導語：Genistein對人卵巢癌細胞系3AO抑制增殖的作用及機制的探討一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關鍵詞】料木黃酮；卵巢腫瘤；細胞系；細胞凋亡

Inhibitoryeffectsofgenisteinonproliferationinhumanovariancarcinomacellline3AOandrelatedmechanism

【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofgenisteinonproliferationinhibitionandapoptosisinductioninhumanovariancarcinomacellline3AOandtoexploreitsanticancermechanism.METHODS:Afterculturedwithdifferentdosesofgenisteinfordifferenttimeperiods,thecellsweretestedbyMTTassay.Studyontheultrastructureof3AOcellswasperformedbytransmissionelectronmicroscope(TEM)aftertheadministrationofgenistein.ApoptosiswasdetectedbymeansofterminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPbiotinnickendlabeling(TUNEL)method.Apoptosisrateandcellcycledistributionof3AOcellsweremeasuredbyflowcytometry(FCM).Theexpressionofestrogenreceptorβproteinwasmeasuredbyimmunocytochemicaltechnique.RESULTS:After3AOcellsweretreatedwithdifferentconcentrationsofgenistein,doseandtimedependentgrowthinhibitionwasdemonstrated.Inhibitionpercentageincellsexposedto10mg/Land20mg/Lgenisteinfor72hwere,respectively,54.24%and65.99%.Also,genisteincouldblock3AOcellsintheG2/Mphaseofcellcycle,andatypicalsubdiploidapoptosispeakwasdemonstratedbeforeG1/G2phase.Moreovertheapoptosiswastimedependent.Thecharacteristicmorphologicalchangesofapoptosisingenisteintreated3AOcellswereobservedbyTEM.TUNELstainingrevealedapoptosispositivecells.GenisteincouldupregulatetheexpressionofERβ.CONCLUSION:Genisteincandoseandtimedependentlyinhibitgrowthandinduceapoptosisinovariancarcinomacellline3AOthepotentialpathwayofERβ.

【Keywords】genistein;ovarianneoplasms;cellline;apoptosis

【摘要】目的：研究植物雌激素染料木黃酮對人卵巢癌細胞系3ao細胞增殖的抑制作用和凋亡的誘導作用，探討其抗癌作用的機制.方法：應用MTT法檢測不同濃度染料木黃酮對3AO細胞的生長抑制作用，電鏡觀察藥物作用后細胞的超微結構改變，TUNEL法確定凋亡，流式細胞儀檢測細胞周期、定量分析凋亡，免疫細胞化學技術檢測雌激素β受體的表達.結果：3AO細胞經不同濃度染料木黃酮處理后，細胞生長明顯受到抑制，且這種抑制作用隨時間延長及濃度增高而增強，10mg/L和20mg/L染料木黃酮作用72h后，抑制率分別達到54.24%和65.99%.染料木黃酮阻斷3AO細胞生長于G2/M期，在G0/G1前出現典型亞二倍體凋亡峰，且凋亡呈時間依賴性.電鏡觀察到用藥后凋亡細胞典型的形態學特征.TUNEL法觀察到大量陽性凋亡細胞.免疫細胞化學法檢測到用藥后，ERβ表達明顯加強.結論：染料木黃酮對3AO細胞的生長有明顯的呈時間及濃度依賴性的抑制作用，并誘導其發生凋亡.染料木黃酮可能通過雌激素β受體途徑發揮藥理作用，誘導卵巢癌細胞發生凋亡.

【關鍵詞】染料木黃酮；卵巢腫瘤；細胞系；細胞凋亡

染料木黃酮是異黃酮類化合物，化學名為4′，5，7三羥基異黃酮，它廣泛存在于包括大豆在內的多種蔬菜和水果中［1］.實驗研究顯示，染料木黃酮在乳腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤等多種腫瘤的發生、發展中有多重抑瘤效應［2］，已成為國際抗癌藥物的研究熱點.其主要防癌機制為調節雌激素受體、抑制細胞代謝關鍵酶活性、增加抗氧化酶的活性及抑制血管生成作用等［3-7］.因而，染料木黃酮對腫瘤的化學預防及治療作用受到人們的廣泛關注.卵巢癌是激素相關性腫瘤，是一種常見且惡性程度較高的婦科腫瘤.本實驗采用人卵巢粘液性囊腺癌細胞系3AO，研究染料木黃酮對該細胞系增殖和凋亡的影響，為其應用于卵巢癌的臨床治療提供實驗依據.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞培養人卵巢粘液性囊腺癌細胞系3AO由第四軍醫大學西京醫院婦產科實驗室常規保存，用含100mL/L新生牛血清(杭州四季青)的DMEM(美國Gibco)培養基培養細胞，于37℃，含50mL/LCO2培養箱中培養傳代，選用對數生長期細胞實驗.

1.1.2實驗試劑染料木黃酮購于美國Sigma公司，純度為98%，用分析天平稱取染料木黃酮，用DMSO配成儲備液，置于-20℃冷凍保存.細胞給藥前，用DMEM培養液稀釋至所需濃度，并調整DMSO在各組培養液中的終濃度均為5.1mmo/L.TUNEL試劑盒購于德國Roche公司;兔抗雌激素性β受體（estrogenreceptorβ,ERβ）購于美國Chemicon公司;二抗,SP試劑盒及DAB試劑盒購自北京中山金橋生物技術有限公司.

1.1.3爬片制備對數生長期細胞接種于24孔板中進行爬片，培養24h后細胞全部貼壁，實驗分空白對照組和實驗組(染料木黃酮終濃度為10mg/L)，加入不同處理因素共孵育，于48h收集爬片，PBS洗滌2次，950mL/L乙醇固定爬片10min，晾干備用.

1.2方法

1.2.1形態學觀察倒置顯微鏡下動態觀察培養瓶中卵巢癌細胞在用藥前后的變化.

1.2.2四唑鹽(MTT)比色試驗測定生長抑制率對數生長期3AO細胞以每孔1×103個細胞的密度接種于96孔培養板.細胞貼壁培養24h后，加入染料木黃酮（終濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10，20mg/L）共孵育進行MTT實驗.對照組只加培養液，DMSO溶劑對照組只加5.1mmol/LDMSO.每組設6個復孔.與實驗組平行設只加培養液不加細胞的空白對照孔，比色時以此孔調零.酶連免疫檢測儀測定不同藥物濃度及不同時間下（24，48，72h）的吸光度值A490nm.以每組6個孔A490nm的平均值作為各組的平均A490nm值.記錄結果，計算染料木黃酮對3AO細胞的抑制率：細胞生長抑制率(%)=（1-藥物組A490nm/對照組A490nm）×100%.IC50表示半數抑制濃度.

1.2.3透射電鏡下觀察細胞凋亡對數生長期細胞加入10mg/L染料木黃酮共孵育，48h消化收集細胞，PBS洗2次，離心后加入4℃預冷的40g/L戊二醛固定，10g/L鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，環氧樹脂包埋，制成超薄切片，透射電鏡下觀察.

1.2.4TUNEL法檢測確定凋亡隨機選取對照組和實驗組爬片，嚴格按照說明書流程操作，水化、封閉、滲透，滴加TUNEL反應混合液，37℃暗濕環境中孵育60min，漂洗，加ConventerPOD液37℃濕盒孵育30min，DAB顯色，光鏡下觀察.細胞調亡有一項重要的特征為細胞內的DNA會碎裂成片斷，TNUEL可以有效地去探測DN段的產生.因此其表達定位于胞核，陽性反應為核被染棕褐色.隨機取10個高倍鏡視野進行陽性細胞計數，計算平均值.

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期，定量分析凋亡對數生長期細胞貼壁后，與濃度為5，10mg/L的染料木黃酮共孵育，空白對照組不加藥，分別于12，24，48h離心收集細胞，PBS洗滌并制成單細胞懸液.①PI單染色法檢測細胞周期變化；②AnnexinVFITC/PI雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡率.

1.2.6免疫細胞化學法檢測ERβ爬片依步驟處理后加入一抗，4℃過夜，次日滴加二抗，SP法染色，DAB顯色，蘇木精復染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察.

統計學處理：采用統計軟件SPSS12.0進行分析，試驗數據均以x±s表示.組間A490nm比較用析因設計的方差分析，組間兩兩比較用SNK法.TUNEL法陽性細胞計數，采用兩樣本均數t檢驗，P<0.01差別有顯著意義.

2結果

2.1染料木黃酮對3AO細胞形態的影響倒置顯微鏡下可見，3AO細胞呈單層生長，細胞呈橢圓形或多角形，胞核圓形或橢圓形，胞質透亮.經染料木黃酮處理后，細胞形狀變窄，胞質透亮度下降，顆粒感增強，部分細胞胞突回縮變圓，脫落呈懸浮狀，并見細胞碎片.且這些變化隨染料木黃酮劑量的增加和作用時間的延長而加重.至72h，細胞回縮成不規則圓形，可見大量細胞碎片.電鏡下可見細胞超微結構發生典型的凋亡形態學改變.

2.2染料木黃酮對3AO細胞生長的抑制作用MTT試驗表明染料木黃酮對3AO細胞的抑制作用隨濃度的升高和用藥時間延長而增強，經計算IC50為10mg/L，藥物濃度與作用時間之間有交互作用（P<0.01，表1）.

2.3TUNEL法檢測確定凋亡光鏡下，10mg/L染料木黃酮作用48h后，出現大量陽性凋亡細胞，核深染，成斑點狀或斑塊狀；而對照組細胞核幾乎無著色（圖1）.加藥組陽性細胞數量平均為14.32±2.56，而對照組中陽性細胞數量僅為1.28±1.55，二者差異顯著（t=13.78，P＜0.01）.表1MTT法檢測染料木黃酮對3AO細胞增值的影響對照和各濃度各時間點組間比較；cP<0.01vs對照和各時間點組間比較.

2.4染料木黃酮對3AO細胞周期和凋亡率的影響流式細胞儀結果顯示，和對照組相比，染料木黃酮處理的3AO細胞出現細胞周期中G2/M期細胞顯著增多，S期細胞顯著減少，表現出G2/M期阻滯；此外，10mg/L染料木黃酮給藥48h在G0/G1前出現典型亞二倍體凋亡峰.與對照組相比，5mg/L與10mg/L染料木黃酮作用12，24，48h后抑制率兩兩之間均差異顯著（P<0.01），藥物處理不同時間各組間抑制率亦均有顯著差異（P<0.01）.表明染料木黃酮誘導3AO細胞凋亡隨濃度增高和時間延長而增強，其中10mg/L染料木黃酮作用48h后抑制率達38.1%.卵巢癌中，ERβ蛋白表達定位于胞核，陽性反應為核深染成深棕色.光鏡下可見染料木黃酮作用后，ERβ表達明顯增強（圖2）.

3討論

本實驗采用了多種檢測細胞增殖活性及凋亡的方法，檢測了染料木黃酮對3AO細胞凋亡作用的量效和時效關系，較肯定地證明了一定濃度的染料木黃A:對照酮可誘導3AO細胞凋亡，抑制其增殖.MTT試驗中，隨著染料木黃酮濃度的升高，3AO細胞的生長均受到不同程度的抑制.當劑量達10mg/L和20mg/L時，抑制作用明顯，表明染料木黃酮對3AO細胞的抑制作用隨濃度的升高和用藥時間延長而增強.作為一種植物雌激素，染料木黃酮結構與17β雌二醇相似［8］，可與雌激素受體(ER)結合，結合后的潛在健康效應表現為U型劑量效應關系，表現為類雌激素活性和抗雌激素活性.染料木黃酮的雌激素作用和抗雌激素作用，取決于劑量及機體甾體雌激素狀態，具有雙向調節平衡功能.此結論與李昱等結論不同［9］.

實驗中觀察到染料木黃酮作用于3AO細胞系后，誘導卵巢癌細胞發生凋亡，從而抑制細胞生長.倒置顯微鏡下可見酷似凋亡的細胞，電鏡下可見典型的細胞凋亡形態學改變.TUNEL法更直觀地觀察到大量陽性凋亡細胞.

卵巢癌是性激素依賴性腫瘤，雌激素有利于卵巢癌的發生，雌激素通過與ERα，ERβ的同二聚體及異二聚體結合發揮生物學作用.Rutherford等［10］發現，在卵巢癌中，ERα/ERβmRNA的比率升高，ERα相對于ERβ的過表達是卵巢癌發生的標志，而此結果系ERβ表達下調所致.本實驗免疫細胞化學結果顯示：染料木黃酮作用后，ERβ表達明顯加強.說明染料木黃酮作為一種植物雌激素，當達到一定濃度時，與雌激素競爭性與ERβ結合，表現為抗雌激素活性，從而誘導卵巢癌細胞發生凋亡，發揮抗腫瘤作用.因此染料木黃酮可能通過ERβ途徑發揮藥理作用.并且，染料木黃酮可能獨立的通過雌激素受體途徑抑制細胞增殖和因子的表達.我們的發現揭示了染料木黃酮化學預防卵巢癌的可能機制，且染料木黃酮幾乎無毒性［11］，為染料木黃酮臨床治療卵巢癌提供一定的實驗依據.

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