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【摘要】目的探討共培養體系中體細胞對胚胎早期發育的影響及比較2種常用共培養體系的優劣。方法實驗分3組:同種不同類型體細胞,受精卵分別在含顆粒細胞和成纖維細胞的M199培養液中培養;異種同類型體細胞,受精卵分別在含牛顆粒細胞和小鼠顆粒細胞中M199培養液中培養;2種共培養體系比較,受精卵分別在“M199+顆粒細胞”和“B2+Vero細胞”的共培養體系中培養。結果顆粒細胞組較成纖維細胞組囊胚率高(P<0.05);牛顆粒細胞組和小鼠顆粒細胞組在卵裂率和囊胚率方面差別無統計學意義;“M199+顆粒組”在卵裂率和囊胚率方面與“B2+Vero組”差別無統計學意義,但囊胚細胞數較少(P<0.05)。結論在一定的條件下,共培養體系中體細胞對胚胎早期發育有一定影響;“B2+Vero細胞”的共培養體系優于“M199+顆粒細胞”的共培養體系。

【關鍵詞】胚發育共培養

ABSTRACT:ObjectiveTostudytheeffectofsomaticcellcoculturesystemontheearlybovineembryodevelopmentandcomparisonoftwodifferentcoculturesystems.MethodsExperiment1:thesomaticcellswereofthesamebreedbutdifferenttypes(granulecellgroupandfibroblastgroup);experiment2:thesomaticcellswereofthesametypebutdifferentbreeds(bovinegranulecellgroupandmousegranulecellgroup);experiment3:comparetwococulturesystem(M199+granulecellgroupandB2+Verocellsgroup).ResultsInexperiment1,granulecellgroupwassimilartofibroblastgroupincleavageratebuthigherinblastocystrate;inexperiment2,therewasnodifferencebetweentwogroupsincleavagerateandblastocystrate;inexperiment3,therewasnodifferencebetweentwogroupsincleavagerateandblastocystrate,buttotalcellnumberofblastocystsinB2+VerocellsgroupwashigherthanthatofM199+granulecellgroup.ConclusionSomaticcellcoculturesystemmayhaveaneffectontheearlyembryodevelopmentsomeconditions,andthecoculturein“B2+Verocells”isbetterthanin“M199+granulecells”forbovineearlyembryodevelopment.

KEYWORDS:embryo;development;coculturesystem

目前,胚胎早期發育體外培養體系可以分為合成液培養體系和共培養體系。合成液培養體系是利用成分確定的合成培養液,該體系成分明確,便于研究胚胎發育過程中每一種物質對胚胎的作用機制,但桑椹胚和囊胚發育率不高。胚胎體外共培養體系是指胚胎與體細胞一起在培養液中共同培養以促進胚胎的體外發育。共培養體系可以獲得較高的囊胚發育率,而高囊胚發育率是許多科學研究和生產實踐所追求和必需的。

為探索胚胎早期發育最佳的體外培養體系，特別是胚胎與體細胞共培養體系，人們已取得一定成果[1]，但仍有許多問題尚不明確。本研究以奶牛胚胎為受試對象，探討共培養體系如何提高胚胎的囊胚發育率,體細胞的效應有無種間差異及不同類型的同種體細胞有無差異。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1胚胎

取自12只發情周期正常的青年荷斯坦奶牛(由上海滔滔v轉基因有限公司提供),年齡12～13月,體質量和體況相似。

1.1.2試劑

TCM199（美國Gibco生物試劑公司）,其余試劑購自美國Sigma公司。

1.1.3分組

(1)同種不同類型體細胞:顆粒細胞組,受精卵培養全程均在M199培養液含牛顆粒細胞單層中培養;成纖維細胞組,受精卵培養全程均在M199培養液含牛成纖維細胞單層中培養。(2)異種同類型體細胞:牛顆粒細胞組,受精卵培養全程均在M199培養液含牛顆粒細胞單層中培養;小鼠顆粒細胞組,受精卵培養全程均在M199培養液含小鼠卵丘細胞單層中培養。(3)兩種共培養體系比較:M199+顆粒組,受精卵培養全程均在M199培養液含牛顆粒細胞單層中培養;B2+Vero組,受精卵培養全程均在B2培養液含Vero細胞單層中培養。

1.2方法

1.2.1卵丘

卵母細胞復合體(COC)獲得通過活體取卵(ovumpickup,OPU)方式獲得,具體操作見文獻[2]。

1.2.2卵母細胞體外成熟、體外受精和體外培養

參照文獻[3],COC在成熟液(TCM199+10%FBS+LH10μg/mL+E21μg/mL+FSH1μg/mL)中培養23～24h。培養條件:體積分數為0.05的CO2、38.5℃、飽和濕度。使用同一公牛同一批號的凍精液進行受精,受精液為BO液,使精子的最終密度約為1×106mL-1。置CO2培養箱精卵共孵育6～8h。將受精卵按每50μL10～20個移入體外培養滴。每隔48h半量更換培養液。受精48h后計算卵裂率,第8天計算囊胚率。

1.2.3共培養體系中體細胞單層制備

牛顆粒細胞單層:從OPU收集到的檢卵液中挑選光澤度好、細胞致密的顆粒細胞碎片,加入0.25%胰酶吹打1min,離心洗滌2次,體外培養液懸浮細胞,細胞長滿約80％加入受精卵。

小鼠顆粒細胞單層:雌性昆明白小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素PMSG(10IU),48h后注射人絨毛膜促性腺激素HCG(10IU/),13～15h后輸卵管壺腹部取卵,用透明質酸酶消化COC,收集消化下來的卵丘細胞,體外培養液離心洗滌2次,懸浮細胞,細胞長滿約80％時,加入受精卵。

Vero細胞單層:用0.25%胰酶消化長至70％～80％的Vero細胞,離心洗滌2次,B2培養液懸浮細胞,細胞長滿約80％時,加入受精卵。

牛成纖維細胞單層:選用2～5代的牛成纖維細胞,M199體外培養液離心洗滌2次,懸浮細胞,細胞長滿約80％時,加入受精卵。

1.2.4囊胚期細胞計數

培養第8天的囊胚用5μg/mLHoechst33342溶液染色5min,用蓋玻片壓破胚胎,熒光顯微鏡下計數,每個囊胚統計3次,計算均值[4]。

1.3統計學處理

使用SAS6.12統計軟件進行卡方檢驗和方差分析,P＜0.05為差別有統計學意義。

2結果

在同種不同類型體細胞研究中,以顆粒細胞為單層的顆粒細胞組比以成纖維細胞為單層的成纖維細胞組囊胚率較高(P＜0.05),但卵裂率兩者相似(表1)。表1同種但不同類型體細胞的共培養效果（略）

在異種同類型體細胞研究中,牛顆粒細胞組和小鼠顆粒細胞組在卵裂率和囊胚率差別無統計學意義(表2)。表2異種同類型體細胞的共培養效果（略）

在兩種共培養體系的研究中,M199+顆粒組雖然在卵裂率和囊胚率與B2+Vero組差別無統計學意義,但囊胚中的總細胞數較少(P<0.05,表3)。表3兩種不同的共培養體系的共培養效果（略）

3討論

3.1共培養體系的機制

共培養體系是利用體細胞在體外與受精卵共同培養,促進胚胎發育。目前,已有一些實驗證明共培養體系確實能夠顯著提高胚胎體外早期發育的囊胚率。其主要機制可能有:(1)體細胞分泌一些促進胚胎早期發育的物質。最有可能的物質為一些生長因子,如轉化生長因子α及β(TGFα和TGFβ)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子（IGF）等。Wastond等用反轉錄擴增法證明,在培養的體細胞中有IGF、FGF、TGFα和TGFβ的mRNA的轉錄。另一方面在早期發育胚胎中有生長因子受體的表達。(2)共培養細胞在降低氧壓,清除氧自由基等方面發揮重要作用。共培養體系培養箱中通常用的氧濃度為空氣中的20％左右,但在正常生理狀況下,輸卵管和子宮中氧濃度為3.5%～8.5%。研究表明，共培養能降低培養體系中的氧壓和氧自由基使胚胎克服發育阻斷[58]。

3.2共培養體系中同種但不同類型體細胞的研究

Goto等將牛的受精卵分別與顆粒細胞、輸卵管細胞和子宮細胞在M199液中共培養,囊胚率差異不顯著[9],但本實驗分別用顆粒細胞和成纖維細胞同在M199共培養卻得出囊胚率差異顯著的結論。分析其原因可能為顆粒細胞、輸卵管細胞和子宮細胞都屬生殖系統細胞,在共培養時分泌的促發育物質相似,物質代謝的途徑相似。而本實驗中的顆粒細胞和成纖維細胞分屬不同的系統,差異較大,卵丘細胞與胚胎關系密切,其分泌的物質和代謝途徑更適合胚胎的早期發育,因此囊胚率較高。另外,可能與共培養細胞傳代的次數也有關聯。隨著傳代次數的增多,培養細胞的形態和功能將發生改變。本實驗中的成纖維細胞為2～5代的細胞,可能在一定程度上影響成纖維細胞對胚胎發育的促進作用。

3.3共培養體系中異種同類型體細胞的研究

Eiiington等用同種或異種輸卵管上皮細胞體系共培養都得到較好的結果[10],本實驗用牛卵丘細胞和小鼠卵丘細胞培養牛胚胎也都得到較好的囊胚發育率,說明卵丘細胞的種間差異對牛胚胎早期發育的體外培養影響不大。但相比較而言,小鼠的卵丘細胞在生物安全性上將更有保證。因為在牛胚胎體外生產中,制備共培養單層的顆粒細胞常常是來源于屠宰場的卵巢,可能出現未知病原菌如病毒或蛋白侵染子的感染,影響胚胎的發育及附植。因此,小鼠卵丘細胞促進牛胚胎的早期發育具有一定的理論意義和實踐意義。

3.4兩種較常用的共培養體系

Desal等檢測到了胚胎與Vero細胞共培養時Vero細胞釋放的生長因子和細胞因子,包括血小板生長因子、白細胞介素6、EGF、TGFα和TGFβ等。本實驗用B2+Vero細胞的共培養體系同樣獲得較好的囊胚發育率,并且與M199+顆粒細胞相比,囊胚細胞數較多,質量較高。此外B2+Vero共培養體系還有其獨特的優勢。由于B2培養液和Vero細胞都是商品化的,在來源和制備上較為容易,結果也更加穩定,更重要的是在生物安全性上也更有保證[11],因此,B2+Vero共培養體系是一種較好的胚胎早期發育體外共培養系統。

【參考文獻】

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