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【關鍵詞】微透析；,,回收率；,,應用

摘要：該文介紹了微透析取樣技術的原理，組成以及微透析探針的類型，對常用測定微透析探針回收率方法的優點缺點進行了比較，綜述了近年來國內外有關微透析技術的應用進展，顯示該項技術在研究領域具有廣闊的應用前景。

關鍵詞：微透析；回收率；應用

微透析(microdialysis)技術是將灌流取樣和透析技術結合起來并逐漸完善的一種新型生物采樣技術,可在麻醉或清醒的生物體上使用,特別適合于深部組織和重要器官的活體生化研究。目前已成為實驗神經生理學和神經化學的重要研究工具之一,它可提供遞質釋放、攝取和代謝的必要信息。隨著微透析采樣和檢測靈敏度的不斷提高,微透析技術迅速發展起來,成為生物化學研究中一個引人注目的新領域。從20世紀90年代起這項技術在生命科學研究中進入高潮。微透析取樣裝置主要由微量泵、微透析探頭、收集器、連接管及配套設備［1］組成。微量泵以注射泵為佳,有利于減少恒流泵和蠕動泵的波動,流速一般為1~5μl/min。微透析探頭有直線性探頭、環形探頭、同心型探頭等不同的類型(微透析管因實驗對象不同而形狀大小各異)；按照探頭的形狀分為穿顱探頭、U型探頭、I型探頭、環形探頭等（圖1）。目前普遍應用的是同心型探頭，微透析探頭通常是由一管式半透膜與不銹鋼、石英或塑料毛細管構成雙層管道；長度一般為1～10cm。半透膜由再生纖維素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成（圖2）,載留分子量5～10KD不等。實際應用需根據具體組織和待測物選擇不同的微透析探頭。

圖1探頭類型（略）

圖2微透析探針（略）

微透析主要原理是以透析原理作為基礎,通過對插入生物體內中的微透析探頭在非平衡條件下進行灌流,物質沿濃度梯度逆向擴散，使被分析物質穿過膜擴散進入透析管內,并被透析管內連續流動的灌流液不斷帶出,從而達到活體組織取樣的目的。微透析技術最大的優點是可在基本上不干擾體內正常生命過程的情況下進行在體(invivo)、實時(realtime)和在線(online)取樣,特別適用于研究生命過程的動態變化。微透析技術的優點是活體取樣、動態觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等。該技術的另一大優點是樣品的采集與分析過程既可在位又可離位進行。此外微透析技術的獨到之處是可以單獨取得細胞外液,因此可對體內神經遞質的釋放量進行動態監測,具有重要的生物學意義。在國外已成功地用于測定細胞外液中的多種神經遞質［2］、氨基酸［3］、葡萄糖［4］、腺苷及其代謝產物［5］等小分子化合物。然而微透析技術一直困擾人們的問題就是如何對取出的樣品進行準確可靠的校正，這就涉及到對探針的回收率的測定。探針回收率是指從灌流液中流出的待測組分與標準濃度之比的百分數。探針回收率是影響微透析結果的重要因素,取決于取樣部位的生物學性質、透析膜的物理性質(材料、孔徑、長度及幾何形狀等)、待測物質的分子量、灌流速度、壓力、生物體本身的健康條件和生物節律等。目前測定回收率的方法主要有以下幾種：

1外標法

只需要計算被測物質相對濃度的變化時,可簡單地采用體外回收率法。測定宜在取樣后立即進行,將探針放入已知濃度的標準溶液中,用與體內實驗相同的流速灌流探針。達到穩定狀態后收集灌流液并進行檢測。測定濃度與標準溶液濃度之比就是體外回收率。此法雖簡單易行,但由于被測物質在體外時與體內的環境狀況不同,檢測結果不能嚴格地等同于實際的回收率。

2內標法

［6］是往灌流液中加入已知濃度且性質與被分析物質相似的另一種物質做內標,內標物不僅在擴散性質上與被分析物一致,而且還要在體內的代謝過程中也盡可能一致,測出透析率即作為被分析物的回收率。由于選擇內標的局限性很大,限制了此法的應用。

3反透析法

［7］假設被測物從兩個方向通過半透膜是同等的。在灌流液中加入一定濃度的內標物(Cic),在與體內透析相同的條件下操作,測定透析液中內標物的濃度(Cec),體內回收率(Rin,vivo)可用下式計算：Rinvivo=(1Cec/Cic)×100%本法要求內標物具有生物惰性,盡可能與被測物相似。

4低流速法

［8］低流速法是將灌流速度盡量降低,一般控制在50nl/min以下,使回收率盡量達到100%,此時便無需進行回收率校正了。此法取樣體積很少(一般在5μl以下),不但對儀器的檢測靈敏度要求極高,而且取樣時間長易造成樣品的揮發或氧化。此外還有外推至零流速法(extrapolationtozeroflow)［9］和零凈通量法(zero-netflux)［10］。微透析只是一項取樣技術，要進行體內物質測定必須要與分析儀器聯用，以便于有利于對微量樣品進行實時和在線分析測定，減少操作誤差。微透析時選取適當微透析膜的截留分子量,免除了復雜的樣品前處理及由此而產生的樣品損失和誤差,也不會因在室溫取樣而酶解,提高了樣品的穩定性,使微透析液中可不含蛋白質和酶等生物大分子,同時由于微透析取出的樣品體積小，約為μl級，易于揮發，因此取出后不易久放，能直接進入分析儀器進行測定。常用的有高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳(CE)、質譜（MS）及激光誘導的熒光檢測器等,可從容地進行分離和測定。利用微透析技術進行動物實驗主要是在被限制動物或麻醉動物身上，也可用于自由活動的清醒動物，應用最多的腦功能的研究，近年來該技術的應用已取得很多的科研成果。腦：在顱內手術，Hutchinson等［11］利用微透析方法與其他監測手段研究動脈瘤手術的情況,得出:患者穩定期腦氧壓2.0~6.0kPa(15~45mmHg)之間；葡萄糖含量在0.5~3mmol/L之間,乳酸/丙酮酸比值＞30，在32~65之間則暗示有厭氧代謝,3min＜的短暫夾閉不會引起腦氧量減少或乳酸/葡萄糖比值的升高；長時間夾閉則會有副作用。萬登峰［12］等應用微透析技術動態收集大鼠輕、重度腦損傷局部的細胞外液(ECF)透析液,觀察其葡萄糖含量(［Glu］d)和乳酸含量(［Lac］d)變化。透析管插入引起［Glu］d和［Lac］d的變化很小(P＜0.05)；腦損傷后［Glu］d下降，與對照組及損傷前相比相差顯著(P＜0.05)，且損傷越重其變化越顯著(P＜0.05)；而腦損傷后［Lac］d則上升，與對照組及損傷前相比相差顯著(P＜0.05)，且損傷越重其變化亦越顯著(P＜0.05)；腦損傷后［Glu］d和［Lac］d的變化分別與腦組織含水量呈顯著負相關(P＜0.05)和顯著正相關(P＜0.05)。皮膚：Sjogren等［13］選用聚乙烯砜膜(100kD)探針測定皮膚在探針插入這一微創條件下白介素-6的產生,為測定復雜的細胞因子系統提供了技術參考。金屬離子與一些皮膚病的發病有關,但活體皮膚離子濃度測定一直較難實施,Leveque等［14］以該技術聯用原子吸收光度計測定真皮鐵離子濃度,證實微透析可用于皮膚離子測定。此外還可進行血液、脂肪、肌肉中藥物濃度的變化。由于物質跨膜擴散是雙向性的，微透析技術除了可用于監測體內環境的生化改變外,還可作為一種給藥途徑。可將藥物緩慢、直接地作用于靶器官，提高藥效分析和藥物代謝動力學研究的水平，特別是局部直接給藥更能顯示出這種方法的優越性。陽曉等［15］研究發現，在實驗性大鼠的腹透液中加入川芎嗪長期進行腹膜透析(PD)，腹膜間皮細胞結構基本完好,間皮下無明顯的基質沉積，且大鼠PD的超濾量顯著提高，小分子物質的清除率增加,而對透出液中蛋白質濃度則無明顯影響。微透析技術已用于測定直接人腦實質的藥物濃度［16］，并可幫助諸如愛滋病毒（HIV）感染病人選擇合適的穿透血腦屏障的藥物。但微透析技術仍存在一些不足，微透析技術的不足之處在于探針的植入會造成局部輕微的損傷。特別是對急性實驗可能有一定程度的影響。回收率的測定雖然種類繁多,但每種方法都不夠完善,影響了實際濃度的計算。由于采用的方法不同在檢測濃度極低的生理活性物質時不同作者的報告有時可能相差近一個數量級。微透析技術要求探頭必須準確插在同一取樣部位,因此不適合對很小的腦內神經核團采樣。由于透析膜體積小,灌流液的流速低(一般1～5μl/min),很難進行以秒為單位的動態觀察。

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