導(dǎo)語(yǔ)：地塞米松誘導(dǎo)體外培養(yǎng)星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】地塞米松；星型膠質(zhì)細(xì)胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2

摘要：目的：探討地塞米松引起體外純化培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法：不同濃度的地塞米松（濃度為10-5、10-4、10-3mol/L）與純化培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育24小時(shí)后，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)P53、Bax及Bcl2在星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，表達(dá)的強(qiáng)弱用平均光密度表示。結(jié)果：P53和Bax的表達(dá)隨著地塞米松濃度的升高而增強(qiáng)，與對(duì)照組比較，各組均有極顯著性差異（P<0.01）,Bcl2的表達(dá)隨著地塞米松濃度的升高先是增強(qiáng)而后減弱，與其他組比較10-3組有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論：P53和Bax的表達(dá)增強(qiáng)可能是大劑量地塞米松引起星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的主要因素。

關(guān)鍵詞：地塞米松；星型膠質(zhì)細(xì)胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2

在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)約有一千億個(gè)神經(jīng)元，而在這些神經(jīng)元的周圍又約有十倍以上的膠質(zhì)細(xì)胞存在，其中以星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，星型膠質(zhì)細(xì)胞只對(duì)神經(jīng)元起結(jié)構(gòu)和功能上的支持作用，但近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，星型膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)扮演著更為積極和更為重要的角色，這也是膠質(zhì)細(xì)胞成為神經(jīng)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)的一個(gè)直接原因。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)是一類具有神經(jīng)活性的甾體激素，已有許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)GC對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化和凋亡都起重要的調(diào)節(jié)作用，但對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的影響報(bào)道不多。已有報(bào)道證實(shí)大劑量的地塞米松可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡［1］，為進(jìn)一步探討其機(jī)制，我們做了如下研究。

1材料和方法

11材料

新生Wistar大鼠6只（由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；DMEM/F12培養(yǎng)基（GIBCO公司）；胎牛血清和小牛血清（GIBCO公司）；L谷氨酰胺（上海伯奧生物科技有限公司）；地塞米松（湖北恒生制藥有限公司）；兔抗p53、Bax、Bcl2抗體（santacruz公司）；SABC免疫組化試劑盒及DAB試劑盒（北京中山公司）；24孔培養(yǎng)板（Corning公司）；HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）；SL2300二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Sheldon公司）；UFXII光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）。

12方法

121星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)將出生1~2天的新生Wistar大鼠用75%的酒精浸泡消毒后，采用無(wú)菌方法迅速取出大腦，用DHanks液清洗并剔除腦膜和血管，取大腦皮質(zhì)，將組織剪碎為1mm3大小，用0.125%胰蛋白酶37℃消化數(shù)分鐘，過(guò)濾（200目），離心（1000rpm5min），去上清，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基（其中含5%胎牛血清，10%小牛血清，L谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100u/ml,鏈霉素0.1mg/ml）制成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)后按5×104/cm2接種于培養(yǎng)瓶，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9天（每3天更換培養(yǎng)液一次），第9天將培養(yǎng)瓶置于恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上(240rpm)，搖18小時(shí)，去掉含有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液，用DHanks液清洗3次，進(jìn)行傳代培養(yǎng)即得純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞［2］。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)，95%以上的細(xì)胞GFAP免疫反應(yīng)為陽(yáng)性。

122實(shí)驗(yàn)分組在24孔培養(yǎng)板的每一孔內(nèi)放入一張1cm2消毒過(guò)的玻片，涂上多聚賴氨酸，然后將星型膠質(zhì)細(xì)胞分組種在玻片上（細(xì)胞爬片）。純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞被分成1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)樣本。對(duì)照組不加地塞米松，其它3組分別加入終濃度為10-5、10-4、10-3mol/L的地塞米松。在37℃、5%CO2條件下，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),然后作免疫細(xì)胞化學(xué)分析。

123免疫細(xì)胞化學(xué)染色將各組細(xì)胞爬片進(jìn)行SABC法免疫細(xì)胞化學(xué)染色。每一培養(yǎng)孔中的細(xì)胞爬片經(jīng)固定、封閉非特異性抗原和消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶等處理后，首先加入特異性抗體（P53、Bax、Bcl2），4℃孵育72h。然后依次加入生物素化羊抗兔IgG，37℃、1h；SABC復(fù)合物，37℃、1h；DAB顯色5min。每步間均用PBS充分洗滌。所有爬片經(jīng)脫水、透明、中性樹膠封片后，光鏡下觀察、攝片。

以正常兔血清和PBS緩沖液替代一抗作對(duì)照染色，結(jié)果為陰性。

124圖像分析用HPIAS1000高清晰圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及平均光密度分析。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，以方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05定為差異有顯著性,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2結(jié)果

21形態(tài)學(xué)觀測(cè)結(jié)果

P53對(duì)照組：可見(jiàn)少數(shù)免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，主要見(jiàn)于胞核（圖1）。10-5組：免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞增多，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，見(jiàn)于胞核，胞漿淡染（圖2）。10-4組：免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，見(jiàn)于胞核，胞漿也有表達(dá)（圖3）。10-3組：大多數(shù)細(xì)胞呈免疫反應(yīng)陽(yáng)性，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色，胞核胞漿界限不清（圖4）。

Bax對(duì)照組：細(xì)胞大小形態(tài)一致，核膜著色呈棕黃色，胞核中央有透亮區(qū)，胞漿淡染（圖5）。10-5組：免疫反應(yīng)產(chǎn)物顏色加深，細(xì)胞形態(tài)變化不大（圖6）。10-4組：顏色進(jìn)一步加深，細(xì)胞形態(tài)無(wú)太大變化（圖7）。10-3組：免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色，胞漿染色明顯加深，少數(shù)細(xì)胞體積縮小，核濃縮、深染（圖8）。

Bcl2對(duì)照組、10-5組、10-4組這3組細(xì)胞大小形態(tài)基本一致，細(xì)胞著色變化也不大，胞核胞漿均有著色，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色（圖9~11）。10-3組：與前3組比較，10-3組細(xì)胞染色明顯變淺，尤其是胞漿明顯淡染（圖12）。圖1對(duì)照組P53的表達(dá)(×200)圖210-5組P53的表達(dá)(×200)

22圖像分析結(jié)果

221地塞米松對(duì)P53表達(dá)的影響不同濃度（對(duì)照組、10-5組、10-4組、10-3組）地塞米松與純化的星型膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育24小時(shí)后，P53的表達(dá)隨著地塞米松濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組比較各組均有極顯著性差異（P<0.01），各濃度組（10-5組、10-4組、10-3組）之間兩兩比較也有極顯著性差異（P<0.01），見(jiàn)表1。

222地塞米松對(duì)Bax表達(dá)的影響不同濃度（對(duì)照組、10-5組、10-4組、10-3組）的地塞米松與純化的星型膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育24小時(shí)后，Bax的表達(dá)也隨著地塞米松濃度的升高而增強(qiáng)，但其幅度有所減緩，與對(duì)照組比較各組均有極顯著性差異（P<0.01），各濃度組（10-5組、10-4組、10-3組）之間兩兩比較有顯著性差異（P<0.05）,見(jiàn)表1。

223地塞米松對(duì)Bcl2表達(dá)的影響不同濃度（對(duì)照組、10-5組、10-4組、10-3組）的地塞米松與純化的星型膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育24小時(shí)后，Bcl2的表達(dá)變化較復(fù)雜，先是10-5組呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，從10-4組開(kāi)始出現(xiàn)減弱趨勢(shì)，至10-3組出現(xiàn)明顯減弱，其中對(duì)照組、10-5組、10-4組之間經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）,而10-3組與其他各組比較有顯著性差異（P<0.05）,見(jiàn)表1。表1星型膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)Dex處理后P53、Bax、Bcl2表達(dá)的平均光密度

224地塞米松對(duì)Bax與Bcl2表達(dá)比值（Bax/Bcl2）的影響把每一濃度組Bax表達(dá)的平均光密度與同組Bcl2的平均光密度作一比值，我們發(fā)現(xiàn)隨著地塞米松濃度的升高，Bax/Bcl2值也逐漸升高，而10-3組最為顯著，見(jiàn)表2。表2星型膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)Dex處理后Bax與Bcl2平均光密度比值

3討論

細(xì)胞凋亡（程序化細(xì)胞死亡）與細(xì)胞壞死完全不同，它是一種積極意義上的細(xì)胞死亡，它不但在病理?xiàng)l件下而且在多種生理?xiàng)l件下發(fā)揮著重要的作用［3,4］。有大量證據(jù)表明，在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的神經(jīng)細(xì)胞的死亡大多與凋亡有關(guān)［5］。另外，局部缺血、興奮毒性作用、腦外傷和慢性退行性病變等都可促使凋亡的發(fā)生［4,6］。已有報(bào)道證實(shí)，大劑量的地塞米松可引起體外純化培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡［1］，但其確切機(jī)制尚不清楚。為了探討其中的機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)地塞米松是否引起了P53、Bax及Bcl2表達(dá)的變化。我們發(fā)現(xiàn)，P53的表達(dá)隨著地塞米松濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，Bax的表達(dá)也隨著地塞米松濃度的升高而增強(qiáng)，但其幅度有所減緩，Bcl2的表達(dá)先是10-5組呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，從10-4組開(kāi)始出現(xiàn)減弱趨勢(shì)，至10-3組出現(xiàn)明顯減弱，這樣導(dǎo)致Bax/Bcl2值逐漸升高，10-3組最為明顯，這可能是10-3組引起星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的直接原因。

眾所周知，很多原因比如缺血、放射線以及興奮毒性作用都可以引起P53表達(dá)的增強(qiáng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡［2，7］。P53基因編碼的產(chǎn)物，即P53蛋白可以調(diào)節(jié)Bax的表達(dá)，而Bax可能是介導(dǎo)P53依賴的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要因素［8］。另外，Whiteetal發(fā)現(xiàn)在敲除掉Bax基因的小鼠大腦中很難找到自然死亡的神經(jīng)細(xì)胞［9］。有人發(fā)現(xiàn)P53可以通過(guò)降低Bcl2的表達(dá)來(lái)間接地引起細(xì)胞凋亡［10］。Bax可以通過(guò)與Bcl2形成同型或異型二聚體來(lái)促進(jìn)凋亡的發(fā)生［11］，因此，Bax與Bcl2比例的變化就可以決定某些細(xì)胞是存活或是死亡［11］。在本實(shí)驗(yàn)中，地塞米松引起P53持續(xù)升高，Bax也有類似的表現(xiàn)，而Bcl2是先升后降。總之，P53、Bax、Bcl2經(jīng)過(guò)地塞米松作用后其表達(dá)都發(fā)生了顯著的改變，尤其是10-3組，這提示它們?cè)诘厝姿烧T導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Bax表達(dá)增強(qiáng)可能是P53表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果，因?yàn)镻53可以促進(jìn)Bax的轉(zhuǎn)錄和翻譯［10］。另一方面，P53表達(dá)的增強(qiáng)又可能抑制了Bcl2，使它表達(dá)下降［10］，但是細(xì)胞本身可能存在一種抗凋亡的補(bǔ)償機(jī)制［12］，使得在Bax表達(dá)增強(qiáng)的情況下Bcl2也加強(qiáng)表達(dá)，以對(duì)抗Bax的促凋亡作用，但這種抗凋亡作用是有一定限度的，因此，Bcl2的表達(dá)先增強(qiáng)后減弱。Bax/Bcl2值因此進(jìn)行性升高，這可能直接導(dǎo)致10-3組星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。

地塞米松引起P53和Bax表達(dá)增強(qiáng)可能是通過(guò)作用于胞漿內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體開(kāi)始的。L.E.Haynes報(bào)道地塞米松能引起在體紋狀體和海馬神經(jīng)元凋亡，但這種作用可被糖皮質(zhì)激素受體阻滯劑RU38486阻斷［13］。類似的報(bào)道還有，Karine發(fā)現(xiàn)地塞米松能誘導(dǎo)脾B淋巴細(xì)胞凋亡，但同樣可被RU486完全阻斷［14］。地塞米松與胞漿內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合后，受體的構(gòu)象發(fā)生改變，激素受體復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)與激素反應(yīng)元件GRE結(jié)合，可能激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致P53和Bax表達(dá)增強(qiáng)，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Bax能與自身形成二聚體，這種二聚體在線粒體膜上可以組成離子通道［15］，線粒體膜內(nèi)外的小分子和離子可通過(guò)該通道進(jìn)行被動(dòng)擴(kuò)散，結(jié)果引起線粒體膜電位的改變，去極化，細(xì)胞色素C釋放入胞漿，繼而引起與細(xì)胞凋亡有關(guān)的一系列蛋白酶（Caspases）的活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

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