導(dǎo)語：人源狂犬病毒建立管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的用ELISA法對人源抗狂犬病毒抗體血漿進行篩查。方法采用國內(nèi)幾家狂犬病毒IgG抗體診斷試劑盒（ELISA法），結(jié)合小鼠中和試驗測定法，對經(jīng)0、3、7、14、28日程序免疫的供漿員之血樣進行抗狂犬病毒抗體效價檢測。結(jié)果與小鼠腦內(nèi)中和法比較，使用不同廠家ELISA試劑盒，檢測結(jié)果存在一定差異，其中C、D廠家試劑盒檢測結(jié)果比較接近，線性關(guān)系較好（分別為：r＝0.997；r＝0.996），可以替代小鼠腦內(nèi)中和法作為采漿站血漿初篩的方法。結(jié)論經(jīng)過反復(fù)篩選與比較，為大規(guī)模篩查抗狂犬病毒特免血漿提供了技術(shù)條件。

【關(guān)鍵詞】抗狂犬病毒抗體；狂犬病疫苗；ELISA；檢測；中和試驗

Establishmentofmethodtoscreeninghumananti-rabiesviruspositiveplasma

【Abstract】ObjectiveThepositivehumanplasmacontainingantibodyagainstrabiesviruswasscreenedwithELISAkit.MethodsTheIgGantibodydiagnostickits(ELISAmethod)obtainingfromseveralmanufacturesinourcountrywereadoptedtoscreentheantirabiesviruspositiveplasmacombiningwiththemiceneutralizationtest.Thelevelofantibodyagainstrabiesviruswasdeterminedinbloodsamplesofdonorsthatwereimmunizedwithrabiesvaccineondays0,3,7,14and28inschedule.ResultsItshowedthattestresultsofELISAkitproducedinmanufactureCandDissimilar,theirlinearcorrelationisbetter(rc=0.997,ra=0.996respectively).ConclusionThemiceneutralizationtestcanbereplacedbyELISAkitmethods.

【Keywords】antibodyagainstrabiesvirus；rabiesvaccine；ELISA；neutralizationtest；screening

狂犬病是一種嚴(yán)重危害人類生命的人畜共患疾病，主要通過帶狂犬病毒的動物傳播給人類，發(fā)病后致死率為100％。據(jù)衛(wèi)生部2005年10月公布的數(shù)字表明，病死率仍居我國法定傳染病的第2位，據(jù)調(diào)查，近年來狂犬病發(fā)病呈上升趨勢，目前尚無治療狂犬病的有效藥物。雖然狂犬病抗血清對預(yù)防狂犬病起著重要作用，但其來源因系異源性蛋白而副反應(yīng)較大，使用中易發(fā)生變態(tài)反應(yīng)和血清病，其發(fā)生率為15％～45％［1］，而且對某些疫苗的抗體反應(yīng)有抑制作用［2］，使用人源狂犬病免疫球蛋白（HRIG）則克服了上述缺點，與異源抗體相比，具有在血液中維持時間較長、保護效果好的優(yōu)點，這使得HRIG的需求量越來越大［3］，為此，我們于2003年末開始進行人源抗狂犬病抗體血漿的篩查工作，目的是早日開發(fā)出安全有效的HRIG制品。但由于方法學(xué)的限制，《中華人民共和國藥典2005年版三部（附錄ⅪJ）》規(guī)定的小鼠效力中和試驗（NIH）［4］方法難于做大規(guī)模的檢測。為尋找適合的方法，筆者曾建立了間接ELISA法測定狂犬病毒抗體的方法，并進一步證實了該方法與小鼠中和法有良好的相關(guān)性，但現(xiàn)有ELISA法在實際應(yīng)用中有靈敏度不高、且存在漏檢的問題。為解決上述問題，筆者結(jié)合小鼠中和法對國內(nèi)4個ELISA廠家的狂犬病毒抗體ELISA診斷試劑盒進行篩選和比較，獲得了較滿意的結(jié)果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1狂犬病毒抗原

狂犬病毒北京固定毒AG株適應(yīng)地鼠腎細(xì)胞傳代培養(yǎng)的病毒懸液經(jīng)滅活初步純化后的疫苗原液，由蘭州生物制品研究所疫苗四室提供。

1.1.2ELISA檢測試劑

ELISA定量檢測人抗狂犬病抗體診斷試劑（批號分別為：20040703、20050301、20050302、20050801）分別由蘭州生物制品研究所、寧波天潤生物藥業(yè)有限公司、武漢生物制品研究所、珠海海泰生物制藥有限公司提供），抗狂犬病參考血清由中國藥品生物制品檢定所惠贈。

1.1.3人用狂犬病疫苗和工作對照品

人用濃縮狂犬病疫苗（≥2.5IU/瓶），批號20040401、20040403、20041101。工作對照品（HRIG）批號9008。以上制品均由蘭州生物制品研究所生產(chǎn)。

1.1.4實驗樣本

狂犬病毒抗體陽性血漿20份（SNT效價≥10IU/ml），陰性血漿100份，均由蘭州生物制品研究所血液制劑室提供。

1.2方法

首先對供漿者進行0、3、7、14、28日程序狂犬疫苗注射，于最后一針1個月后采集血樣，用ELISA試劑盒檢測其相對效價，將此血樣與標(biāo)準(zhǔn)品進行系列稀釋，分別與狂犬病毒懸液結(jié)合，小鼠腦內(nèi)注射，在規(guī)定的時間內(nèi)，觀察小鼠存活和死亡情況，測定出供試品效價，之后再用小鼠中和法試驗SNT效價進行比較。將中和法測得SNT效價結(jié)果≥10IU/ml的樣品，再用其他三家ELISA［4］試劑盒進行檢測。最終篩選出與小鼠中和法試驗結(jié)果相接近的試劑盒作為大規(guī)模篩查狂犬病抗體陽性血漿初篩試劑盒，設(shè)計出能滿足單采漿站特異性免疫血漿篩選的需要和可靠的收漿方案。

2結(jié)果

2.1初免后兩種檢測方法的比較

按0、3、7、14、28日程序免疫后1個月采集的血樣用兩種方法檢測的結(jié)果比較，見表1。表1初免后兩種檢測方法的比較（略）注：蘭生所試劑（批號為20040703）

從表1可以看出，小鼠中和法與A廠家ELISA試劑盒檢測結(jié)果存在很大差異，從而導(dǎo)致了大量的特免血漿漏檢。

2.2不同廠家ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較

經(jīng)小鼠中和法測得SNT效價（≥10IU/ml）樣品與其他三個生產(chǎn)廠家試劑盒檢測結(jié)果比較，見表2。表2不同廠家ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較(略)注：樣品1～7號為同一供漿者不同次血漿樣，8～9號為同一供漿者。不同次血漿樣中，小鼠中的樣品作過一次。海泰批號為200801

從表2可以看出，采用B、C、D廠家ELISA試劑盒經(jīng)中和法測得SNA≥10IU/ml的9份血樣進行檢測，結(jié)果顯示，B、D廠家ELISA試劑盒檢測結(jié)果與中和法SNT值接近。

2.3不同ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線對比

以9008批HRIG為工作參考品，用不同ELISA試劑盒測得的線性關(guān)系比較，見表3。表3不同ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線對比（略）注：工作參考品為98008HRIG凍干品經(jīng)小鼠中和法測得效價為60IU/ml

從表3可以看出，以HRIG（批號：98008）為工作參考品的檢測結(jié)果可以看出，B、DELISA生產(chǎn)廠家的試劑盒線性關(guān)系較好（分別為：r＝0.997，r＝0.996），可以作為初篩狂犬免疫血漿的首選試劑。

3討論

ELISA檢測方法與小鼠中和法的比較：早在20世紀(jì)末國內(nèi)就有人［4］將ELISA與小鼠中和試驗進行了比較，兩者已經(jīng)有了很好的一致性。蘇軍英等［5］在vero細(xì)胞狂犬病疫苗免疫人的效果觀察中，用ELISA與MNT、RFFIT三種方法進行比較，也有相似的結(jié)果［6，7］。在實驗中測定的結(jié)果也證實上述兩種方法具有良好的正相關(guān)性。同時通過在ELISA實驗中同步設(shè)立了已知的SNT效價的陽性對照作為工作參考標(biāo)準(zhǔn)，最大限度地減少其他因素對實驗結(jié)果的影響。針對大規(guī)模人源性狂犬病毒特異性免疫血漿的采集工作的需要，實驗中根據(jù)稀釋陽性對照標(biāo)準(zhǔn)的ELISA測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為參照，建立了有效的收漿方案［8］，從而克服了小鼠中和法諸如檢測周期長、實驗條件復(fù)雜、費用高、其檢測樣品受到限制等不利于采漿站大規(guī)模初篩特異性免疫血漿的要求。為加快HRIG制品的研制、開發(fā)提供了技術(shù)條件。

【參考文獻】

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5蘇軍英，陶小潤，孫承梅.人用狂犬病毒免疫抗體檢測方法的比較.中國生物制品學(xué)雜志，1999,12（4）：236-237.

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8周志軍，尹斌，朱華松，等.ELISA抗體檢測試劑盒在狂犬病毒特免血漿篩選中的初步應(yīng)用.微生物學(xué)免疫學(xué)進展，2005,33（2）：45-48.