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【關鍵詞】血管瘤；核轉錄因子；

摘要：目的：探討NFκBp65在血管瘤發生、發展及退化過程中的表達狀況及其意義。方法：采用免疫組織化學方法（SP法）和原位雜交的方法，檢測人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織及內皮中nfκBp65的表達水平，并利用計算機圖像分析技術測量不同時期血管瘤組織和正常皮膚組織NFκBp65表達的平均光密度和平均陽性面積。結果：增生期血管瘤內皮細胞NFκBp65表達水平高于退化期，差異有顯著性(P＜0.01)；退化期血管瘤內皮細胞NFκBp65表達水平與正常皮膚組織相比，差異無顯著性(P＞0.05)。結論：NFκBp65可能通過調控血管生成因子的表達而促進血管瘤的形成。

關鍵詞：血管瘤；核轉錄因子；

血管生成因子皮膚血管瘤是嬰幼兒常見的良性腫瘤，是以毛細血管內皮細胞增生為主要特征。在血管瘤發生和發展的過程中，血管生成被公認為是其關鍵環節。在眾多血管生成因子中，已證明TGFβ、TNFα、IL1α、IL8、ICAM1等含有NFκB的特異性結合位點，其表達受NFκB的調控，而這其中的一些因子，例如TGFβ、ICAM1等，已被證實與血管瘤的病理演變過程有關。為此我們應用免疫組織化學和原位雜交的方法檢測了同時期人皮膚血管瘤組織中以及正常皮膚組織中NFκBp65蛋白的表達，以探討NFκBp65在血管瘤發生、發展過程中的作用機制。

1材料與方法

11材料

111材料來源收集武漢大學人民醫院病理科1996~2001年皮膚血管瘤存檔蠟塊49例。其中男性26例，女性23例；最小年齡2月，最大年齡68歲，平均年齡30.3歲。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等。患者術前均未做任何輔助性治療。

112材料分組蠟塊切片厚5μm，常規HE染色和免疫組織化學SP法檢測增殖細胞核抗原（PCNA，proliferatingcellnuclearantigen），按Mulliken分類標準并結合PCNA的表達進行分組。增生期血管瘤27例，退化期血管瘤22例，另取瘤組織周圍正常皮膚組織5例作對照。

12試劑與儀器

121主要試劑NFκBp65mRNA原位雜交檢測試劑盒；濃縮型鼠抗人NFκBp65單克隆抗體；即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體；即用型兔抗人第Ⅷ因子相關抗原單克隆抗體；即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸。

122主要儀器YWY781型醫用微波儀(250W，50Hz)；家用高壓鍋。

13方法

131常規HE染色。

132免疫組織化學SP法檢測PCNA和第Ⅷ因子相關抗原及NFκBp65主要步驟：5μm組織切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫處理10min以抑制內源性過氧化物酶活性，PCNA、NFκBp65采用高壓抗原修復，第Ⅷ因子相關抗原采用胃酶消化修復抗原，正常羊血清處理10min以減少非特異性背景，一抗(NFκB，1:200)37℃孵育1h，生物素標記的二抗處理10min，鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶復合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應，蘇木精復染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組，作為NFκBp65的陽性對照組，人正常皮膚組織中的血管內皮細胞作為PCNA的陽性對照組。

133原位雜交檢測NFκBp65mRNA的表達主要步驟：組織切片常規脫蠟至水，3%H2O2室溫處理10min以滅活內源性過氧化物酶。切片上滴加胃蛋白酶，37℃消化25min。按每張切片加20μl含寡核苷酸探針的原位雜交液，37℃恒溫過夜進行雜交。洗脫后滴加封閉液37℃，20min。滴加SAHRP37℃處理20min。DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。用PBS代替含寡核苷酸探針的原位雜交液作為陰性對照組，人扁桃體作為陽性對照組。

14結果判斷

141PCNA和第Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學結果判斷PCNA以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性反應，第Ⅷ因子相關抗原以胞膜或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應，陰性對照組除細胞核染成藍外，應無棕黃色反應物。

142NFκBp65免疫組織化學結果判斷NFκBp65以胞核和胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應，陰性對照組除細胞核染成藍外，應無棕黃色反應物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統對NFκBp65mRNA的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（×400),測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。

143NFκBp65mRNA原位雜交檢測結果判斷細胞膜或胞漿呈藍色為NFκBp65mRNA陽性，陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無藍色反應物。定量分析方法同上。

15統計學處理

對各組NFκBp65免疫組織化學及原位雜交化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗，檢驗水準α為0.05。

2結果

21HE染色

增生期血管瘤組織中可見條索狀或片狀內皮細胞增生，其間有不規則的內皮間隙和完整的血管腔，內皮細胞核肥大而淡染。退化期血管瘤組織中可見內皮細胞減少，血管腔增大，血管間結締組織增多，內皮細胞核扁平。

22PCNA的表達

增生期血管瘤內皮細胞核肥大，核內彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達強；退化期血管瘤內皮細胞核扁平，大多數細胞核被蘇木精染成藍色，少數胞核內有少量棕黃色顆粒，PCNA弱表達。

23第Ⅷ因子相關抗原的表達

增生期和退化期血管瘤內皮細胞胞漿內彌漫分布棕黃色顆粒。

24NFκBp65的表達

增生期血管瘤內皮細胞胞漿和部分內皮細胞胞核內有較多棕黃色顆粒，NFκBp65表達強；退化期血管瘤內皮細胞胞漿內有少許或無棕黃色顆粒沉積，胞核內無棕黃色顆粒沉積，NFκBp65表達極弱或無表達；正常皮膚組織血管內皮細胞胞漿內有少許或無棕黃色顆粒沉積，胞核內無棕黃色顆粒沉積，NFκBp65表達極弱或無表達。經單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P＜0.05)。經q檢驗，增生期組與退化期組、增生期組與正常皮膚組之間平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P＜0.01)；退化期組與正常皮膚組之間平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P＞0.05)。見表1。表1血管瘤不同時期NFκBp65表達的平均光密度和陽性面積率

25原位雜交檢測NFκBp65mRNA的表達

增生期血管瘤內皮細胞胞膜和胞漿有較密集藍色顆粒；退化期血管瘤內皮細胞胞膜和胞漿內無藍色顆粒沉積；正常皮膚組織血管內皮細胞胞膜和胞漿無藍色顆粒沉積。圖像分析結果顯示：增生期血管瘤NFκBp65mRNA表達的平均光密度為0.1563化期血管瘤表達NFκBp65mRNA的平均光密度為0.0617，正常皮膚組織NFκBp65mRNA表達的平均光密度為0.0516；增生期血管瘤表達的NFκBp65mRNA陽性面積率為0.2881，退化期血管瘤NFκBp65mRNA表達的陽性面積率為0.1250，正常皮膚組織NFκBp65mRNA表達的陽性面積率為0.1289。經單因素方差分析，增生期組與退化期組，正常皮膚組與增生期組的差異有顯著性意義（P＜0.05)。經q檢驗，退化期組與增生期組、增生期組與正常皮膚組之間平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義（P＜0.05)。退化期組與正常皮膚組差異無顯著性意義。見表2。表2血管瘤不同時期NFκBp65mRNA表達的平均光密度和陽性面積

3討論

血管瘤是一種良性腫瘤，內皮細胞過度增殖和凋亡、血管迅速生長是血管瘤病理組織學的最大特點。近年來研究表明［1~2］，血管內皮細胞的增殖和血管形成（angiogenesis）在血管瘤病理演變過程中起重要作用。體外組織培養實驗證實血管瘤的血管內皮細胞比正常組織內的血管內皮細胞更易生長，還能攝取3H胸苷,并可見到血管形成現象，提示血管瘤是一種血管形成性疾病［3］。目前，有關血管瘤形成過程中血管內皮細胞過度增殖的研究報道較少。核轉錄因子NFκB是1986年由美國麻省理工學院癌癥研究中心的Baltimore和麻省Whitehead生物醫學研究所的Sen［4］在成熟B細胞和漿細胞中發現的這種能與免疫球蛋白κ輕鏈輕鏈基因的增強子κB序列（5''''GGGACTTTCC3''''）特異結合蛋白，并能促進κ輕鏈基因的表達，并將其命名為NFκB（NuclearfactorofkappaB）。后來的研究發現，NFκB是由各種同源和異源NFκB/Rel蛋白質亞基組成的二聚體，正常情況下，NFκB/Rel二聚體與抑制性蛋白質IκB的亞基結合形成三聚體，以無活性形式存在于胞漿內［5～7］。許多因素例如IL1、TNFα、LPS、病毒感染、雙鏈RNA和PKC的激活等均可活化NFκB，NFκB被活化后，IκB從NFκB復合體上脫落，IκB迅速被分解，活化的NFκB進入細胞核，與細胞核內特定的靶基因的結構域結合，引起相應基因的轉錄。

本實驗采用免疫組織化學方法對NFκBp65在49例人血管瘤組織中的表達進行了檢測，并結合PCNA的表達對血管瘤進行比較準確的分期。另外由于血管瘤組織中細胞成分較多，本實驗通過檢測第Ⅷ因子相關抗原的表達證實了血管瘤組織中表達NFκBp65的細胞是內皮細胞。實驗結果表明，增生期血管瘤內皮細胞胞漿和胞核均有不同程度NFκBp65表達，退化期血管瘤組織和正常皮膚組織中NFκBp65主要表達于內皮細胞胞漿中。而且增生期血管瘤NFκBp65表達水平高于退化期，差異有顯著性(P＜0.01)；退化期血管瘤NFκBp65表達水平與正常皮膚組織相比，差異無顯著性(P＞0.05)。NFκBp65在血管瘤增生期的表達處于較高水平，而在血管瘤的退化期，NFκBp65的表達降低。國外有研究發現，用NFκB反義核苷酸能夠抑制TNFα誘導的血管生成，同時能抑制TNFα介導的堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，提示NFκB對bFGF和VEGF的表達也存在潛在的調節作用。故推測，處于增生期的血管瘤組織中NFκBp65處于活化的狀態，從而促進血管內皮細胞的增殖以及血管瘤的形成。

參考文獻

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2JangYC,IsikFF,GibranNS.Nervedistributioninhemangiomasdependsontheproliferativestateofthemicrovasculature.JSurgRes,2000,93(1):144

3宋天寶,邱東.實用免疫組織化學技術.第一版.陜西科學技術出版社,1994，241.

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7PereraL,WaldmannTA.Activationofhumanmonocytesinducesdifferentialresistancetoapoptosiswithrapiddownregulationofcaspase8/FLICE.ProcNatlAcadSciUSA,2002,95(24):14308~14313.