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摘要目的：將抗人原發性肝癌(PLC)單抗TIGTC-Ⅲ，用胃蛋白酶法消化成F(ab′)2片段，標記131I后進行裸鼠人肝癌移植瘤的體內定位研究。方法：采用胃蛋白酶消化法，進行裸鼠體內核素顯像。結果：消化產率為31.7%±2.4%，經細胞結合實驗證明F(ab′)2具有良好的免疫活性，抗體片段進入裸鼠體內后，與完整抗體比，進入腫瘤的速度快，生物學分布特異性高，定位指數上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明顯縮短。結論：F(ab′)2與全抗體比較可使成像時間提前，定位清晰。

關鍵詞單克隆抗體F(ab′)2片段放射免疫顯像

ThepreparationofF(ab′)2fragmentofmonoclonalantibodyTIGTC-Ⅲanditsapplicationintumorradioimmunoimagine

SHILe-Hua,YANGJia-He,CUIZhen-Fuetal.

EasternHepatobiarySurgeryHospital,TheSecondMilitaryMedicalCollege,Shanghai200433

AbstractObjective：InordertorealizetheimmunoimmagingwithF(ab′)2fragmentofmonoclonalantibody(TIGIC-Ⅲ)forPLC.Methods：Monoclonalantibody(TIGTC-Ⅲ)againsthumanprimarylivercancer(PLC)wasdigestedintoF(ab′)2fragmentbypepsindigestion.Afterlabelledwith131Iand125IradioiodinatedF(ab′)2wasinjectedintonudemicebearingtumorxenograftsofPLCviatailveinandradioimmunoimaginewasperformed.Results:TheexperimentresultsshowedthattheyieldofpureF(ab′)2was31.7%±2.4%,theimmunoreactivityofF(ab′)2basedonthecellbindingstudieswasretainedwell.Aftertheinjectionof131I-F(ab′)2intoPLCtumor-bearingnudemice,photoscintigraphywasperformedatintervalsof12h.Thexenograftswerevisualizeddistinctlyduring24～96h.Conclusion：Theratiooftumortonon-tumor(T/NT)washigherthanthoseoftheintactIgGinalltissues.XenograftsofPLCinnudemiceacumulatedTIGTC-Ⅲ.Theexcretionofradioactivitywasdecreasedrepidly.

KeywordsMonoclonalantibodyF(ab′)2Radioimmunoimagine

用胃蛋白酶法制成TIGTC-Ⅲ的活性片段F(ab′)2，標記上131I后進行了裸鼠人肝癌移植模型的放射免疫顯像(RII)研究。

1材料與方法

1.1單抗TIGTC-Ⅲ的制備TIGTC-Ⅲ系將肝癌細胞株HEPG2免疫Balb/c小鼠后將其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合而成的雜交瘤分泌的一系列抗體之一，已經抗體的專一性分析［1］。

1.2抗體片段F(ab′)2的制備與純化按Harlow方法進行［2］。

1.3TIGTC-Ⅲ和F(ab′)2的標記及其免疫活性測定用氯胺T法［3］。標記物用SephadexG-25柱分離，去除游離碘。0.22μm微孔濾膜除菌，用細胞結合分析法測定免疫活性。

1.4荷人肝癌裸鼠模型的建立［4］將PLC細胞接種在4周齡的Balb/c裸小鼠腋部皮下，待腫塊長到0.8cm3左右時進行定位及治療研究。

1.5放射免疫顯像及抗體的生物學分布

1.5.1動物處理標記抗體注射前72h起，在飲用水中加1%碘化鉀，以封閉裸鼠甲狀腺對碘的攝取。

1.5.2TIGTC-Ⅲ及F(ab′)2在荷瘤裸鼠體內的分布［5］12只荷瘤裸鼠，每鼠注射7.4×106Bq的125I-F(ab′)2，給藥后每24h處死3只，取腫瘤、血液及各臟器。分別稱重并測其放射性算出T/NT。另取3只荷瘤鼠，從尾靜脈注入125I-F(ab′)2及非特異性的131I-F(ab′)2，48h后處死，取器官組織稱重后分別測放射性計數，計算定位指數。

1.5.3放射免疫顯像每鼠注射200μCi/0.1mg的131I-F(ab′)2，對照組注射相同劑量的非特異131I-

F(ab′)2，每12h行γ照射。

1.5.4標記抗體的生物半衰期42只8周齡的Balb/c小鼠，分完整抗體組與F(ab′)2組。分別于給藥后12、24、48、72、96、120h處死，分離血清并加200μl肝細胞(1×106)，測放射性計數后算出抗體的生物半衰期。

1.5.5TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的體內藥代動力學取6只8周齡Balb/c小鼠分全抗體與F(ab′)2組，給藥后分別于6、12、24、48、72、96、120h自尾靜脈取血10μl，測放射性后繪制放射性-時間曲線。

2結果

2.1抗體片段的制備純化TIGTC-Ⅲ，經電泳檢測純度大于95%。用胃蛋白酶消化，16h以上消化完全。消化液經層析后第1峰為F(ab′)2。其產率為31.7%±2.4%。

2.2標記抗體的質量控制TIGTC-Ⅲ的標記率為72%，比活度為7.54MBq/mg，放化純度92.5%±1.7%。TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2標記上碘后，與PLC細胞的結合率分別為45%與28%，mIgG與其F(ab′)2的結合率均小于5%。

2.3不同時間每克腫瘤及其它組織對TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的攝取量見表1。

2.4不同時間的T/NT值見表2。

2.5定位指數靜注碘標抗體后48h，測得定位指數TIGTC-Ⅲ為3.45，TIGTC-ⅢF(ab′)2為5.88。

2.6荷瘤鼠放射免疫顯像注入抗體后24h瘤區有放射性濃聚，36h后腫瘤顯像。顯像最佳時間為全抗體96h左右(圖1，B)，F(ab′)236～48h(圖1，A)，mIgG整個顯像過程無明顯濃聚(圖1，C)。

2.7抗體的清除速率及生物半衰期F(ab′)2在心血管的清除明顯快于完整抗體，F(ab′)2的生物半衰期約20.0h，全抗體為52.6h左右，兩者差異顯著。

表1裸鼠組織對完整抗體及其片段的攝取率

Tab.1PercentageintakeofTIGTC-ⅢandF(ab′)2pergramoftissue

Tissue24h48h72h

TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2

Tumor0.311.412.210.793.110.68

Heart0.460.360.480.300.450.15

Blood2.511.451.870.621.620.41

Kidney0.911.750.926.870.760.59

Liver1.620.501.860.321.270.20

Lung0.860.940.670.580.630.22

Muscle0.360.250.310.240.420.15

Spleen1.390.811.520.401.230.19

Bone0.330.210.350.190.470.11

表2裸鼠注射完整抗體及其片段后的T/NT值

Tab.2T/NTvaluesofdifferenttissueinnudemiceafterinvivoinjectionofTIGTC-Ⅲ&F(ab′)2

Tissue24h48h72h

TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2

Cerebrum19.5018.3321.8020.2023.5022.80

Bone2.702.852.953.023.202.85

Blood0.690.890.711.180.781.22

Heart1.380.692.502.883.102.72

Intestine2.251.124.754.865.305.58

Kidney1.080.432.150.562.400.81

Liver2.072.552.603.843.024.24

Lung1.270.981.340.761.500.80

Muscle3.503.253.783.453.853.47

Skin0.430.660.981.721.421.56

Spleen1.671.902.253.442.483.89

Stomach1.410.722.853.983.704.65

圖1F(ab′)2注入荷人肝癌裸鼠體內后72h的RII

Fig.1TheradioimmunoimageofPLC-bearingnudemice72hafterinjectionofF(ab′)2

3討論

在以單抗為載體的放射免疫顯像中，由于完整抗體的Fc段常與組織細胞的Fc受體結合而使本底清除減慢，從而影響成像，抗體片段優于完整抗體已被許多學者所證實［6］。我們實驗結果亦表明F(ab′)2比完整抗體有如下優點：F(ab′)2進入腫瘤速度快，生物學分布特異性提高，定位指數上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明顯縮短，從而使成像時間提前，成像清晰。

隨著影像技術的發展，使原發性肝癌的診斷及定位變得較為容易，因此，單抗在肝癌的應用主要在于放射免疫治療，由于F(ab′)2的以上特點，使抗體片段在腫瘤部位的攝取量低于完整抗體，且生物半衰期短，免疫活性低，從而用于肝癌導向治療不如完整抗體。如何解決這一矛盾將是以后進一步研究的目標。

在抗體片段的制備中有兩個基本要求，即盡可能高的消化產率及保留免疫活性。本實驗采用胃蛋白酶消化法，此法雖然產率較低，但方法簡便，免疫活性較高。F(ab′)2片段的免疫活性在標記的前后均低于全抗體，可能是消化過程中酶對其損傷所致，為保留抗體的免疫活性，應盡量縮短反應時間。

作者簡介：施樂華，男，40歲，肝膽外科學博士；

指導教師，吳孟超，男，中科院院士，博士生導師，主要研究肝癌的基礎研究與臨床治療

作者單位：施樂華楊家和崔貞福吳孟超(第二軍醫大學東方肝膽外科醫院，上海200433)

潘文舟孔令山(第二軍醫大學長海醫院，上海200433)

王明庫(黑龍江紅興隆管局中心醫院，黑龍江155811)

4參考文獻

1施樂華，吳孟超，陳漢etal.分泌抗人原發性肝癌單克隆抗體雜交瘤TIGTC的制備及專一性分析.第二軍醫大學學報，1996；17(4)：313

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3肖祥熊.實用放射免疫分析及其臨床意義.上海：上海同濟大學出版社，1985：5

4劉康達，魚達，包炎明etal.裸鼠人肝癌模型在肝癌導向研究中的應用.中華腫瘤雜志，1988；10(6)：414

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6GoldenbergDM.Currentstatnsofcancerimagingwithradiolabeledantibodies.JCancerRes,1987;113:203