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摘要目的：探討水楊酸(SA)與載體蛋白間連接橋的改變對識別SA抗體的產生及SAELISA靈敏度的影響。方法：將SA、4-氨基水楊酸、5-氨基水楊酸分別用不同的方法與載體蛋白相偶聯，從而在SA苯環的C4、C5兩個不同位點合成了3種免疫原：SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)和SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)及4種包被物：SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA。免疫新西蘭白兔制備抗體，用ELISA法檢測。結果：獲得針對A和C的兩種多克隆抗體，后一種能專一識別游離態水楊酸，改變包被物中連接橋的結構可提高SAELISA的檢測靈敏度，故選用SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA建立了SAELISA。結論：SA與載體蛋白間連接橋的改變對識別SA抗體的產生和SAELISA的靈敏度有很大影響。

關鍵詞水楊酸半抗原載體連接橋多克隆抗體酶聯免疫檢測法

Effectofchangingconjugationbridgebetweenhaptenandcarrierproteinonthesensitivityofsalicylateelisa

WANGShu-Cai,ZHOUXie.

DepartmentofAgronomy,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095

AbstractObjective：TostudytheeffectofchangingconjugationbridgebetweenhaptenandcarrierproteinontheraisingofantibodiesagainstsalicylicacidandthesensitivityofsalicylateELISA.Methods:Threekindsofsalicylicacid(SA)immunogens:SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)andSA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)andfourkindsofSAcoatingconjugates:SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVAandSA(C5)-NH-CH2-NH-OVAweresynthesizedbylinkingSA、4-aminosalicylicacidand5-aminosalicylicacidrespectivelytobovineserumalbumin(BSA)andovalbumin(OVA)throughdifferentconjugationmethods.RaisingofantibodiesinrabbitsandeffectofchangingconjugationbridgeonthesensitivityofsaliaylateELISAweredetectedbyELISA.Results:TwokindsofpolyclonalantibodieswereraisedinrabbitsagainstimmunogensAandCrespectively.TheantibodiesagainstimmunogenCpossessedahighspecificity.UsingtheseantibodiesandchoosingSA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVAasacoatingconjugate,akindofELISAwasdevelopedwhichdisplayedalinearityrangefrom0.064to200.000nmolofSA.Conclusion:ConjngationbridgechanginghasagreateffectontheraisingofantibodiesagainstsalicylicacidandthesensitivityofsalicylateELISA.

KeywordsSalicylicacidConjugationbridagePolyclonalantibodiesELISA

定量檢測半抗原的ELISA在植物學研究中已得到廣泛應用［1］，但其建立比較困難，因為半抗原與載體蛋白相偶聯的人工免疫原所誘導產生的往往是特異性不同的抗體群，制備單克隆抗體時，可以通過篩選得到專一識別半抗原的抗體［2］，而基于多克隆抗體的ELISA往往因多種抗體并存，非特異結合率較高。通過改變包被物中載體蛋白種類可以提高檢測靈敏度［3］，但反應體系中仍存在識別連接橋抗體的干擾。能否通過改變連接橋的結構以消除或減少這一類干擾呢?作者對此進行了探索。

1材料與方法

1.1化學試劑4-氨基水楊酸(p-aminosalicylicac-id,p-ASA)、4-氨基馬尿酸(p-aminohippuricacid,p-AHA)、碳化二亞胺(EDC)、5-氨基水楊酸(5-aminosalicylicacid,5-ASA)購自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)購自上海生化試劑采購站；福氏不完全佐劑自制；其它試劑均為分析純。

1.2免疫原的合成

1.2.1SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)的合成通過重氮化氨基馬尿酸法［4］。

1.2.2SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)的合成按Bennett的方法［5］。

1.2.3SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)的合成用Mannich反應［4］：100mgBSA溶于2ml蒸餾水，加入3mol/L乙酸鈉0.67ml,7.5%(W/V)甲醛1.2ml，最后加入5-ASA溶液(50mg溶于2.5ml1mol/LNaOH)，調節pH至8.5，室溫下攪拌過夜。將反應物裝入透析袋，4℃下先對0.1mol/LNaHCO3，后對蒸餾水充分透析，冷凍保存。

1.3包被物的合成

1.3.1SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA的合成合成程序與A相同，僅以OVA代替BSA。

1.3.2SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA和SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA的合成合成程序與B的相同，以OVA代替BSA合成SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。同時以5-ASA與OVA偶聯合成SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。

1.3.3SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA的合成合成方法與C的相同，僅以OVA代替BSA。

1.4抗血清的制備和純化參照Weiler的方法，每種免疫原免疫3只新西蘭白兔［6］。第4(或5)次免疫后9d行頸動脈全放血。血樣置37℃2h后移入4℃冰箱過夜，4000r/min，離心20min，取上清。用飽和硫酸銨法純化抗血清。

1.5SAELISA操作程序非競爭性ELISA程序參見Zheng等，用于抗體的產生和效價的檢測［7］。競爭性ELISA程序參見張能剛等，用于SA對抗體與包被物結合的抑制率及抗體對SA類似物的交叉反應率的測定［8］。

2結果

2.1抗體的產生4次免疫后，用連接橋相同的包被物的非競爭ELISA檢測，發現免疫原A和C誘導產生了高效價的抗體即PAbs(A)和PAbs(C)，其最高效價分別為12800和25600(以OD值為1.0時的抗血清稀釋倍數表示)。而以戊二醛法合成的免疫原B，經5次免疫也未能檢測到抗體的產生。

2.2連接橋不同的免疫原誘導產生的抗體對SA的特異性競爭性ELISA檢測表明，PAbs(A)對SA的識別能力較低(基于連接橋相同的包被物，SA濃度高達400nmol/50μl時，其抑制率僅為31.05%)，而PAbs(C)在用同型連接橋的包被物時已表現出對SA較高識別力，而改用異型連接橋的包被物，其抑制率又有明顯提高(表1)。

在繼續使用異型連接橋包被物的條件下，我們檢測了PAbs(C)對13種SA類似物的交叉反應率，結果表明：PAbs(C)除對5-ASA的交叉反應率高達141.2%、對5-磺基水楊酸和4-氨基水楊酸的交叉反應率也較高，分別為15.9%和3.7%，對乙酰水楊酸、對羥基苯甲酸、對氨基苯甲酸、N-苯基鄰氨基苯甲酸、3，5-二硝基水楊酸、苯羥乙酸、水楊醛肟、2，4-二硝基酚、水楊酸鈉和2，4-二氯酚10種類似物的交叉反應率均不高于2.1%，甚至表現為不識別，表明PAbs(C)對SA具有相當高的特異性。

2.3SAELISA的建立基于上述結果，以PAbs(C)為第一抗體，SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA為包被物建立了SAELISA，其靈敏度為0.030nmol，線性檢測范圍為0.064～200.000nmol。

表1包被物連接橋結構的改變對PAbs(C)與SA特異結合的影響

Tab.1EffectsofchangingbridgeofcoatingconjugateonthebindingspecificityofSAtoPAbs(C)

CoatingconjugateInhibitoryrate(1-B/B0,%)

SA(nmol/50μl)0.1280.6403.20016.00080.000400.000

SA-NH-CH2-NH-OVA6.7810.1717.8024.5848.3180.34

SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA2.136.9424.3539.8164.5292.56

Note:B.bindingoftracertoantibodyinthepresenceofSA;B0.bindingoftracertoantibodyintheabsenceofSA

3討論

3.1半抗原的偶聯位點以及和載體之間連接橋的結構對產生抗體的影響SA的分子量僅138.1，與載體偶聯后才能具備免疫原性。作者在SA苯環的C4和C5位分別偶聯載體蛋白合成了3種結構不同的免疫原。結果C4位偶聯合成的免疫原未能誘導產生抗體，而Bennett等用同樣方法將SA與KLH偶聯卻制成了識別SA的羊抗體(但未見其建立ELISA的報道)［5］，這可能與KLH異源性比BSA強和不同物種的免疫應答不同有關。C5位偶聯合成的免疫原C和A都誘導產生了高效價的抗體，而前一種能較強地識別SA。提示偶聯位點及連接橋的結構對特異性抗體的產生有很大的影響。同時前一種抗體對SA類似物的交叉反應率較低，從而可以排除樣品中SA衍生物的干擾，確保ELISA的可靠性。

3.2包被物中連接橋結構的改變對SAELISA靈敏度的影響改變包被物中的蛋白種類可以消除識別載體蛋白抗體的干擾，部分地提高了ELISA的靈敏度，但反應體系中仍存在識別連接橋抗體的干擾，使抗體與包被物的非特異結合偏高。因此，作者在建立SAELISA時，針對免疫原C誘導產生的抗體，不僅通過改變載體蛋白的種類(OVA代替BSA)，而且嘗試改變連接橋的結構即-N=CH-(CH2)3-CH=N-代替-NH-CH2-NH-來合成包被物，使SA對抗體與包被物結合的抑制率明顯提高(表1)，從而提高了SAELISA的靈敏度。

同樣，在檢測吲哚乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)等的固相抗原型ELISA中也存在著非特異結合率偏高的問題，是否也可通過改變連接橋的結構來提高檢測的靈敏度呢?有待進一步探索。

作者簡介：王樹才，男，30歲，碩士；

指導教師，周燮，男，教授,博士生導師，主要從事植物激素及其免疫檢測技術的研究作者單位：(南京農業大學農學系，南京210095)

4參考文獻

1CarusoJL,PenceVC,LeslieA.Immunoassaymethodsofplanthormoneanalysis.In:herland:KluwerAcademicPublisher,1995:433-447

2ZhengZF,ZhouX,ChenJG.PreparationofmonoclonalantibodiesspecificformethylestersofgibberellinsA7andA4.ChineseJournalofBiotechnology,1996;11(4):221

3陳金桂，周燮.在吲哚乙酸不同位點偶聯載體蛋白對其抗體特異性的影響.生物技術，1996；6(6)：21

4RobinsRJ.Themeasurementoflow-molecular-weight,non-immunogeniccompoundsbyimmunoassay.In:LinskensHF,JacksonJFeds.ImmunologyinPlantSciences.Germany:Springer-verlag,1986:86-144

5BennettAP,GallacherG,LandonJ.Theraisingandcharacterisationofantibodiestosalicylate.AnnCliBiochem,1987;24:374

6WeilerEW.Planthormoneimmunoassaybasedonmonoclonalandpolyclonalantibodies.In:LinskensHFandJacksonJFeds.ImmunologyinPlantSciences.Germany:Springer-verlag,1986:1-17

7ZhengZF,ZhouX.Amonoclonalantibodyrecognizingnon-derivative13-hydroxygibberellinsandtheirglucosides.ActaBotanicaSinica,1995;37(10):761

8張能剛，周燮，吳頌如.吲哚乙酸間接酶聯免疫法的建立.南京農業大學學報，1990；13(1)：116