導(dǎo)語：循環(huán)大鼠腦保護管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的觀察甲基強的松龍（MP）對深低溫停循環(huán)（DHCA）大鼠腦N甲基D天門冬氨酸受體R1（NMDAR1）表達(dá)的影響，探討MP對DHCA大鼠腦保護作用的機制。方法制作大鼠DHCA模型。雄性SD大鼠175只，隨機分為假手術(shù)組、DHCA模型組和MP處理組。觀察DHCA60min，再灌注2、6、12h及1、2、3、7d時NMDAR1蛋白表達(dá)的變化以及腦組織超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，DHCA模型組和MP處理組大鼠NMDAR1蛋白表達(dá)均升高，于1d到達(dá)高峰，后逐漸降低，于再灌注7d恢復(fù)至正常水平。MP處理組大鼠再灌注后2、6、12h，1、2d5個時間點NMDAR1表達(dá)明顯低于模型組（P<0.01）。腦組織超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)MP能抑制DHCA腦細(xì)胞凋亡。結(jié)論MP對DHCA大鼠腦組織具有保護作用，其作用機制之一可能是與抑制NMDAR1蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】深低溫停循環(huán);甲基強的松龍;N-甲基-D-天門冬氨酸受體R1;腦保護;蛋白表達(dá)

深低溫停循環(huán)（deephypothermiccirculatoryar-rest，DHCA）技術(shù)自上世紀(jì)50年代誕生以來，已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜和嚴(yán)重的先天性心臟病及大血管手術(shù)中，但其可能并發(fā)腦損傷的問題尚未得到較好解決，DH-CA術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病率高達(dá)4%～25%。DHCA手術(shù)后患者近期不同程度出現(xiàn)手足舞蹈癥、抽搐，遠(yuǎn)期出現(xiàn)認(rèn)知障礙，兒童出現(xiàn)智力發(fā)育障礙等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥［1］。DHCA后腦組織缺血缺氧導(dǎo)致突觸前興奮性氨基酸（EAA）大量釋放和再攝取減少，從而激活突觸后N甲基D天門冬氨酸（NMDA）和α氨基3羥基5甲基4異戊丙酸（AMPA）受體，引起大量K+外流和Na+、Ca2+內(nèi)流，造成滲透分解和Ca2+相關(guān)性損害。本實驗通過觀察甲基強的松龍（MP）對DHCA大鼠腦NMDA受體1（NMDAR1）蛋白表達(dá)的影響，以探討其腦保護機制。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

早產(chǎn)兒培育箱、自制大鼠冰窩、水合氯醛（南京市兒童醫(yī)院提供）、MP（美國輝瑞制藥公司）、NMDA受體R1（SantaCruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫組化檢測試劑盒SA1022（武漢博士德公司）、DAB顯色劑（武漢博士德公司）、多聚賴氨酸（美國Sigma公司）、熒光倒置顯微鏡（德國蔡司）、801圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)）。

1.2動物

成年健康雄性普通級SD大鼠（南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）175只，體重250～300g，隨機分為3組，A組（假手術(shù)組）15只;B組（DHCA模型組）和C組（MP處理組）各80只，每組再分為DHCA后2、6、12h，1、2、3、7d共7個小組，每小組10只，其中DHCA后6h、1d兩個組為15只。術(shù)前6h禁食禁水。A組僅暴露雙側(cè)頸總動脈，不降溫不阻斷;B組深低溫停循環(huán)60min;C組于深低溫停循環(huán)前30min腹腔注射MP，劑量為30mg·kg-1。

1.3大鼠DHCA模型建立

術(shù)前30min肌肉注射阿托品0.02mg·kg-1，5%水合氯醛6ml·kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰臥固定于實驗臺上。溫度計插入肛門3cm，用膠帶將其與鼠尾相固定，監(jiān)測肛溫。頸部正中切口，分別游離兩側(cè)頸總動脈及左、右頸外動脈，并雙重過線。游離一側(cè)股動脈，動脈置管，取動脈血作血氣分析后，用肝素充滿連接管后接壓力換能器，多功能監(jiān)護儀監(jiān)測血壓、心電變化及外周血氧飽和度。最后將大鼠放入特制的冰窩，物理降溫，每隔5min記錄體溫、心率、血壓以及血氧飽和度，調(diào)整降溫速度。當(dāng)肛溫降至21℃時，將大鼠取出，取動脈血做血氣分析后，經(jīng)左股動脈進(jìn)行肝素化（肝素鈉300IU·kg-1）。隨后用24G靜脈留置針順行穿刺左頸外靜脈，扎線固定后與三通相連。接著阻斷兩側(cè)頸總動脈，最后用24G靜脈留置針逆行穿刺頸外動脈，扎線固定留置針，與左側(cè)頸外靜脈的靜脈留置針相連，開始轉(zhuǎn)流。轉(zhuǎn)流后，將體溫維持在（21±1）℃之間，并記錄體溫、心率、血壓以及血氧飽和度。停循環(huán)60min后，拔出頸外動脈處留置針并結(jié)扎，回收其管道內(nèi)血液，經(jīng)左側(cè)頸外靜脈輸入，再退出其管內(nèi)留置針并結(jié)扎。最后松開兩側(cè)頸總動脈處動脈夾，恢復(fù)頸總動脈血流，檢查穿刺處無出血后，逐層縫閉切口。然后將大鼠放入35℃早產(chǎn)兒培育箱復(fù)溫，恢復(fù)正常體溫4h后放置室溫下正常飼養(yǎng)。

1.4免疫組化方法

檢測NMDAR1蛋白表達(dá)各組取10只大鼠于DHCA后相應(yīng)時間點，用含4%多聚甲醛的0.1mol·L-1磷酸緩沖液經(jīng)心臟升主動脈灌流固定，斷頭置于冰盒玻璃板上取出全腦，放入同樣固定液中再固定約24h，常規(guī)脫水石蠟包埋切片，厚度4μm，取4張連續(xù)切片，操作步驟按SABC試劑盒操作說明進(jìn)行，陰性對照以PBS代替一抗。應(yīng)用捷達(dá)801分析軟件測定陽性細(xì)胞的灰度值，每張切片隨機選擇4個高倍視野（×400）觀察并取其平均值，以灰度值來表示NMDAR1的表達(dá)水平，灰度值越高，免疫組化染色越淺，NMDAR1表達(dá)越低。

1.5腦組織超微結(jié)構(gòu)觀察

于DHCA再灌注后6h和1d，各組取5只大鼠處死，每只大鼠于海馬區(qū)取1mm×1mm×1mm的小塊組織，于2.5%戊二醛固定后，經(jīng)0.1mol·L-1的磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸固定，丙酮脫水，純樹脂浸透包埋，固化后切片。切片厚度為50～60nm，醋酸鈾與枸緣酸鉛染色，透射電鏡下觀察神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以x-±s表示，用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析并以LSD法比較兩兩差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫組化表達(dá)

見表1。DHCA模型組和MP處理組大鼠腦NMDAR1蛋白從再灌注2h起開始升高，于24h到達(dá)高峰（P<0.01），后逐漸下降，于7d后基本恢復(fù)正常水平。同時在2、6、12h，1、2d5個時間點，MP組大鼠腦NMDAR1蛋白表達(dá)明顯低于DHCA模型組（P<0.01）。表1各組大鼠各時間點腦NMDAR1蛋白表達(dá)（略）

2.2腦組織電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

DHCA模型組和MP處理組大鼠腦組織在DH-CA后6h腦組織超微結(jié)構(gòu)未見明顯區(qū)別，基本正常;DHCA后1d模型組出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡（圖1），MP處理組未見明顯異常（圖2）。

3討論

NMDAR是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一類重要的EAA受體，廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。NMDA受體由NR1、NR2、NR3A三部分組成。對NMDA受體來說NR1是不變的［2］，它是NMDAR藥理學(xué)和電生理學(xué)特性的基礎(chǔ)，而NR2A、B、C、D亞型單獨存在時并不表現(xiàn)受體活性，只是在與NMDAR1結(jié)合后決定離子通道開放的時間，并調(diào)節(jié)受體興奮劑及拮抗劑的作用。因此，DHCA再灌注后腦NMDAR1表達(dá)的變化即可反映NMDAR在DHCA再灌注后的變化。DHCA對大腦的損傷機制有許多假說，其中Kris-tian等［3］認(rèn)為EAA在DHCA腦損傷中起主要作用，DHCA期間，腦組織缺血缺氧導(dǎo)致突觸前EAA大量釋放和再攝取減少，從而激活突觸后NMDA和AM-PA受體，使位于離子通道內(nèi)起阻斷作用的鎂離子釋放，NMDA受體介導(dǎo)的鈣通道及電壓敏感的鈣通道開放。一方面使Ca2+、Na+、水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，K+大量流出細(xì)胞膜，引起水鈉潴留導(dǎo)致神經(jīng)元急性腫脹壞死;另一方面鈣離子大量內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，鈣離子激活一系列與細(xì)胞毒性有關(guān)的酶，如蛋白激酶C、磷脂酶等，經(jīng)過這些酶的共同作用，最終引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞膜降解、細(xì)胞骨架解體、DNA斷裂，直至細(xì)胞死亡。MP腦保護作用機制復(fù)雜，包括抗炎、阻斷氧自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化、維持組織血流量和有氧能量代謝等。Langley等［4］研究發(fā)現(xiàn)MP處理組DHCA后大腦氧代謝率、腦血流量明顯高于對照組，表明DHCA前MP預(yù)處理能有效地保護腦組織。Baumgartner等［5］通過以狗為模型DHCA2h后，發(fā)現(xiàn)谷氨酸等興奮性氨基酸大量釋放引起較嚴(yán)重的腦損害。較多研究表明，MP對DHCA大腦具有保護作用，但并沒有探討其保護機制［4，6］。大量研究表明，具有神經(jīng)保護作用的干預(yù)方法不僅可以減輕腦缺血再灌注病理損傷過程，同時可使NMDAR的表達(dá)下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，DHCA模型組大鼠腦NMDAR1蛋白表達(dá)從再灌注2h起開始升高，于24h到達(dá)高峰，其機制可能是DHCA后腦釋放大量谷氨酸作用于突觸后膜NMDAR1的谷氨酸結(jié)合位點，使神經(jīng)細(xì)胞處于興奮狀態(tài)，NMDA受體轉(zhuǎn)錄和翻譯活性增大，對表達(dá)起上調(diào)作用。另外在DHCA再灌注后期NMDAR1表達(dá)明顯降低，其機制可能與早期細(xì)胞壞死和凋亡、細(xì)胞功能被抑制、健存細(xì)胞大量減少以及NMDAR基因轉(zhuǎn)錄和翻譯功能下降等因素有關(guān);也可能與受體內(nèi)化有關(guān)。大鼠DHCA后腦組織因缺血釋放大量谷氨酸，致NMDAR1過度激活，使大量NMDAR1發(fā)生內(nèi)化，其結(jié)果不僅增加了NMDAR1自身的代謝過程，減少胞膜表面NMDAR1的密度，同時還可能發(fā)揮某種信號作用（包括下調(diào)NMDARmR-NA的轉(zhuǎn)錄）［7］。

另外，在DHCA后2、6、12h，1、2d5個時間點，MP處理組大鼠腦NMDAR1蛋白表達(dá)明顯低于DHCA模型組，說明MP能明顯抑制DHCA后腦NMDAR1蛋白的表達(dá)，減少NMDA受體介導(dǎo)的鈣通道開放，從而起到腦保護作用。從組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，DHCA模型組和MP處理組大鼠在DHCA后6h腦組織超微結(jié)構(gòu)未見明顯區(qū)別，屬基本正常;DHCA后24h模型組大鼠腦組織出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，MP處理組未見異常，說明MP能明顯抑制DHCA后腦細(xì)胞凋亡，起到腦保護作用。基于已有的實驗結(jié)果推測，MP對DHCA的腦保護作用機制可能是通過多途徑實現(xiàn)的，并不能僅用單純抑制NMDAR1蛋白表達(dá)解釋，或許還與其他非NMDA受體有關(guān)系。另外本研究結(jié)果僅僅提示MP可能是通過調(diào)控EAANMDAR1Ca2+通路而產(chǎn)生腦保護作用，但是其對NMDAR1的抑制作用是直接作用于NMDAR1還是通過其他途徑間接影響NMDAR1，這些問題還有待于更進(jìn)一步的研究。

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