【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌ImmuneresponsesandprotectiveefficacyinducedinmicebyMycobacteriumtuberculosisMPT64ESAT6fusionprotein【Abstract】AIM:ToevaluatehumoralandcellmediatedimmuneresponsesbyMPT64andESAT6fusionproteinsandtotestprotectiveefficacyagainstMycobacteriumtuberculosis(MTB)challenge.METHODS:BALB/cmicewereimmunized3timesat2weekintervalsubcutaneouslyonthebackwithfusionproteinMPT64ESAT6.Inthespleenlymphocytesofimmunizedmicestimulationindex(SI)wasmeasuredbyMTTmethodandthelevelofsecretedIFNγwasdetectedbyELISA.SomeofvaccinatedBALB/cmicebyfusionproteinswereintravenouslyinfectedwith1×105CFUMTBstrainH37Rv.Fourweekslater，bacterialloadinspleenswasdetermined.RESULTS:ThetiterofseraspecificantibodyinBALB/cmiceimmunizedwithfusionexpressionproteinMPT64ESAT6was1∶1500.TheSIoflymphocytesinfusionproteinimmunizedgroupwas2.23,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup(0.88).TheIFNγlevelinculturesupernatantofspleenlymphocytesfromthemiceimmunizedwithfusionproteinswere(4.28±0.27)μg/L,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup［(0.48±0.17)μg/L,P<0.05］,butlowerthanthatofBacillusCalmetteGuerin(BCG)immunizedgroup［(5.18±0.31)μg/L］.Comparedwithsalineimmunizedmice（bacterialloadwas6.45±0.17）,dramaticreductionswereobservedforMTBreplicationinthespleenfromBALB/cmiceimmunizedwithfusionproteins(bacterialoadwas5.04±0.11)followingasubsequentchallenge,buttheprotectiveefficacyinmiceimmunizedwithMPT64ESAT6wasnotasgoodasthatofBCGimmunizedgroup(bacterialloadwas4.38±0.22).CONCLUSION:MPT64andESAT6fusionproteinscouldbeusedasanovelcomponentofthenewTBvaccine.【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis；vaccine；MPT64；ESAT6；fusionexpression【摘要】目的：測定MPT64與ESAT6融合蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及保護(hù)力.方法：將MPT64與ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次，每次間隔2wk，ELISA測定免疫小鼠血清特異性抗體的滴度.最后一次免疫完成后4wk，分離部分免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞，MTT法檢測淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，ELISA檢測懸液中IFNγ水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈感染MTB毒株H37Rv，4wk后計數(shù)脾臟細(xì)菌負(fù)荷數(shù).結(jié)果：MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特異性抗體滴度1∶1500，免疫小鼠后淋巴細(xì)胞刺激增殖指數(shù)為2.23，而生理鹽水免疫組只有0.88；脾淋巴細(xì)胞懸液中誘發(fā)的IFNγ為（4.28±0.27）μg/L，顯著高于生理鹽水免疫組［（0.48±0.17）μg/L，P<0.05］，但不及BCG免疫組［（5.18±0.31）μg/L］.與生理鹽水免疫組（細(xì)菌負(fù)荷6.45±0.17）相比較，融合蛋白免疫的小鼠，對攻擊感染后抗MTB在脾臟中增殖有顯著作用，細(xì)菌負(fù)荷為5.04±0.11，但與BCG免疫組相比脾臟細(xì)菌負(fù)荷減少甚微（細(xì)菌負(fù)荷4.38±0.22）.結(jié)論：MPT64與ESAT6融合蛋白可作為新型結(jié)核疫苗的候選組分.【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌；疫苗；MPT64；ESAT6；融合表達(dá)0引言ESAT6（Mr6000的早期分泌蛋白）和MPT64是結(jié)核分支桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）中重要的保護(hù)性抗原,編碼這兩種蛋白的基因只存在于MTB毒株中而卡介苗（BacillusCalmetteGuerin,BCG）中缺失［1］，研究發(fā)現(xiàn)重組的MPT64和ESAT6蛋白免疫小鼠后均可有效抵抗MTB感染.本研究在成功獲得MPT64與ESAT6融合蛋白的基礎(chǔ)上［2］，研究該融合蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平和對MTB毒株H37Rv攻擊的保護(hù)力.1材料和方法1.1材料MTB毒株H37Rv由陜西省結(jié)核病防治研究所王瑞副主任技師惠贈；卡介苗疫苗株由蘭州生物制品研究所出品（國藥準(zhǔn)字SF20010035，批號20011201）；鼠IFNγ和ELISA檢測試劑盒購自晶美公司；潮霉素（GIBCOBRL公司）.BCG培養(yǎng)增強(qiáng)劑（albumindextrosecatalaseADC）和RPMI1640培養(yǎng)基均購自GIBCO公司.7H9液體培養(yǎng)基購自美國Difco公司；改良羅氏培養(yǎng)基由本室自制，MTB的培養(yǎng)濾液蛋白(culturefiltrateproteins,CFP)由本室制備.羊抗鼠IgGHRP購自華美生物公司.6~8周齡BALB/c小鼠，雌性，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心感染實驗室.1.2方法1.2.1MTB毒株H37Rv的培養(yǎng)和定量取羅氏培養(yǎng)基中保存的MTB毒株H37Rv接種到7H9培養(yǎng)基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），37℃振搖培養(yǎng)3wk，5000r/min離心10min，收集細(xì)菌，保存于-20℃?zhèn)溆?用7H9液體培養(yǎng)基系列稀釋濃縮液，接種于羅氏培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2wk，計數(shù)濃縮液細(xì)菌的CFU.1.2.2BCG的培養(yǎng)和定量取BCG疫苗株接種到7H9液體培養(yǎng)基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），相同方法培養(yǎng)、收集BCG，并計數(shù)細(xì)菌的菌落形成單位（colonyformingunits,CFU）.1.2.3融合蛋白的大量制備取MPT64pProEXHTESAT6陽性克隆［2］，活化后分別接種到1000mLLB培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，IPTG誘導(dǎo)，集菌，先進(jìn)行SDSPAGE，采用Invitrogen的NiNTA純化試劑盒純化目的蛋白，分光光度法測定蛋白濃度.1.2.4免疫動物實驗隨機(jī)分為3組，每組10只小鼠，一組用MPT64ESAT6融合蛋白免疫BALB/c小鼠；免疫劑量均為1mg/只，共免疫3次，第一次和第二次免疫加有不完全福氏佐劑，第三次單純免疫融合蛋白，每次間隔2wk，免疫結(jié)束后，收集小鼠血清，用CFP作為抗原，ELISA測定免疫小鼠血清特異性抗體滴度,其余兩組分別為BCG和生理鹽水對照組.最后一次免疫結(jié)束后4wk，進(jìn)行以下實驗：每組取5只小鼠，用于測定淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(stimulationindex,SI)和IFNγ水平；其余5只用于毒株攻擊實驗.1.2.5脾臟淋巴細(xì)胞的分離與制備將免疫的小鼠斷頸處死，無菌取脾臟，置于平皿內(nèi)200目的鋼網(wǎng)上，用注射器針芯研磨，并加入RPMI1640培養(yǎng)液沖洗.將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入2倍體積的淋巴細(xì)胞分離液，1000r/min離心20min.吸取中間單核細(xì)胞層，用RPIM1640液洗滌兩次后計數(shù).1.2.6特異性淋巴細(xì)胞增殖實驗將分離的淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整至5×108/L，在96孔板中用100mL/LFCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，200μL/孔，同時實驗組每孔加入25μLMTBCFP（25mg/L溶于PBS，本室制備），對照組不加CFP，調(diào)零孔不加脾細(xì)胞，37℃50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)68h后，每孔加20μLMTT（5g/L，溶于PBS，pH7.2，過濾除菌），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，加DMSO150μL/孔，振蕩10min，測定A490nm值.結(jié)果用刺激指數(shù)SI=實驗組A值/對照組A值表示.1.2.7IFNγ的誘生及含量的測定5×109/L脾細(xì)胞在24孔板用含10mL/LFCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，800μL/孔，同時加入MTBCFP100μL/孔，37℃50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)72h，收集培養(yǎng)液，5000r/min離心5min，取上清，-20℃凍存?zhèn)錂z.參照試劑盒說明（夾心ELISA法）測定各標(biāo)本所含IFNγ濃度.1.2.8MTB毒株H37Rv的攻擊實驗最后一次免疫完成后4wk，用MTB毒株H37Rv經(jīng)尾靜脈感染小鼠，劑量為105CFU/只，4[1][2]wk后，斷頸處死小鼠，脾臟勻漿，計數(shù)細(xì)菌CFU.統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1小鼠體內(nèi)特異性抗體滴度MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠三次后血清特異性抗體滴度平均值為1∶1500.2.2抗原特異性脾臟淋巴細(xì)胞增殖實驗分離免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞，在體外用CFP抗原刺激，測定了淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，與生理鹽水對照組（SI為0.88）相比較融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖明顯，SI為2.23，BCG免疫組SI為3.58，高于融合蛋白免疫組.2.3脾臟淋巴細(xì)胞中誘生的IFNγ水平MPT64ESAT6免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，體外用CFP刺激，其懸液IFNγ含量分別為（4.28±0.27）μg/L，與生理鹽水對照組（0.48±0.17)μg/L相比較有明顯增加（P<0.05），但不及BCG免疫組［（5.18±0.31）μg/L,P<0.05］（圖1）.2.4免疫小鼠對MTB毒株攻擊時的抵抗作用免疫完成后4wk，H37Rv經(jīng)尾靜脈感染BALB/c小鼠，4wk后計數(shù)脾臟細(xì)菌負(fù)荷數(shù)，與生理鹽水免疫組（細(xì)菌負(fù)荷數(shù)6.45±0.17）相比較，融合蛋白MPT64ESAT6免疫的BALB/c小鼠，對攻擊感染后抗MTB在脾臟中增殖有顯著作用（細(xì)菌負(fù)荷數(shù)分別為5.04±0.11），但與BCG免疫組（細(xì)菌負(fù)荷數(shù)為4.38±0.22）相比較脾臟細(xì)菌負(fù)荷減少甚微.aP<0.05vs生理鹽水.n=5.圖1融合蛋白在小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中誘生的IFNγ水平（略）3討論卡介苗（BCG）是目前唯一的預(yù)防結(jié)核病疫苗，但其對成年人結(jié)核病的預(yù)防效果不穩(wěn)定，保護(hù)力常發(fā)生變化（0~80%）［3］，因此，研制全面有效的新疫苗是控制結(jié)核病的重要途徑.融合亞單位疫苗具有成分明確，使用安全，可減少純化步驟等優(yōu)點而受到國內(nèi)外的重視.目前已知的保護(hù)性抗原有MTB早期分泌蛋白Ag85B復(fù)合物、ESAT6和MPT64［4］等，選擇這幾種抗原制備的亞單位疫苗可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答，并不受先前接觸分枝桿菌的影響.單個蛋白構(gòu)成的亞單位疫苗產(chǎn)生的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答是針對每一組分抗原的，機(jī)體獲得的免疫保護(hù)力有限，因此新型TB疫苗著重于融合多個免疫表位［5］.本研究中將純化的MPT64與ESAT6融合蛋白，免疫小鼠，特異性抗體滴度可達(dá)到1∶1500，顯著高于已報道文獻(xiàn)［6］中抗體的滴度，融合蛋白免疫三次后，小鼠特異性淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高，說明淋巴細(xì)胞被有效活化.IFNγ常被認(rèn)為是抵抗MTB感染的一個關(guān)鍵性細(xì)胞因子，也是Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，TB的保護(hù)性效應(yīng)與分泌IFNγ的淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生密切相關(guān).融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠誘生的IFNγ水平顯著高于生理鹽水對照組（P<0.05），提示這兩種融合基因可能是TB疫苗中理想的候選基因.MTB毒株攻擊實驗中，與生理鹽水組相比較，MPT64ESAT6免疫組使得細(xì)菌數(shù)由6.45±0.17降為5.04±0.11，有效控制了MTB的感染，但與BCG免疫組相比免疫保護(hù)力還是有一定差距.研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)液中分離純化的分泌型蛋白免疫動物，只會產(chǎn)生很弱的免疫應(yīng)答，亞單位疫苗必須配以適宜的佐劑多次接種才能達(dá)到效果［7］，在本研究中，采用不完全福氏佐劑具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，可刺激產(chǎn)生IL2，IFNγ和IL12，是本室較常用的一種免疫策略.MPT64ESAT6融合蛋白誘導(dǎo)的保護(hù)力有限，分析原因可能是因為保護(hù)性抗原種類不多，難以誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛而全面的細(xì)胞免疫應(yīng)答；同時蛋白質(zhì)在體內(nèi)的滯留時間短并且其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的持續(xù)時間也較短，需選擇合適的劑量［8］，多次免疫才能達(dá)到有效的保護(hù)水平.【參考文獻(xiàn)】［1］KamathAT,FengCG,MacdonaldM,etal.DifferentialprotectiveefficacyofDNAvaccinesexpressingsecretedproteinsofMycobacteriumtuberculosis［J］.InfectImmun,1999,67(4):1702-1707.［2］師長宏,王曉武,生,等.結(jié)核分枝桿菌差異蛋白MPT64與ESAT6的融合表達(dá)與純化［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,26(20):1840-1842.［3］范雄林,徐志凱,李元,等.結(jié)核分枝桿菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2001,22(14):1283-1287.［4］DohertyTM,AndersenP.Tuberculosisvaccinedevelopment［J］.CurrOpinPulmMed,2002,8(3):183-187.［5］師長宏,范雄林,徐志凱,等.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85BESAT6的融合表達(dá)及純化［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,(2):89-92.［6］薛瑩,李元,史皆然,等.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B的免疫學(xué)特性［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2002,23(13):1203-1205.［7］LangermansJA,DohertyTM,VervenneRA,etal.ProtectionofmacaquesagainstMycobacteriumtuberculosisinfectionbyasubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85BandESAT6［J］.Vaccine,2005,23(21):2740-2750.［8］DietrichJ,AagaardC,LeahR,etal.ExchangingESAT6withTB10.4inanAg85Bfusionmoleculebasedtuberculosissubunitvaccine:EfficientprotectionandESAT6basedsensitivemonitoringofvaccineefficacy［J］.JImmunol,2005,174(10):6332-6339

結(jié)核病防治知識

肺結(jié)核病也叫肺癆，是青年公務(wù)員之家，全國公務(wù)員共同的天地人容易發(fā)生的一種慢性傳染病。一年四季都可以發(fā)病，15歲到35歲的青少年是結(jié)核病的高發(fā)峰年齡。因此青年人更應(yīng)該注意預(yù)防。

結(jié)核病是結(jié)核桿菌引起的一種呼公務(wù)員之家，全國公務(wù)員共同的天地吸道傳染病。多數(shù)患者是通過呼吸道感染的。結(jié)核桿菌在陰暗潮濕的環(huán)境中可以存活幾個月。當(dāng)患有活動期肺結(jié)核的病人吐痰后，結(jié)核菌就可隨干了的痰跡飛散到四周。隨時都可以感染健康人。人體除毛發(fā)外幾乎全身所有組織都可以感染結(jié)核病，入腸結(jié)核、骨結(jié)核、淋巴結(jié)核等。由于結(jié)核病主要經(jīng)呼吸道進(jìn)行傳播，因此肺結(jié)核的感染率比其他器官高，占人體結(jié)核病的首位。患結(jié)核病后，病人可有低燒、盜汗、疲乏無力、干咳或痰中帶血絲、顏面潮紅、身體瘦弱等癥。如不及時徹底的治療，會使病情轉(zhuǎn)為慢性，甚至造成病人死亡。

摘要:豬巴氏桿菌病由多殺性巴氏桿菌感染而引起，主要發(fā)生于仔豬和育肥豬，呈世界流行，可通過呼吸道、消化道和血液途徑傳播。感染豬根據(jù)疾病發(fā)生的緩急分為慢性型和急性型兩種類型，主要表現(xiàn)呼吸道癥狀和全身癥狀。從巴氏桿菌病的臨床表現(xiàn)、病理剖檢和實驗室檢查方面提供了該病的診斷特征，同時從疫苗的程序性免疫、加強(qiáng)豬舍內(nèi)環(huán)境消毒、減少養(yǎng)殖過程中應(yīng)激因素對豬群的影響、提升豬場生物安全管理水平和對病豬進(jìn)行科學(xué)治療的角度闡述了該病的防控方法，以期為廣大養(yǎng)豬朋友帶來幫助。

關(guān)鍵詞:豬;巴氏桿菌;肺疫;診斷;防控

豬巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌感染而引發(fā)的一種以全身敗血癥為特征的急熱性傳染病，由于病豬大部分表現(xiàn)呼吸道癥狀，故又稱“肺疫”，嚴(yán)重的能導(dǎo)致咽喉部位腫脹，壓迫氣管使氣流進(jìn)出受阻，民間稱其為“鎖喉瘋”，主要影響仔豬和育肥豬，每年都會給養(yǎng)豬業(yè)帶來較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。

1巴氏桿菌

巴氏桿菌是一種革蘭氏染色呈陰性的短桿菌，大小為(0．2～0．4)μm×(0．4～1．8)μm，病料中直接抹片分離的病原大部分為單個存在，極少數(shù)成雙排列，且呈現(xiàn)出兩端濃染的特征。該菌表面無鞭毛，惡劣環(huán)境中不形成芽孢，不會自主運動，新分離的毒株表面有莢膜，經(jīng)傳代培養(yǎng)后莢膜消失。本菌可在體外進(jìn)行培養(yǎng)，最佳培養(yǎng)溫度為32℃～38℃，需氧或兼性厭氧，最適pH為7．0～7．5，培養(yǎng)時對培養(yǎng)基的營養(yǎng)有一定要求，普通肉湯中生長較差，加入血清或血液后生長速度加快。在綿羊血瓊脂平板表面培養(yǎng)24～48h能見到表面光滑、濕潤、邊緣整齊、形似露珠的菌落，不發(fā)生溶血，有熒光，接種至麥康凱瓊脂表面則無法生長。

2豬巴氏桿菌病簡介

1蘇云金芽孢桿菌（Bt）的發(fā)現(xiàn)及殺蟲機(jī)理

1.1蘇云金芽孢桿菌（Bt）的發(fā)現(xiàn)

1901年日本學(xué)者石度繁從患猝倒病的家蠶幼蟲中分離到第1個產(chǎn)生晶體的芽孢桿菌。10年后Berliner從德國蘇云金地方一家面粉廠染病的地中海粉螟中分離到一個相似的菌株，并正式定名為蘇云金芽孢桿菌（Bt）。4年后，一個叫克林諾的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在這種細(xì)菌的細(xì)胞中可以形成方形或菱形的晶體，可惜這個發(fā)現(xiàn)并未被重視。直到40年后的1953年，一位叫漢納的生物學(xué)家證明了這種晶體是有毒的蛋白質(zhì)晶體，才揭示了粉螟死亡的原因。在1920～1930年間，Bt作為微生物殺蟲劑主要用來防治玉米螟。1938年第1個商品制劑Sporeine在法國問世，從此拉開了生物殺蟲劑的序幕。以后相繼發(fā)現(xiàn)了對鞘翅目、螨類、同翅目、膜翅目、直翅目昆蟲、動植物寄生線蟲、鞭毛蟲、變形蟲、吸蟲、絳蟲有毒殺作用的Bt菌株。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Bt是革蘭氏陽性菌，另外，它可寄生在一些蛾類和蝶類的幼蟲上，甚至是植物表面。

蘇云金芽孢桿菌分泌出的由Cry基因編碼的、有殺蟲活性的δ-毒素（或被稱為殺蟲晶體蛋白）的蛋白結(jié)晶構(gòu)成了內(nèi)孢子。Cry蛋白對鱗翅目（如蛾與蝶）、雙翅目（如蒼蠅、蚊子）和鞘翅目（甲蟲）有很大殺傷力。因此，可將蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)制成高效生物殺蟲劑，或用Cry基因制成防蟲害的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。

1.2蘇云金芽孢桿菌（Bt）的殺蟲機(jī)理

摘要幽門螺桿菌（Hp）作為胃炎、胃十二指潰瘍、胃癌、胃淋巴瘤等疾病的重要致病因素已被廣泛確認(rèn)。作為非侵入性細(xì)菌，它引起炎癥及免疫應(yīng)答以及進(jìn)一步的病理損害是重要的致病機(jī)理，而Hp菌苗也存在免疫保護(hù)和免疫損傷兩方面的作用。本文就Hp菌苗與宿主免疫等相關(guān)問題作一簡要綜述，目的在于為完善Hp菌苗的研究提供理論基礎(chǔ)。

幽門螺桿菌（Hp）作為慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌、胃淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的重要致病因素已為大量研究證實，其致病機(jī)理包括Hp的尿素酶、蛋白酶、脂酶、磷脂酶A、趨化因子及細(xì)胞空泡毒素（VacA）等直接致病，也包括Hp引起宿主的炎癥及免疫應(yīng)答致病[1]。本文主要就Hp菌苗與宿主的免疫應(yīng)答及相關(guān)問題的研究進(jìn)展作一簡要綜述。

hp與菌苗研究

Hp感染是世界范圍的，而且是終身感染。新近研究顯示，口服菌苗可誘導(dǎo)針對Hp感染的保護(hù)性免疫，并且菌苗可治愈已存在的HP感染性病變，從而表明用菌苗治療Hp感染是可行的[2]。用霍亂毒素（CT）B亞單位或大腸桿菌不耐熱毒素（LT）作粘膜佐劑的Hp抗原誘導(dǎo)免疫已獲成功，即Hp對宿主自然免疫應(yīng)答的抵抗能被瓦解。成功用作Hp菌苗的抗原有Hp細(xì)胞裂解產(chǎn)物、尿素酶、VacA、熱休克蛋白和過氧化物酶等。免疫學(xué)研究及動物模型也證實口服免疫不僅可以預(yù)防而且能治愈Hp感染，并且鼻內(nèi)及結(jié)腸免疫均可引起胃粘膜的免疫保護(hù)[3]。新近Ghiara等用重組VacA或細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白（CagA）作抗原，減毒的大腸桿菌LT突變體作為佐劑，成功地根除了小鼠模型中的慢性Hp感染，并證明該治療性菌苗對Hp再感染有同樣有效的免疫防御作用[4]。總之Hp作為非侵入性細(xì)菌，定居于胃粘膜表面，可引起機(jī)體的免疫及炎癥反應(yīng)。面對機(jī)體強(qiáng)大的免疫應(yīng)答，Hp仍能繼續(xù)生存并致病，其機(jī)理尚不清楚。免疫效應(yīng)分子必須進(jìn)入胃粘膜表面，才能中和和殺傷Hp。目前認(rèn)為該作用與胃分泌液中出現(xiàn)抗Hp特異性分泌型IgA抗體相關(guān)。這種抗體也在感染的動物及人體中出現(xiàn)，所以細(xì)胞免疫效應(yīng)在防御或治療Hp感染中的作用仍需進(jìn)一步研究。另外，了解Hp逃逸免疫效應(yīng)分子的機(jī)理以及Hp菌苗誘導(dǎo)宿主的免疫保護(hù)及免疫損傷的機(jī)理，將為更有效的菌苗篩選提供可能。最近報道對Hp感染的易感性與小鼠中主要組織相容性復(fù)合體（MHC）位點直接相關(guān)，這是否適用于菌苗設(shè)計也需進(jìn)一步研究證實[5]。

hp與宿主免疫

Hp誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的途徑，目前認(rèn)為包括Hp可溶性產(chǎn)物的被動吸收，上皮細(xì)胞直接內(nèi)吞細(xì)菌抗原，抗原通過被破壞的胃上皮進(jìn)入組織激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答[6]。粘膜對不同Hp免疫應(yīng)答的差異是決定病變后果的重要因素。其中包括B細(xì)胞及相應(yīng)的IgG、IgM的體液免疫應(yīng)答，以及在Hp感染相關(guān)慢性活動性胃炎病變局部出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞浸潤的細(xì)胞免疫應(yīng)答[1]。

［摘要］目的探討兒童幽門螺桿菌感染及胃癌的關(guān)系。方法內(nèi)鏡下胃黏膜活檢取材，應(yīng)用常規(guī)固定，石蠟切片HE，HP染色鏡檢，1例加染PAS及AE1/AE3，CK8，KP-1，LCA，SMA免疫標(biāo)記，結(jié)合臨床進(jìn)行病理學(xué)觀察。統(tǒng)計學(xué)方法：采用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)PEMS軟件包進(jìn)行χ2檢驗。結(jié)果216例胃黏膜活檢病理診斷：輕度慢性淺表性胃炎89例，中度慢性淺表性胃炎92例（1例胃腺癌），重度慢性淺表性胃炎35例，后兩組均各有4例為活動性胃炎。190例石蠟切片加印片HP染色：中、重度慢性淺表性胃炎HP陽性檢出率明顯高于輕度胃炎者（P=0.0281），差異有顯著性；而臨床診斷與活檢病理診斷比較，差異無顯著性（P=0.25）；通過特染及酶標(biāo)確診胃腺癌合并HP重度感染1例（有便血史2個月患兒）。結(jié)論（1）兒童重、中度慢性淺表性胃炎HP陽性檢出率明顯高于輕度慢性淺表性胃炎，三者比較差異有顯著性（P=0.0281）。而且1例中度慢性淺表性胃炎有胃腺癌患兒為HP重度感染，提示HP感染與胃炎程度及胃腺癌確有關(guān)系，但三者確切關(guān)系有待進(jìn)一步探討。（2）活檢標(biāo)本石蠟切片HP染色加新鮮胃黏膜印片HP染色將提高HP陽性檢出率，本組提高7%。（3）對有便血患兒應(yīng)警惕胃癌可能，必要時及早胃鏡檢查加活檢以便及時治療HP感染及早期預(yù)防、早期診斷、早期治療胃癌。

［關(guān)鍵詞］兒童；幽門螺桿菌；胃癌

近年來兒童纖維胃鏡開展普及，我院216例胃黏膜活檢標(biāo)本中檢出胃腺癌1例，且伴重度幽門螺桿菌（HP）感染。成人HP感染與胃癌關(guān)系為近年來研究熱點之一，但對兒童胃癌與HP感染關(guān)系國內(nèi)鮮有報道，故本文就我院胃黏膜活檢分析，以初探兒童HP感染與胃癌關(guān)系，現(xiàn)將資料報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料216例胃黏膜標(biāo)本均系我院消化科纖維胃鏡下活檢送檢標(biāo)本，男121例，女95例，年齡最小1歲，最大16歲，平均9.6歲，年齡分布情況，見表1。以8～12歲組共164例為最多（占76%）。表1216例胃鏡活檢年齡分布（略）

1.2臨床表現(xiàn)216例中臨床表現(xiàn)為：輕度慢性胃炎174例，上消化道出血17例，十二指腸球炎11例，消化性潰瘍12例，便血2例。

【關(guān)鍵詞】流感嗜血桿菌;耐藥性;耐藥機(jī)制

目前世界范圍的細(xì)菌耐藥性是近幾年醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點問題。流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae,Hi）是小兒呼吸道感染的常見致病菌，對臨床常用抗生素的耐藥性呈上升趨勢，引起了醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注。繼β內(nèi)酰胺酶陰性耐氨芐西林Hi（BLNAR）發(fā)現(xiàn)之后，世界各地又陸續(xù)報道了多重耐藥菌株的出現(xiàn)。本文就流感嗜血桿菌的耐藥現(xiàn)狀及其對常用抗生素的耐藥機(jī)制作一綜述。

1流感嗜血桿菌的一般情況

Hi分型研究的常用方法有生物型、血清型和莢膜型等多種，其中莢膜型/血清型對Hi致病性研究和菌苗研制意義重大。根據(jù)該菌細(xì)胞壁外莢膜多糖的有無，可將Hi分為有莢膜的可分型和無莢膜的不可分型兩類，前者再可根據(jù)其莢膜多糖抗原的不同，分為a、b、c、d、e、f六個血清型。

研究表明不同年代、不同地區(qū)Hi血清型存在較大地區(qū)差異。用直接原位聚合酶鏈反應(yīng)（ISPCR）雜交法，20世紀(jì)50～60年代Hib的檢出率是14.3%，80年代至2002年Hib的檢出率是20.5%［1］。陳民鈞等［2］用Hib型抗原乳膠凝集試驗對北京、上海和廣州地區(qū)的菌株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)三個地區(qū)Hib分別占1.8%、32.3%和6.5%。之后報道北京2000年Hib檢出率是13.7%［3］，上海2003年是19%［4］。華春珍等［5］對247株Hi血清分型研究中不可分型菌株占61.9%，可分型菌株占38.1%，其中可分型菌株中以d型為主，構(gòu)成比達(dá)90.4%，b型僅1.1%。

在國外，孟加拉國化膿性腦膜炎由Hi引起的占35%，這其中有97.1%為Hib感染［6］。意大利學(xué)者報道了1997～1998年分離的Hi菌株中b型占91.2%，f型占0.9%，不可分型占7.9%［7］，1998～1999年分離的Hi菌株均為Hib，2000～2001年在對7例病人標(biāo)本進(jìn)行追蹤檢測，其中有5株為e型［8］。波蘭學(xué)者從感染的下呼吸道分泌物中分離的Hi菌株中b型占40.3%，e型占38.9%，f型占16.7%，d型占4.1%［9］。

經(jīng)大量臨床病例證實，消化系統(tǒng)的胃黏膜病變、潰瘍、胃淋巴增生性病變、慢性胃炎甚至胃癌均與幽門螺桿菌(HP)感染有一定的關(guān)系。我國目前處于HP感染高發(fā)區(qū)，通常HP感染缺乏典型的臨床特征，故早期的臨床診斷及治療顯得尤為重要。病理診斷HP感染是臨床診斷的重要依據(jù)，但在常規(guī)病理HE切片中不易觀察到HP，難以明確病理診斷，因此只能用特殊染色法才能使HP更清晰的顯示出來。目前檢測HP的方法有10余種，哪些方法最好、如何進(jìn)行HP染色的質(zhì)量控制、使染色結(jié)果穩(wěn)定可靠且準(zhǔn)確是目前工作中的關(guān)鍵。本文就這些染色法中的關(guān)鍵問題、注意事項以及HP實驗操作問題、染色液配制及染色結(jié)果觀察判斷等問題進(jìn)行探討。

1材料與方法

1.1材料。選取本院2018-05—08間臨床診斷的活動性胃炎胃黏膜活檢標(biāo)本65例。1.2方法。將65例石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，制成4μm厚的切片，每例取3張，分別進(jìn)行硼酸亞甲藍(lán)染色、改良Giemsa染色和硝酸銀染色。1.2.1試劑配制①硼酸亞甲藍(lán)染液配制:把1g亞甲藍(lán)和1g硼酸加入100ml蒸餾水中充分混合溶解。②改良Giemsa染液配制:Giemsa染液:Giemsa染液0.75g加甲醇50ml于50度水浴箱中使其充分溶解，其間不斷攪拌，冷卻后加入50ml甘油;石炭酸復(fù)紅液:堿性品紅50mg溶于95%乙醇100ml，再加入4%苯酚250ml及蒸餾水650m，充分混合即可。③硝酸銀液配制:醋酸貯備液:雙蒸餾水加1%檸檬酸液，調(diào)節(jié)PH值為3.6～4.0之間;5%明膠液:明膠5g加醋酸貯備液100ml溶解;③顯影液:3%對苯二酚1ml與5%明膠15ml充分混合，顯影前5min加入2%硝酸銀3ml混合。1.2.2染色步驟①硼酸亞甲藍(lán)染色:切片脫蠟至水，硼酸亞甲藍(lán)染液染色5min，水洗，烘干切片，中性樹膠封固。②改良Giemsa染色:組織切片脫臘至水，改良Giemsa染液染色20min后水洗，石炭酸復(fù)紅液染1min，不洗直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。③硝酸銀染色:切片脫蠟至水，醋酸貯備液洗切片，把切片置入1%硝酸銀于56℃水浴箱45min，切片取出不經(jīng)水洗，滴入顯影液56℃水浴反應(yīng)2min，切片立即取出，自來水稍洗，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。1.3結(jié)果判定。切片高倍鏡下，陽性的幽門螺桿菌形態(tài)彎曲，短桿狀，分布在胃黏膜凹陷內(nèi)。硼酸亞甲藍(lán)染色法幽螺桿菌呈藍(lán)色;改良Giemsa染色法幽門螺桿菌呈紅色;硝酸銀染色法幽門螺桿菌呈棕黑色。

2結(jié)果

65例胃黏膜標(biāo)本中，經(jīng)硼酸亞甲藍(lán)檢出55例HP陽性，陽性率85%(圖1);經(jīng)Giemsa染色49例陽性，陽性率75%(圖2);經(jīng)硝酸銀染色檢出52例陽性，陽性率80%(圖3)。三項染色陽性的數(shù)據(jù)比較差別顯著(P＜0.05)。

3討論

摘要：對l例布氏桿茵病患者經(jīng)密切觀察、及時確診并予以抗感染、營養(yǎng)支持及對癥治療，實施心理護(hù)理、疼痛護(hù)理、發(fā)熱護(hù)理及健康教育等護(hù)理措施．結(jié)果患者癥狀迅速緩解而轉(zhuǎn)往專科醫(yī)院進(jìn)一步治療。提出密切觀察病情、早期診斷、精心護(hù)理是布氏桿茵病確診和治療的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞：布氏桿菌病；馬爾他熱；波浪熱；乳制品；家畜；護(hù)理

布氏桿菌病(Brucellosis)又稱馬爾他熱(MoltaFever)或波浪熱(UndulantFever)，是由布氏桿菌引起的一種人畜共患的地區(qū)性流行病。本病的主要傳染源是羊，其次是牛和豬。病菌可以從破損的皮膚進(jìn)入體內(nèi)，也可隨乳制品進(jìn)入體內(nèi)。我科2006年收治1例布氏桿菌病患者，經(jīng)密切觀察、及時確診并給予對癥治療和護(hù)理后好轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)入專科醫(yī)院繼續(xù)治療。

一、病例簡介

男，21歲，學(xué)生。患者于入院前3個月無明顯誘因出現(xiàn)低熱，體溫波動在37．5℃左右，伴流涕、打噴嚏，有輕咳、咳少量白色泡沫樣痰，自服阿莫西林、APC、維C銀翹片等藥物后體溫可降至正常，咳嗽、咳痰、流涕癥狀好轉(zhuǎn)。3～4d后體溫復(fù)升并波動在37～39℃，伴畏寒、寒戰(zhàn)、乏力、腹脹；l周前出現(xiàn)雙側(cè)踝、膝關(guān)節(jié)疼痛，伴右足第1跖趾關(guān)節(jié)持續(xù)性腫痛；3d前出現(xiàn)右上腹壓痛。于我院就診，行腹部B超檢查示“脾稍大，肝大，左腎結(jié)石或鈣化灶，盆腔少量積液”，于2006年5月10日以“發(fā)熱原因待查”收入院。個人史：出生并久居于山西省，家中養(yǎng)羊，否認(rèn)疫區(qū)居留史及疫水接觸史，否認(rèn)長期放射線、毒物接觸史。人院后查體：體溫36．8℃，脈搏84次／min，呼吸20次／min，血壓100／70mmHg，皮膚溫度及濕度增高。左側(cè)頸后可及淋巴結(jié)1枚，直徑約o．5cm，雙側(cè)腹股溝可及淋巴結(jié)數(shù)枚，最大直徑1cm，質(zhì)韌，活動度可，無壓痛。球結(jié)膜輕度充血，右側(cè)顏面部稍腫脹。右側(cè)頜下腺略飽滿，表面不平，質(zhì)軟。脾肋下約3cm，質(zhì)軟，叩診肝下界于肋弓下5cm，肝區(qū)叩痛陽性，脾區(qū)叩痛陽性。脊柱T。。棘突可及壓痛及叩擊痛。雙手細(xì)顫。患者入院后仍間斷發(fā)熱，體溫最低36．8℃，最高40℃，呈波狀熱。人院后行骨穿檢查提示骨髓增生活躍，中性粒細(xì)胞可見中毒顆粒，不除外感染。5月12日患者出現(xiàn)左側(cè)睪丸部位疼痛，逐漸加重并轉(zhuǎn)為雙側(cè)，查體：右附睪頭、體、尾均腫大，約4cm×2cm×2m，左附睪輕度腫大，壓痛(+)，左側(cè)精索靜脈曲張，陰囊B超提示：雙側(cè)附睪略增大并血流豐富，雙側(cè)精索靜脈輕度曲張。反復(fù)查布氏桿菌凝集試驗3次均為陽性，滴度為1：20，血培養(yǎng)結(jié)果支持，因而確診為布氏桿菌感染。給予抗感染(利復(fù)星O．2g靜脈滴注，每日2次)、營養(yǎng)支持及對癥治療后體溫呈下降趨勢，5月23日轉(zhuǎn)入傳染病醫(yī)院繼續(xù)治療。

二、護(hù)理

摘要:目的傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌鑒定方法周期時間長、敏感性較差，往往延誤患者的診斷和治療，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，為了可以快速診斷結(jié)核分枝桿菌，本研究利用重組酶聚合酶擴(kuò)增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技術(shù)建立快速的結(jié)核分枝桿菌檢測方法，為結(jié)核病患者的診斷和治療贏得寶貴時間。方法應(yīng)用RPA技術(shù)對疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中的特異性核苷酸片段進(jìn)行檢測，利用衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)檢驗RPA技術(shù)與傳統(tǒng)診斷方法有無差異。結(jié)果80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中檢測出70例陽性，有10例排除結(jié)核病。80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中，RPA技術(shù)檢測陽性率為87.50%，痰涂片檢測陽性率為56.25%，痰培養(yǎng)檢測陽性率為75.00%，RPA技術(shù)檢測陽性率較高，與痰涂片、痰培養(yǎng)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.00，P＜0.01;χ2=10.00，P＜0.01)。結(jié)論RPA技術(shù)的成功建立對結(jié)核病的快速診斷有著重要意義。

關(guān)鍵詞:重組酶聚合酶擴(kuò)增;結(jié)核分枝桿菌;特異性;診斷;檢測

結(jié)核病(tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacte-riumtuberculosis，MTB)引起的一種古老的慢性傳染病，以肺部感染最為常見［1］。2019年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球報告結(jié)核病患者710萬例，與估算的1000萬例有所差異，可能與大部分患者未被診斷出來有關(guān)［2］，可見結(jié)核病的診斷存在一定的難度。肺結(jié)核是結(jié)核病中具有傳染性的一類，臨床上對這類患者的診斷主要通過痰涂片法和痰培養(yǎng)法，按照世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，臨床上的診斷率只有不到70%。由于部分患者未得到及時診斷，使其成為持續(xù)的傳染源，發(fā)病數(shù)持續(xù)增加。基于此，需改進(jìn)現(xiàn)有的診斷方法，以提高結(jié)核病的診斷率。重組酶聚合酶擴(kuò)增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技術(shù)被稱為是可以替代PCR技術(shù)的核酸檢測技術(shù)［3－7］。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物防御、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［8－11］。本研究利用RPA技術(shù)建立結(jié)核分枝桿菌的快速檢測方法，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1材料結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國疾病預(yù)防控制中心提供，該研究涉及的菌株標(biāo)本和痰標(biāo)本均來源于邯鄲市第六醫(yī)院;引物與探針(表1)交由上海生工有限公司合成;DNA提取采用江蘇碩世公司的磁珠提取試劑盒，RPAMasterMix購自濰坊安普未來生物科技有限公司，培養(yǎng)基選用珠海貝索的酸性羅氏培養(yǎng)基和中性羅氏培養(yǎng)基。1.2儀器西安天隆Real－timePCR儀，江蘇碩世全自動核酸提取儀，熱電培養(yǎng)箱。1.3方法1.3.1痰涂片鏡檢抗酸染色［12］，用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2～3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3～5min，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。3%鹽酸酒精脫色30s～1min，用水沖洗。用堿性美蘭溶液復(fù)染1min，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。1.3.2分離培養(yǎng)取目標(biāo)痰液經(jīng)4%氫氧化鈉溶液消化處理15min后，酸性羅氏培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)7周，分離得到菌株。1.3.3DNA制備取1ml菌懸液或痰液于1.5ml離心管中，7500rpm離心10min，棄上清，加入180μl溶有溶菌酶的緩沖液BL，充分混勻，低速離心，于37℃水浴溫育30min(溫浴期間每隔10min顛倒混勻一次)。加入10μl蛋白酶K至樣品中，充分混勻，低速離心，56℃水浴溫育10min。將消化液全部加入到試劑板AT中的第1、7列中。將加入樣本的試劑板AT放置在核酸提取儀中，試劑板AT的缺口朝外。插入八聯(lián)磁棒套，關(guān)上試驗倉，按下設(shè)置核酸提取程序，并選擇運行。1.3.4RPA反應(yīng)體系每份反應(yīng)液中含有A反應(yīng)液29.4μl，上、下游引物(10μmol/μl)各2μl，探針(10μmol/μl)2μl，滅菌水11.5μl，結(jié)核分枝桿菌DNA樣品2μl，反應(yīng)液總體系50μl。1.3.5PCR反應(yīng)條件39℃30s(×1)，39℃10s→39℃20s(×40)。1.3.6結(jié)果分析采用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用χ2檢驗對不同檢測方法的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果