導(dǎo)語：瘢痕成纖維細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白表達論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

目的觀察鈣網(wǎng)蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)的表達情況。方法采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和原位ELISA技術(shù)對體外培養(yǎng)的瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞進行CRT分布定位及表達水平探究。結(jié)果瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞在處于增殖生長狀態(tài)時，胞漿及核內(nèi)均有不同程度的CRT表達，其中瘢痕成纖維細(xì)胞表達CRT水平(A摘要:1.97±0.15,ELISA492nm)明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞水平(A摘要:1.43±0.12),差異有非常顯著意義(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)則均無CRT表達。結(jié)論瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)CRT的豐富表達對促進細(xì)胞遷移、信號傳遞及鈣存儲等方面均有著積極功能。

Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts

【AbstractObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistributionofcalreticulin(CRT)inhypertrophicscar-derivedfibroblasts(HSF)andnormalskin-derivedfibroblasts(NSF).MethodsUsinganti-CRTantibody,CRTwasdetectedinHSFandNSFbyimmunocytochemistryandELISAtechnique.ResultsCRTwaspresentinthecytoplasmandnucleiinproliferatingHSForNSFinculture,butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRTthanNSF(P＜0.01).Whenthesecells(HSFandNSF)werefused,neitherintracellularnorintranuclearstainingforCRTwasobserved.ConclusionInHSFandNSF,thedistributionofCRTiswidespread.BecauseofitsabundantexpressioninHSF,wepostulatethatCRTasamultifunctionalproteinplaysanimportantroleinCa2+sequestering,integrin-mediatedsignallingandcelladhesion.

【KeywordsHypertrophicscarFibroblastCalreticulinExpression

增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS)作為創(chuàng)傷及外科手術(shù)后常見且十分棘手的皮膚組織疾病，瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞異常活化和細(xì)胞外間質(zhì)過度沉積既是HS的重要組織學(xué)特征，也是HS發(fā)生、發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)最早是作為一種存在于非肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的主要鈣結(jié)合蛋白得以熟悉的［1］，近幾年的探究發(fā)現(xiàn)摘要：除具有鈣離子儲藏功能外，CRT在參和并調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞生物學(xué)活性功能上有著積極影響［2-5］，同時它還作為自身抗原在某些免疫性疾病的發(fā)病機制中有著極其重要的價值［6］。我們通過CRT抗體并利用原位ELISA及免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測瘢痕成纖維細(xì)胞體外表達CRT水平，輔以正常皮膚成纖維細(xì)胞作對照，探索CRT在瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)揮異常生物學(xué)活性功能中的功能。

1材料和方法

1.1組織標(biāo)本

增生性瘢痕及正常皮膚組織標(biāo)本均取自住院病人，年齡17～40歲。患者在取標(biāo)本前無長時間外用各種防治增生性瘢痕藥物史，不伴腫瘤及其他嚴(yán)重疾患；瘢痕組織生長時間均在6～9個月之間。

1.2主要試劑及物品預(yù)備

羊抗CRT抗體摘要：Michalak博士惠贈。辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。細(xì)胞培養(yǎng)基摘要：DMEM添加10%小牛血清(上海華美生物技術(shù)有限公司)。96孔塑料培養(yǎng)板及100mm培養(yǎng)皿(丹麥Nunc公司)。

1.3成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

手術(shù)切取增生性瘢痕及正常皮膚組織，去皮下脂肪，0.01%新潔爾滅浸洗10min，PBS洗3次，用組織剪將組織剪成細(xì)小碎塊并接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，加少量10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃5%CO2靜止培養(yǎng)，3天后補充少量培養(yǎng)劑，隔2天換液，見有細(xì)胞從組織塊爬出生長后天天換液，傳代。

1.4CRT免疫細(xì)胞化學(xué)染色

體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞去培養(yǎng)基后，PBS輕洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%雙氧水反應(yīng)5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗體37℃功能45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反應(yīng)1h，DAB顯色；顯微鏡下觀察顯色信號。

1.5CRT原位ELISA檢測［7］

選擇第5代培養(yǎng)細(xì)胞為實驗對象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)16h后，去培養(yǎng)劑，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%雙氧水反應(yīng)5min，PBS洗；和0.1%TritonX-1004℃功能3min后，進一步分別和5%小牛血清(37℃、20min)、抗CRT抗體(37℃、1h)、5%小牛血清PBS稀釋的HRP-兔抗羊IgG(37℃、1h)反應(yīng)；PBS清洗后加入OPD底物液100μl，功能30min后用50μl1mol/L硫酸中止反應(yīng)。ELISAreader上讀取492nm的P值。

2結(jié)果

2.1成纖維細(xì)胞初代培養(yǎng)結(jié)果

在體外相同培養(yǎng)條件下，細(xì)小的瘢痕及正常皮膚組織塊接種后2天見有部分貼壁，培養(yǎng)1周后有少量的成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，2周后細(xì)胞在組織塊四周呈暈狀分布，此后細(xì)胞開始向外旺盛擴散增殖。顯微鏡下觀察瘢痕及正常皮膚組織來源的成纖維細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均呈細(xì)小梭外形，二者未見明顯差異。

2.2成纖維細(xì)胞CRT表達的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

原代培養(yǎng)的瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞在未生長融合前，細(xì)胞內(nèi)均有不同程度的CRT陽性表達；一旦細(xì)胞生長融合后，在融合區(qū)內(nèi)的成纖維細(xì)胞中均未見有明顯的CRT陽性信號出現(xiàn)，但在融合區(qū)邊緣仍處于增殖、遷移擴散的瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)，則仍有CRT的陽性信號分布；就二種細(xì)胞內(nèi)CRT的表達信號強弱來看，瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的CRT陽性信號相對較強，而正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)CRT陽性信號相對較弱；另外，當(dāng)瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞以較高密度傳代培養(yǎng)時，細(xì)胞內(nèi)CRT表達在接種后16h較為明顯，而在培養(yǎng)24h細(xì)胞接近融合時信號較弱。

此外，CRT在瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)的表達區(qū)域無明顯差異，往往在細(xì)胞漿、核膜及核內(nèi)均有表達。

2.3成纖維細(xì)胞CRT表達的ELISA檢測結(jié)果

根據(jù)CRT免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，我們對第5代瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞(接種后培養(yǎng)16h)進行CRT表達的ELISA檢測，其中正常皮膚成纖維細(xì)胞組的CRT表達值為1.43±0.12(A)，瘢痕成纖維細(xì)胞組為1.97±0.15(A)，二組間差異有非常著性意義(P＜0.01)。

3討論

增生性瘢痕是傷口上皮化愈合后組織內(nèi)成纖維細(xì)胞異常活化即繼續(xù)旺盛增殖并分泌大量膠原、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細(xì)胞外間質(zhì)所造成的一種組織病理改變，有關(guān)瘢痕成纖維細(xì)胞為何異常活化一直是整形燒傷外科領(lǐng)域里重點探索的課題之一。轉(zhuǎn)化生長因子β1、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1和類胰島素生長因子-1等在增生性瘢痕組織內(nèi)的過度表達一直被認(rèn)為是引起成纖維細(xì)胞異常活化不可忽視的因素，但越來越多實驗探究表明瘢痕成纖維細(xì)胞自身生物學(xué)特性改變是觸發(fā)其功能異常的關(guān)鍵［8］。我們通過對細(xì)胞內(nèi)CRT的表達檢測，進一步發(fā)現(xiàn)CRT不但在瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，而且其表達量明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)水平。

CRT作為鈣離子主要結(jié)合蛋白，早期探究認(rèn)為CRT主要是通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子的儲存和釋放而影響細(xì)胞的一些生物學(xué)活性效應(yīng)，但近幾年的探究結(jié)果表明CRT除上述功能外，它在細(xì)胞遷移擴散及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達等方面均有直接的介導(dǎo)和調(diào)節(jié)功能。1997年，Zhu等人［9］通過對B16細(xì)胞CRT表達的深入探究發(fā)現(xiàn)實細(xì)胞內(nèi)的CRT分子經(jīng)常和整合素粘附分子的α鏈胞內(nèi)區(qū)結(jié)合并成為雙向傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號的復(fù)合體；Coppolino等人［5］利用CRT缺乏而整合素表達正常的胚胎干細(xì)胞進行細(xì)胞體外遷移粘附探究，證實在正常培養(yǎng)條件下干細(xì)胞的遷移擴散能力很弱，而經(jīng)轉(zhuǎn)染CRT基因后，細(xì)胞的遷移粘附功能顯著增強。因此，Coppolino認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)CRT和整合素粘附分子直接參和細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、粘附、遷移擴散等生物學(xué)活性功能。Tsai等［10］曾利用體外結(jié)締組織收縮模型發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕組織來源的成纖維細(xì)胞在體外有著比正常皮膚成纖維細(xì)胞更強的遷移擴散能力，并認(rèn)為其功能可能和細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白絲積聚有關(guān)。筆者在博士后探究工作階段卻發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下增生性瘢痕組織來源的成纖維細(xì)胞除有著較強遷移擴散能力外，還具有高表達β1、α1、α2、α3及α4整合素粘附分子的特性［11］，從而提示瘢痕成纖維細(xì)胞的強遷移擴散能力和高表達整合素粘附分子有關(guān)；而從本實驗對CRT在瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的表達情況來看，細(xì)胞內(nèi)其CRT表達并不屬持續(xù)性表達，CRT的高表達期一般是在細(xì)胞的遷移擴散階段，而當(dāng)細(xì)胞融合后細(xì)胞內(nèi)CRT表達甚少。但就和同一時期培養(yǎng)的正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的CRT表達則顯得更為豐富。因此，結(jié)合我們以往的探究工作結(jié)果，我們認(rèn)為摘要：瘢痕成纖維細(xì)胞異常的遷移擴散能力是細(xì)胞內(nèi)豐富的CRT、整合素粘附分子表達及肌動蛋白絲積聚共同功能的結(jié)果，其中積聚的肌動蛋白絲是其異常遷移擴散的重要動力來源，而有效表達的CRT及整合素粘附分子則是細(xì)胞和細(xì)胞外間質(zhì)之間遷移動力的傳遞媒介；另外，CRT的豐富表達對瘢痕成纖維細(xì)胞鈣離子的儲存、釋放及其信號傳導(dǎo)等也有著重要的意義。

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