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【摘要】目的建立骨炎寧顆粒質量標準。方法采用薄層色譜(TLC)法對處方中的大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等4種藥材進行定性鑒別;采用高效液相色譜(HPLC)法測定骨炎寧顆粒中綠原酸的含量。結果在TLC色譜中均能檢出大血藤、天花粉、皂角刺、地榆，骨炎寧顆粒中綠原酸與其它組分良好分離，綠原酸濃度線性范圍在0.0025～0.04μg（r=0.9999），樣品加樣回收率為99.60%，RSD=1.07%（n=6）。結論所建立的方法簡便可靠，重復性好，為骨炎寧顆粒的質量控制提供了依據。

【關鍵詞】骨炎寧顆粒綠原酸薄層色譜高效液相色譜

StudyontheQualityStandardforGuyanningGranules

LYi,CHENHuating,LUJinqing

1.DepartmentofPharmacy,UnionHospitalAffiliatedwithTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022China;

2.HubeiCollegeofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061China

Abstract：ObjectiveToestablishastandardforthequalitycontrolofGuyanningGranules.MethodsCaulissargentodoxae,Radixtrichosanthis,spinagleditsiaeandRadixsanguisorbaewereidentifiedbyTLC.WhileHPLCwasappliedforthedeterminationofchlorogenicacidinflosloniceraeinGuyanningGranules.ResultsThechromatogramsofcaulissargentodoxae,Radixtrichosanthis,spinagleditsiaeandRadixsanguisorbaewereobtainedthroughTLCpresentedthespotsofthesamecolorswiththoseinthecorrespondingplacesinthechromatogramsofthecontrolarticles.Therewasagoodlinearrelationshipwithinarangeof0.0025～0.04μgofPaeoniflorin,correlationcoefficientr=0.9999,theaveragerecoverywas99.60%（n=6）,RSD=1.07%,(n=6).ConclusionThismethodissimple,feasibleandreproducibleandprovidesamethodforqualitycontrolofGuyanningGranules.

Keywords：GuyanningGranules；Chlorogenicacid；TLC；HPLC

骨炎寧顆粒是華中科技大學協和醫(yī)院經多年研制的純中藥復方制劑，由金銀花、赤芍、天花粉、大血藤等多味中藥加工制成，具有解熱止痛、活血消腫的功效，用于治療急慢性化膿性骨髓炎、關節(jié)炎、膿腫疔痛，療效顯著。本研究建立了TLC對制劑中的大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等進行定性鑒別，并采用高效液相色譜法測定處方中金銀花的活性成分綠原酸含量的方法，對控制骨炎寧顆粒質量有重要意義。

1儀器與試藥

1.1儀器

DIONEX-P680高效液相色譜儀，AT-201電子分析天平（d=0.01mg，瑞士），UP5200H超聲波清洗機（熊貓集團南京電子計量有限公司）。

1.2試藥骨炎寧顆粒（華中科技大學協和醫(yī)院制劑室提供）；薄層層析硅膠板G型(青島海洋化工廠)；綠原酸對照品（批號110753-200413）、大血藤對照藥材（批號121353－200401）、瓜氨酸對照品（批號0875－9802）、皂角刺對照藥材（批號121210－200501）、沒食子酸對照品（批號11083－200302）均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。實驗所用中藥飲片均購自武漢國藥集團中藥飲片廠。

2方法與結果

2.1薄層色譜鑒別［1］

2.1.1大血藤取本品研細，取粉末1g，精密稱定，加甲醇50ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加2％氫氧化鈉溶液10ml使溶解，用鹽酸調節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提取3次，10ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。取陰性樣品研細，取粉末1g，精密稱定，加甲醇50ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加2％氫氧化鈉溶液10ml使溶解，用鹽酸調節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提取3次，10ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為陰性樣品溶液。取本品粗粉1g加甲醇50ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加2％氫氧化鈉溶液10ml使溶解，用鹽酸調節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提取3次，10ml/次,合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法［2］實驗，吸取上述3種溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷丙酮甲酸（8∶1∶0.8）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照藥材色譜在相應的位置上，顯相同的顏色的斑點，陰性對照樣品則無此斑點。見圖1。

2.1.2天花粉

取本品研細，取粉末1g，精密稱定，加稀乙醇20ml,超聲處理30min，濾過，濾液作為供試品溶液。取陰性樣品研細，取粉末1g，精密稱定，加稀乙醇20ml，超聲處理30min，濾過，濾液作為陰性樣品溶液。取本品粉末1g，精密稱定，加稀乙醇20ml，超聲處理30min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。取瓜氨酸對照品加稀乙醇使溶解，制成每毫升含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）實驗，吸取前3種溶液各2μl及對照品溶液1μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇無水乙醇冰醋酸水（7∶2∶2∶4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照樣品則無此斑點。見圖2。

2.1.3皂角刺取本品研細，取粉末1.2g，精密稱定，加正丁醇15ml，水浴加熱回流2h，濾過，濾液于水浴上濃縮至5ml，作為供試品溶液。取陰性樣品研細，取粉末1.2g，精密稱定，加正丁醇15ml，水浴加熱回流2h，濾過，濾液于水浴上濃縮至5ml，作為陰性樣品溶液。取皂角刺對照藥材2.5g，加入正丁醇50ml，置水浴上加熱回流2h，濾過，濾液于水浴上濃縮至5ml，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）實驗，分別吸取3種溶液10μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷醋酸乙酯甲酸（10∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1％硫酸乙醇溶液，在紫外燈（365nm）下檢視供試品色譜中，在與對照藥材色譜在相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照樣品則無此斑點。見圖3。

2.1.4地榆取本品研細，取粉末1g，精密稱定，加水20ml，超聲處理20min，放冷，離心，取上清液，用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，20ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。取陰性樣品研細，取粉末1g，精密稱定，加水20ml，超聲處理20min，放冷，離心，取上清液，用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，20ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為陰性樣品溶液。取本品粉末2g，加水20ml,煮沸30min，放冷，離心10min，取上清液，用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，15ml/次,合并乙醚溶液，揮干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為對照藥材溶液。取沒食子酸對照品加甲醇制成每毫升含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）實驗，吸取前3種溶液各3μl，對照品溶液4μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯（用水飽和）醋酸乙酯甲酸（6∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1％三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品則無此斑點。見圖4。

2.2綠原酸的含量測定

2.2.1色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈0.4%磷酸水溶液（9∶91）為流動相；檢測波長為327nm；進樣量10μl。理論塔板數按綠原酸計算應不低于5000。

2.2.2溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對照品（60℃減壓干燥至恒重）適量，加甲醇制成每毫升含2.5μg的溶液，即得。

供試樣品的制備：取本品研細，取約1.5g，精密稱定,置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，放置15min，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液制備：按處方比例和工藝,制成不含綠原酸藥材的陰性樣品，按以上“供試樣品的制備”項下同樣的方法制備陰性對照溶液。

2.2.3線性關系考察精密稱取經60℃減壓干燥至恒重的綠原酸對照品12.5mg，置50ml量瓶中，用50％甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1，2，4，8和16ml，分別置5個100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（相當于2.5，5，10，20，40μg/ml）。照高效液相色譜法［2］，精密量取10μl注入液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標，以進樣的對照品溶液濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為：y=5386.1377x+3.2912,r=0.9999。結果表明綠原酸進樣量在0.0025～0.04μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。見圖5～7。

2.2.4干擾實驗按照上述色譜條件，吸取對照品溶液，供試品溶液、陰性樣品溶液各10μl測定。在供試品色譜圖中，與對照品色譜峰相應的位置上有一相同保留時間的色譜峰，而陰性樣品溶液在此保留時間無干擾。

2.2.5精密度實驗

精密吸取對照品溶液10μl，重復進樣5次，測定對照品溶液峰面積，計算RSD=0.51%（n=5），提示精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實驗取同一批樣品，按上述方法配制供試品溶液，分別于0，3，9，12，24h注入液相色譜儀中測定，其峰面積基本保持不變，RSD=2.30%，穩(wěn)定性良好。

2.2.7重現性實驗取同一樣品5份，每份1.5g，精密稱定，照文前“供試樣品的制備”項下的方法制備，按上述色譜條件，測定樣品中綠原酸峰面積值并計算含量，RSD=1.29%（n=5）。表明本方法重現性良好。

2.2.8加樣回收率實驗取已知含量的本品粉末6份，每份0.75g，精密稱定，加入一定量的綠原酸對照品，按文前“供試樣品的制備”項下的方法制備，按上述色譜條件進行測定，計算回收率為99.60%，RSD=1.07%。結果見表1。表1綠原酸加樣回收率計算結果（略）

2.2.9含量測定

取5個批號的樣品，稱取約1.5g,每個批次取兩份，按含量測定方法分別制備對照品溶液和供試品溶液,精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，按上述色譜條件測定。結果見表2。表2樣品測定結果（略）

3討論

曾經試用過文獻［3］報道的甲醇-0.4%磷酸溶液(20∶80),甲醇11%冰醋酸溶液(10∶90)，乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)等流動相,均不能使樣品中綠原酸和其他干擾組分峰完全分離。經多次實驗,以乙腈、水組合成流動相,水中含0.4%的冰醋酸對樣品的分離較好。當兩者比例為9∶91時樣品中綠原酸不僅與其他干擾峰完全分離,而且保留時間適中(tR=11.40),峰形對稱且尖銳,故選擇為含量測定的流動相。

方法學研究結果表明,采用TLC法對處方中的大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等4種藥材進行定性鑒別;采用HPLC法對處方中金銀花的綠原酸進行了含量測定,結果準確,重復性好,能夠有效控制該產品的質量。

【參考文獻】

［1］廉延國.中成藥薄層色譜鑒別［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：161.

［2］國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2005：152，附錄ⅥB，Ⅴ.

［3］馬成俊，李桂生，任召言等.金銀花藥材對照指紋圖譜的建立及質量評價［J］.時珍國醫(yī)國藥,2006，17（2）：238.