液在37℃水浴鍋中反應30 min，取出后用分光光度計在510 nm波長下測定吸光值。
計算公式為：清除率I（%）=[1-（As-Ao）/Ac ]×100
2）DPPH自由基清除力。試管中加入4 mL樣品，1 mLDPPH-乙醇溶液，充分震蕩后暗室反應30min，用分光光度計在517 nm波長下測定吸光值。（不加樣品加蒸餾水為空白對照，以100 μg/ml的VC作陽性對照）
計算公式為：DPPH自由基清除率I（%）=（Ac-As）/Ac×100
2.2.3 血管緊張素I轉換酶抑制活性測定
取5ul樣品加入15 ul的ACE酶（37℃ 5 min）后，加入25 ulHHL（三肽馬尿酰-組氨酸-亮氨酸）（37℃ 25 min），再加入0.1%三氟乙酸（TFA）10 ul于16500×g的速度4℃離心20 min后，取上清液在228 nm處紫外光檢測條件下檢測馬尿酸的峰面積。（以緩沖液替代樣品作為空白對照）
計算公式為：抑制率I（%）=（Ac- As）/Ac×100%
2.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定
抑制劑活力測定：根據Tremblay等的方法測定AG的活性，即以pNPG為底物，0.5 mol/L碳酸鈉溶液為終止液。在37℃，pH6.8的條件下反應，用酶標儀在405 nm波長處比色測定。
計算公式為：抑制率I（%）=1-[（As- AB）/Ac×100%]
3 結果與討論
3.1 抗氧化活性的測定
3.1.1 羥自由基清除作用
六種蛋白酶水解液中，胰蛋白酶水解液和堿性蛋白酶水解液的羥自由基清除力較強分別為76.7%和76.0%，甚至高于VC的65.6%；其次為中性蛋白酶水解液、酸性蛋白酶水解液和胃蛋白酶水解液；而木瓜蛋白酶水解液清除率僅為6.8%。
3.1.2 DPPH自由基清除力
六種蛋白酶水解液中，堿性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除力最強為42.2%，低于陽性對照VC的47.7%，其次為胃蛋白酶水解液30.8%和酸性蛋白酶水解液25.6%，再次為胰蛋白酶水解液16.3%和木瓜蛋白酶水解液10.9。中性蛋白酶對DPPH自由基沒有清除能力。
3.2 血管緊張素I轉換酶抑制活性測定
六種蛋白酶水解液中，酸性蛋白酶水解液的ACE抑制率最高為71.7%，其次為木瓜蛋白酶水解液68.9%和堿性蛋白酶水解液68.7%，再次為胰蛋白酶水解液63.9%和中性蛋白酶水解液61.5%，ACE抑制率最低的是胃蛋白酶水解液僅為0.78%。
3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定
六種蛋白酶水解液對AG活性有截然不同的作用。酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶對AG有抑制作用，其中胃蛋白酶水解液的抑制率為67.10%，對AG的抑制作用最強。而中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶明膠水解液對AG沒有抑制作用。
4 結論
六種不同的酶（酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶）水解魚鱗明膠，對其生物活性進行比較。其中胰蛋白酶水解液和堿性蛋白酶水解液的羥自由基清除力較強分別為76.7%和76.0%，高于VC的65.6%；堿性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除力最強42.4%，但不及VC；六種蛋白酶水解液中酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶對AG活性有抑制作用，其中胃蛋白酶水解液的抑制作用最強為67.10%；六種酶水解液均有ACE抑制作用，酸性蛋白酶水解液的ACE抑制率最高71.7%。
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篇9
【摘要】 目的比較壁虎不同提取工藝成分對S180和H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫器官的影響。方法以肉瘤S180、肝癌H22荷瘤小鼠作為動物模型，以抑瘤率及胸腺、脾臟指數為指標比較壁虎原粉及水煎煮、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解等不同工藝成分的抗腫瘤作用。結果3種酶解工藝成分對肉瘤S180和H22肝癌抑瘤率均明顯高于原粉與水煎煮液，相比模型組有顯著性差異(P
【關鍵詞】 壁虎; 酶解; 抗腫瘤; S180; H22
壁虎，別名守宮、壁虎、蝎虎、天龍，味咸性寒，功能祛風，定驚，散結，解毒。壁虎作為藥材始見于《本草經集注》，而《本草綱目》就稱其能治“瘰疬初起……血積成痞，反胃膈氣，癰瘡大痛”。 其可入血分透筋達絡，既善破血散結解毒，又能通經活絡而止痛。隨著壁虎多種藥理活性，特別是抗腫瘤活性被發現后[1]， 人們對壁虎的關注度日益提高。目前壁虎臨床一般以原粉、水煎煮等方法應用，存在服用量大、易被微生物污染等缺點。現代藥理研究表明，動物類藥材發揮作用的主要為其小分子肽[2～4]，因此，我們擬采用酶解方法得到其小分子肽，并與常規原粉和水煎煮液比較其抗腫瘤作用的差異。
1 材料
1.1 動物昆明種小鼠，雄性，體質量(20±2)g，購自山東中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號為：SCXK(魯)20050015。S180腹水小鼠和H22肝癌小鼠均購自山東省醫學科學院。
1.2 儀器JJ-2型組織搗碎機，江蘇江南儀器廠;搖擺式高速中藥粉碎機，浙江大德中藥器械有限公司;W-O型恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司，TDL-5飛鴿牌離心機，上海安亭科學儀器廠;小型切向流超濾系統，美國Millipore公司(密理博)。
1.3 試劑及藥品胃蛋白酶(酶活力>1 200 U/g)，胰蛋白酶(酪蛋白轉化力≥25.0)，均購自國藥基團化學試劑有限公司，注射用環磷酰胺，200 mg/支，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：08051354，氟尿嘧啶注射液(5-Fu)，上海旭東海普藥業有限公司，批號:080302。壁虎購自濟南興旺蟾業，經本校周風琴教授鑒定系壁虎科動物無蹼壁虎Gekko swinhonis Gunther的干燥全體，置干燥箱60℃以下真空干燥，粉碎，過80目篩，細粉備用。
2 方法
2.1 供試品溶液的制備
2.1.1 原粉液的制備取壁虎細粉，用0.2%羧甲基纖維素將其稀釋成1 ml∶0.5 g的混懸液，備用。
2.1.2 水煎煮提取液的制備取壁虎細粉，加8倍量水煮沸煮沸60 min，離心，殘渣加8倍量水煮沸30 min，離心，合并上清液，濃縮至1:0.5(每毫升藥液相當于0.5 g藥材，下同)，即得水煎煮提取液。
2.1.3 胃蛋白酶酶解液的制備[5]取壁虎細粉90 g，置于組織搗碎器中，加入5倍量水，勻漿(10 000 r/min)10 min，等分為3份，取1份，煮沸15 min，放冷，調節pH 2.0，移至37 ℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入1%胃蛋白酶，2 h后取出，離心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微濾(0.22 μm)，超濾(相對分子質量3 000)，收集相對分子質量小于3 000部分，濃縮至1∶0.5，即得胃蛋白酶酶解液。
2.1.4 胰蛋白酶酶解液的制備[6]取“2.1.3”項下一份樣品液，煮沸15 min，放冷，調節pH 7.5，移至55 ℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入1%胰蛋白酶，3 h后取出，離心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微濾(0.22 μm)，超濾(相對分子質量3 000)，收集相對分子質量小于3 000部分，濃縮至1∶0.5，即得胰蛋白酶酶解液。
2.1.5 仿生酶解液的制備取“2.1.3”項下一份樣品液，煮沸15 min，放冷，調節pH 2.0，移至37 ℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入1%胃蛋白酶，2 h后取出，調節pH 7.5，移至55 ℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入1%胰蛋白酶，3 h后取出，離心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微濾(0.22 μm)，超濾(相對分子質量3 000)，收集相對分子質量小于3 000部分，濃縮至1∶0.5，即得仿生酶解液。
2.2 抗腫瘤作用的比較[7]
2.2.1 對S180荷瘤小鼠的影響無菌抽取傳代8 d的S180腹水小鼠腹腔腫瘤細胞，加入生理鹽水調整濃度至4×109個/L，于每只小鼠右腋下注射0.2 ml，接種140只。接種24 h后，將小鼠隨機分為7組，每組20只，即模型組、原粉組、水煎煮組、胃蛋白酶酶解組、胰蛋白酶酶解組、仿生酶解組與陽性對照組。模型組灌胃生理鹽水10 ml·kg-1，連續10 d;原粉組、水煎煮組、胃蛋白酶酶解組、胰蛋白酶酶解組、仿生酶解組均5 g藥材·kg-1藥液，連續10 d;陽性對照組腹腔注射環磷酰胺，劑量30 mg·kg-1，連續3 d;給藥量均為10 ml·kg-1。第11天，各組動物頸椎脫臼處死，剝離腫瘤、胸腺、脾臟，稱重，計算抑瘤率、胸腺與脾臟指數，計算公式如下：
抑瘤率(%)=(空白組瘤重均值-樣品組瘤重均值)/空白組瘤重均值×100%
胸腺(脾臟)指數=重量(mg)/體質量(g)
2.2.2 對H22荷瘤小鼠的影響建模方法、給藥方式、劑量均同S180荷瘤小鼠(對照組為5-Fu，25 mg·kg-1)。
2.3 統計學方法實驗數據采用SPSS 10.0統計軟件進行分析，所有測定數值以±s表示，采用方差分析法進行分析，P
3 結果
3.1 對S180荷瘤小鼠的影響
3.1.1 對S180荷瘤小鼠抑瘤率的影響結果見表1表1 對S180荷瘤小鼠抑瘤作用的影響
3.1.2 對S180荷瘤小鼠脾臟、胸腺指數的影響結果見表2表2 對S180荷瘤小鼠免疫器官的影響
3.2 對H22荷瘤小鼠的影響
3.2.1 對H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響結果見表3表3 對H22荷瘤小鼠抑瘤作用的影響
3.2.2 對H22荷瘤小鼠脾臟、胸腺指數的影響結果見表4表4 對H22荷瘤小鼠免疫器官的影響
4 討論
壁虎在臨床上常用于腫瘤，特別是消化道腫瘤的治療，一般焙干研細或水煎煮入藥，但壁虎起抗腫瘤作用的物質基礎還不清楚。小分子肽抗腫瘤作用逐漸引起了人們的注意。越來越多的研究表明，動、植物含有小分子肽具有很好的抗腫瘤作用，世界上許多國家正在競相研究開發小分子肽類抗腫瘤的防治藥物，如谷胱甘肽、海參五肽、槲寄生肽、胸腺五肽等[8，9]。本研究運用酶解的方式，使壁虎含有的蛋白類成分酶解成小分子肽，對其抗腫瘤作用進行研究。研究結果表明，壁虎經酶解后的抗腫瘤作用明顯高于原粉組與水煎煮組。
本實驗中的壁虎仿生酶解是指模擬人體消化過程，先用胃蛋白酶酶解，再以胰蛋白酶酶解的方法，對壁虎藥材進行酶解。
小分子肽的界限劃分迄今未有明確定義，鑒于國內外熱門研究小分子肽的相對分子質量都在3 000以下[10]，本實驗中3種酶解液均為經過超濾所得的相對分子質量小于3 000的小分子肽。
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篇10
【關鍵詞】 胃腫瘤;乙酰肝素酶;基質金屬蛋白酶9;免疫組織化學
[ABSTRACT] Objective:To investigate the clinicopathological significance of the expression of heparanase (Hpa) and MMP9， and its relationship to progressing in gastric carcinoma. Methods： The expression of Hpa and MMP9 were detected by immunohistochemistry SABC in 65 gastric carcinoma cases and 20 adjacent nonneoplastic tissues. The positive ratios of Hpa and MMP9 were compared in gastric carcinoma tissues and adjacent nonneoplastic tissues as well as perse deep infiltration tissues with or without lymph node metastasis. The correlation analysis of Hpa and MMP9 expression in gastric carcinoma tissue was assessed. Results：The positive ratios of Hpa and MMP9 were significant higher in gastric carcinoma tissue than that in adjacent nonneoplastic tissue(P
[KEY WORDS] Gastric carcinoma; Heparanase; Matrix metalloproteinase 9; Immunohistochemistry
腫瘤細胞的侵襲和轉移是一個復雜的多步驟過程。乙酰肝素酶(Hpa)是目前已確定的唯一能夠降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖基因(HSPG)的蛋白酶， 通過特異性降解HSPG發揮其促進腫瘤細胞侵襲和轉移的作用;基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)是一種鋅離子依賴性內肽酶，主要降解細胞外基質和基底膜中的膠原蛋白，在破壞細胞外基質和基底膜的屏障作用、促進腫瘤細胞侵襲和轉移的過程中同樣具有作用。Hpa mRNA的檢測在多種腫瘤中已有研究報道，但目前聯合檢測Hpa和MMP9在胃癌中的表達少有報道，本實驗對65例胃癌切除標本Hpa和MMP9的表達進行了檢測，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 研究對象
選取河源市人民醫院2003～2005年胃癌手術切除標本65例，男性47例，女性18例，年齡35～78歲，中位年齡60歲，其中有淋巴結轉移者40例。所有病例術后均經病理證實。另取癌旁非瘤組織20例作為對照，癌旁組織距離腫瘤邊緣不小于5 cm。
1.2 Hpa、MMP9的檢測
采用免疫組化SABC法進行檢測。Hpa抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購于武漢博士得生物工程有限公司;兔抗人MMP9多克隆抗體為北京中山生物技術有限公司產品，均在4℃冰箱保存。用已知的陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。
1.3 結果判定標準
1.3.1 Hpa Hpa以細胞膜和/或細胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性判斷標準，以染色強度和陽性細胞比例評定陽性表達。參照Friedmann等[1]的方法，每張切片隨機觀察5個視野，每個視野觀察100個腫瘤細胞，計數500個腫瘤細胞中陽性染色的細胞數，陽性細胞記數僅限于腫瘤細胞染色。染色強度分級如下：無著色為0，淡黃色為1，黃色及更深顏色為2;陽性細胞數分級為:陽性細胞數小于50%為0， 50%～75%為1，>75%為2。染色強度分級與陽性細胞數分級兩項得分相乘結果≥2為陽性表達。
1.3.2 MMP9 MMP9以細胞漿和/或細胞膜內出現棕黃色顆粒為陽性判斷標準，參照Liaball等[2]的方法，每張切片隨機觀察5個視野，每個視野觀察100個腫瘤細胞，計數500個腫瘤細胞中陽性染色的細胞數，陽性細胞計數僅限于腫瘤細胞染色，10%及以上細胞陽性染色的切片為陽性，10%以下陽性染色的切片為陰性。
1.4 統計學處理
應用SPSS10.0統計軟件，行χ2檢驗或精確概率法及Spearman相關性檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Hpa的表達
Hpa蛋白陽性表達主要位于細胞漿和/或細胞膜，腫瘤間質中的血管內皮細胞、巨噬細胞和淋巴細胞也偶有陽性表達，胃癌中Hpa的陽性表達率為60%(39/65);在癌旁非瘤組織中，血管內皮細胞、巨噬細胞和淋巴細胞偶有陽性表達， Hpa的陽性表達率為15%(3/20)，胃癌中的表達明顯高于癌旁非瘤組織，差異具有統計學意義(χ2=12.390，P
2.2 MMP9的表達
MMP9在正常胃黏膜細胞中著色均勻，主要分布于細胞胞漿內，陽性表達率為15%(3/20);在胃癌組織中的表達異質明顯，呈灶狀或彌散性分布，陽性表達率為55.4%(36/65)，胃癌中的表達明顯高于癌旁非瘤組織，差異具有統計學意義(χ2=10.046，P
2.3 不同腫瘤浸潤深度及淋巴結有無轉移胃癌患者Hpa、MMP9的表達
腫瘤浸潤深度達到或超過漿膜層的胃癌患者Hpa、MMP9的陽性表達率明顯高于未達漿膜層者，差異有統計學意義(P
2.4 Hpa、MMP9在胃癌中陽性表達的相關性
經相關性檢驗，Hpa、MMP9在胃癌組織中的表達呈正相關(rs=0.531，P=0.000)，見表2。表2 Hpa、MMP9在胃癌中表達的相關性
3 討論
腫瘤細胞對細胞外基質(extracellar matrix，ECM)成分及其基底膜的降解是腫瘤浸潤、轉移的關鍵。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是人體內降解ECM的主要酶類，參與腫瘤演進等眾多生理和病理過程[3，4]，MMP9作為MMPs家庭重要成員，具有廣泛的酶底物特性，是降解基底膜成分IV型膠原的主要酶[5]。Sier等[6]的研究結果顯示胃癌組織MMP9表達顯著高于臨近的正常胃粘膜，MMP9高表達的胃癌患者生存期明顯縮短;David等[7]研究表明，與正常胃粘膜相比，胃癌組織MMPs表達明顯升高，MMPs表達與胃癌分期密切相關。本實驗結果顯示，淋巴結轉移患者MMP9陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移者，說明MMP9在胃癌細胞突破基底膜向周圍淋巴結轉移過程中起著重要的作用; MMP9的表達還與胃癌的浸潤深度密切相關(P
Hpa是目前發現的唯一能夠降解細胞外基質和基底膜中主要成分HSPG的蛋白水解酶，其在腫瘤細胞的侵襲和轉移中具有重要的意義。 Vlodavsky等[9]研究發現高轉移潛力的腫瘤細胞Hpa活性比低或無轉移潛力的腫瘤細胞高4～10倍。在卵巢腺癌、轉移性黑色素瘤細胞、口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌以及前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌中Hpa mRNA和蛋白呈優勢表達。Hulett等[10]也發現高轉移的鼠腺癌細胞系表達高水平Hpa mRNA，而低轉移細胞系僅有少量表達。Takaoka等[11]用RTPCR檢測胃癌組織中Hpa的表達發現，正常胃粘膜組織中無Hpa的表達，胃癌組織中Hpa的表達與腫瘤體積和局部淋巴結轉移有明顯正相關性，高表達Hpa的患者預后差。本研究結果顯示，Hpa的陽性表達與胃癌的浸潤深度及有無淋巴結轉移密切相關，表明在胃癌的進展過程中，Hpa具有重要的作用。本研究還發現，Hpa和MMP9在胃癌細胞上的表達呈正相關，推測Hpa和MMP9在胃癌浸潤轉移過程中存在相互關聯、相互作用，聯合檢測Hpa和MMP9在判斷腫瘤生物學行為及預后方面具有重要意義。
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