導(dǎo)語：金釵石斛提取物抗白內(nèi)障研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】【目的】探討金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)總生物堿和粗多糖對(duì)白內(nèi)障的抑制作用。【方法】采用溶劑法分離提取金釵石斛總生物堿和粗多糖;體外培養(yǎng)大鼠晶狀體,加入H2O2與總生物堿(或粗多糖)共培養(yǎng)24h;分別在培養(yǎng)后6、12、18、24h共4個(gè)時(shí)段于解剖顯微鏡下觀察并記錄晶狀體混濁度的改變;檢測(cè)晶狀體水溶性蛋白、谷胱甘肽(GSH)的含量及總超氧化物歧化酶(TSOD)和丙二醛(MDA)的活性。【結(jié)果】金釵石斛總生物堿和粗多糖均能減輕晶狀體混濁度,并能顯著升高晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及TSOD活性,降低MDA的活性(均P<0.05),其中石斛總生物堿高劑量組效果最佳。【結(jié)論】金釵石斛總生物堿和粗多糖在體外均有一定的抗白內(nèi)障作用,其機(jī)制與拮抗晶狀體的氧化損傷有關(guān),而總生物堿的效果優(yōu)于粗多糖。

【關(guān)鍵詞】金釵石斛/藥理學(xué)金釵石斛/化學(xué)白內(nèi)障/中藥療法晶狀體/病理學(xué)器官培養(yǎng)

白內(nèi)障(cataract)是一種常見的致盲眼病,它是多種因素共同作用的結(jié)果,氧化損傷是其發(fā)病機(jī)制之一[1]。當(dāng)前許多中藥研究都是從提高晶狀體抗氧化能力入手,利用抗氧化劑或抗氧化酶激活劑來消除或中和晶狀體中的氧化產(chǎn)物,阻止或逆轉(zhuǎn)晶狀體變渾濁,從而抑制或延緩白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展[2]。石斛是一種名貴中藥材,抗白內(nèi)障是其主治功效之一。已有研究證實(shí),石斛水煎劑可通過改變晶狀體相關(guān)酶的活性而對(duì)D半乳糖性白內(nèi)障起到防治作用[3],石斛的乙酸乙酯提取物在體外還可抑制醛糖還原酶和過氧化脂質(zhì)(LPO)的產(chǎn)生[4],這些研究在一定程度上揭示了石斛抗白內(nèi)障的作用機(jī)理。然而,石斛化學(xué)成分復(fù)雜,其抗白內(nèi)障的具體有效成分是什么,至今仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)晶狀體,對(duì)金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)的粗提物總生物堿(totalalkaloids)和粗多糖(polysaccharides)抗白內(nèi)障作用進(jìn)行了探討,現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1動(dòng)物4~5周齡Wistar大鼠20只,體質(zhì)量80~120g,雌雄不限,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):粵臨證字2007A025。

1.2藥材和試劑金釵石斛由貴州赤水信天石斛有限公司提供,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李薇教授鑒定。DMEM低糖培養(yǎng)基(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司);體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫(H2O2,浙江臨安化工二廠);吡諾克辛鈉滴眼液(武漢天天明藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):070102);Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

試劑配制如下。改良碘化鉍鉀試劑:甲液:0.85g次硝酸鉍溶于10mL冰醋酸,加水40mL;乙液:8g碘化鉀溶于20mL水中;將甲液與乙液等量混合后,取1mL與2mL醋酸混合,供生物堿的顯色用。Molish試劑:甲液:α萘酚1g,加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇至10mL;乙液:濃硫酸;供多糖的檢測(cè)用。

1.3儀器E52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHZDIII型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);BS110S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);HI98128型pH計(jì)(北京HANNA);SWCJIF型超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);Galaxys型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)RSBiotech);STPT型解剖顯微鏡(日本OLYMPUS);5810R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf);7200型分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1.4金釵石斛總生物堿和粗多糖的分離提取及檢識(shí)金釵石斛總生物堿和粗多糖的提取方法參照文獻(xiàn)[5-6]并略加改進(jìn):干燥金釵石斛切碎打成粗粉,加入體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇85℃回流提取(4h/次×3次),合并提取液,減壓回收乙醇后得到石斛浸膏,加1moL/LHCL調(diào)節(jié)浸膏的pH為3,氯仿萃取3遍后,棄氯仿層,加濃氨水調(diào)母液pH=11,再經(jīng)氯仿萃取3遍,將氯仿層合并,減壓濃縮,揮干氯仿后即得到總生物堿。將醇提后的藥渣曬干后加入20倍體積的水,100℃回流提取(2.5h/次×4次),合并提取液,減壓濃縮至一定容積后,加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇,直至醇濃度為70%,置于冰箱內(nèi),隔夜取出沉淀用無水乙醇和丙酮各洗滌3遍,再經(jīng)Sevag法除蛋白處理,冷凍干燥,得到粗多糖。總生物堿的檢識(shí)參照文獻(xiàn)[7]:取少量分離所得的總生物堿于試管內(nèi),加入蒸餾水和10μL二甲基亞砜(DMSO)將其充分溶解,滴在硅膠板上,噴霧改良碘化鉍鉀試劑后,可見硅膠板上滴了提取物溶液的點(diǎn)顯現(xiàn)出非常明顯的桔紅色斑點(diǎn),由此證明提取物為生物堿。粗多糖的檢識(shí)參照文獻(xiàn)[7]:取多糖水溶液1mL加入Molish試劑3滴,搖勻,傾斜試管,沿試管壁緩慢滴加1mL濃硫酸,靜置,可見在試液與濃硫酸交界面產(chǎn)生非常明顯的紫色環(huán),證明提取物為多糖。

1.5藥物配制用PBS分別將總生物堿和粗多糖配制成濃度為50mg/mL的溶液(生物堿加10μLDMSO助溶),0.22μm微孔濾膜過濾滅菌處理后-20℃保存待用。

1.6晶狀體的培養(yǎng)及分組參照文獻(xiàn)[8]的方法并略加改進(jìn):頸椎脫臼處死大鼠,用眼科剪鑷迅速摘取雙眼眼球,以含800U/mL青霉素、800μg/mL鏈霉素的冷PBS液漂洗眼球后,投入含相同濃度雙抗液的PBS液中浸泡,轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)。約10min后將大鼠眼球轉(zhuǎn)移至含500U/mL青霉素、500μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,小心從眼球后極部剪開鞏膜,取出晶狀體,去除晶狀體表面的虹膜和玻璃體,晶狀體經(jīng)PBS液漂洗2遍后,再用DMEM液漂洗1遍,然后再放入已預(yù)熱的24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔含1mLDMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清、100μ/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素),預(yù)培養(yǎng)5h(37.0℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2)后,剔除受損傷或已混濁的晶狀體。將35只未受損傷、透明的晶狀體按照隨機(jī)原則分7個(gè)組培養(yǎng),每組5只:正常對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基+100μL胎牛血清),模型組(正常對(duì)照組培養(yǎng)基+2mmol/LH2O2),生物堿高、低劑量組(正常對(duì)照組培養(yǎng)基中各加入2mmol/L的H2O2,同時(shí)分別添加4、2mg/mL生物堿),多糖高、低劑量組(在正常組培養(yǎng)基中各加入2mmol/L的H2O2,同時(shí)分別添加4、2mg/mL粗多糖),陽(yáng)性對(duì)照組(正常對(duì)照組培養(yǎng)基+2mmoL/L的H2O2+100μL吡諾克辛鈉滴眼液)。上述各組培養(yǎng)基均含100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素。

1.7觀察并照相記錄晶狀體混濁度加藥培養(yǎng)后,每6h更換1次培養(yǎng)液以保持H2O2濃度不變。同時(shí)觀察并記錄各組晶狀體混濁度。離體培養(yǎng)晶狀體混濁度的分級(jí)方法參照文獻(xiàn)[9]:在黑色背景下設(shè)計(jì)1mm×1mm的黑色方格圖,將被檢晶狀體置于"+"字交叉的黑色線條之上,在解剖顯微鏡下觀察晶狀體,按透過晶狀體所能看到的線條清晰度進(jìn)行分級(jí)。"-"表示線條清晰可見,為完全透明;晶狀體"+"混濁:線條模糊,但輪廓尚可辨;"++"混濁:線條輪廓不清,僅中央部隱約可見;"+++"混濁:線條完全不見,晶狀體全部混濁。最后以各組晶狀體混濁度,即"+"出現(xiàn)量的多少進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。培養(yǎng)后24h,給各只晶狀體拍照。

1.8晶狀體水溶性蛋白GSH含量及SOD、MDA活性檢測(cè)晶狀體拍照后,用冷PBS液洗滌2遍,盡量洗凈培養(yǎng)液,再用濾紙吸干水分,稱質(zhì)量。按質(zhì)量與體積比為1∶10的量加入冷PBS液,在冰浴上充分勻漿后倒入2mL離心管中,4℃、12000r/min離心20min,取上清即為晶狀體水溶性蛋白,采用Bradford法檢測(cè)定蛋白含量。取剩余上清,分別采用二硫代二硝基苯甲酸法檢測(cè)GSH含量,采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定總超氧化物歧化酶(TSOD)活性,采用硫代巴比妥酸(thibabituricacid,TBA)法檢測(cè)MDA活性,以上操作方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1各組藥物對(duì)晶狀體混濁度的影響晶狀體分組培養(yǎng)后6h,模型組晶狀體均出現(xiàn)"+"度渾濁,其他各組均透明;繼續(xù)培養(yǎng)6h,可見正常對(duì)照組晶狀體均保持透明,模型組晶狀體為"++"~"+++"度混濁,其他各組晶狀體混濁度在"+"~"++"度不等;培養(yǎng)后24h,正常對(duì)照組晶狀體均保持透明,模型組晶狀體均為"+++"度混濁,肉眼觀為乳白色,且晶狀體體積明顯縮小,其他各組晶狀體混濁度表現(xiàn)為"+"~"+++"不等。各個(gè)藥物添加組中,陽(yáng)性對(duì)照組、生物堿高劑量組晶狀體混濁度較模型組顯著減輕(均P<0.05);生物堿高、低劑量組及粗多糖高、低劑量組晶狀體混濁度與陽(yáng)性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。將各組晶狀體混濁度與過氧化氫損傷的時(shí)間進(jìn)行相關(guān)性分析,其中生物堿高劑量組差異有顯著性意義(P<0.01),其他各組差異也均有顯著性意義(P<0.05),由此可見,隨H2O2作用時(shí)間的延長(zhǎng),晶狀體混濁度逐漸加重。結(jié)果見表1及圖1。

表1不同時(shí)段各組晶狀體混濁度量化比較(略)

Table1Comparisonofthelensopacityratioatdifferentstages

統(tǒng)計(jì)方法:t檢驗(yàn);①P<0.05,與正常對(duì)照組比較;②P<0.05,與模型組比較

a.正常對(duì)照組b.模型組c.陽(yáng)性對(duì)照組d.生物堿高劑量組e.生物堿低劑量組f.多糖高劑量組g.多糖低劑量組

圖1培養(yǎng)24h后各組晶狀體混濁度比較(×25)(略)

Figure1Thelensopacityindifferentgroupsafterculturingfor24h(×25)

2.2各組藥物對(duì)晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及MDA、TSOD活性的影響由表2可見,模型組與正常對(duì)照組比較,水溶性蛋白含量、GSH含量、TSOD活性均顯著降低,MDA活性顯著升高(均P<0.05),而陽(yáng)性對(duì)照組、生物堿組、粗多糖組可顯著升高水溶性蛋白、GSH含量以及TSOD活性,降低MDA活性,各給藥組與模型組比較,差異均有顯著性意義(P<0.05)。生物堿高劑量組水溶性蛋白含量顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05),GSH含量除多糖低劑量組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組外(P<0.05),其他各實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05);TSOD活性除生物堿低

表2各組晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及MDA、TSOD活性變化比較(略)

Table2Comparisonofthecontentsofwatersolubleprotein,GSH,andtheactivityofMDA,TSODindifferentgroups

統(tǒng)計(jì)方法:t檢驗(yàn);①P<0.05,與正常對(duì)照組比較;②P<0.05,與模型組比較;③P<0.05,與陽(yáng)性對(duì)照組比較劑量組和多糖低劑量組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組外(P<0.05),其他各組與陽(yáng)性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05);MDA活性除生物堿高劑量組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)外,其他各組與陽(yáng)性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

晶狀體的氧化損傷是目前常用的白內(nèi)障研究模型,而H2O2是很好的氧化損傷誘導(dǎo)劑。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能下降或氧化作用增強(qiáng)均可導(dǎo)致眼組織的損傷,誘發(fā)或促進(jìn)白內(nèi)障的形成[10-11]。而活性氧簇,如H2O2、超氧陰離子、單態(tài)氧、氫氧根等可以引起很多生物學(xué)變化,最終使晶狀體的水不溶性蛋白增加而形成白內(nèi)障[12]。GSH是一種抗氧化酶,在晶狀體中含量較高,對(duì)晶狀體起著多方面的重要作用[13]。SOD和MDA常常相互配合用以反映組織細(xì)胞氧化/抗氧化系統(tǒng)功能的平衡。此外,氧化損傷等因素致晶狀體蛋白質(zhì)分子構(gòu)型發(fā)生改變,造成可溶性蛋白質(zhì)含量的減少和不可溶性蛋白質(zhì)含量的增高[14],而不溶性蛋白質(zhì)聚集,即導(dǎo)致晶狀體光散射作用增加,即失去透明性。本研究采用體外構(gòu)建氧化損傷白內(nèi)障模型的方法,對(duì)金釵石斛總生物堿和粗多糖的抗白內(nèi)障作用進(jìn)行探討。結(jié)果顯示,模型組可溶性蛋白含量顯著低于正常對(duì)照組,而各用藥組可顯著緩解可溶性蛋白的減少,生物堿高劑量組尤其明顯;同時(shí),金釵石斛的提取物總生物堿和粗多糖均可提高晶狀體GSH含量及SOD活性,同時(shí)降低MDA活性,即通過提高晶狀體抗氧化能力而達(dá)到抑制白內(nèi)障的作用。

石斛具有抗白內(nèi)障的作用早已被證實(shí),但其抗白內(nèi)障的確切有效成分至今仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),金釵石斛的兩種藥效部位(總生物堿和粗多糖)在體外可通過減輕晶狀體的氧化損傷而抑制白內(nèi)障的進(jìn)程,且總生物堿的效果優(yōu)于粗多糖。然而,金釵石斛化學(xué)成分復(fù)雜,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,其總生物堿含量達(dá)0.4%~0.6%,種類有30多種,多糖含量也高達(dá)4%,并以各種不同的形式存在[15],因此,下一步研究可從這兩種粗提物入手,進(jìn)一步挖掘金釵石斛抗白內(nèi)障的確切有效成分,并闡明其抗氧化的具體反應(yīng)過程,這對(duì)于抗白內(nèi)障的藥物研究以及金釵石斛藥用價(jià)值的開發(fā)都有著重要的意義。

【參考文獻(xiàn)】

[1]DelcourtC,CristolJP,LugerCL,eta1.Associationofantioxidantenzymeswithcataractandagerelatedmaculardegeneration[J].Ophthalmology,1999,106(2):215.6

[2]黃秀榕,祁明信,林薇,等.天然抗氧化劑對(duì)抗晶狀體氧化損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)病理生理雜志,2001,17(2):120.

[3]楊濤,梁康,侯緯敏,等.四種中草藥對(duì)大鼠半乳糖性白內(nèi)障相關(guān)酶活性的影響[J].生物化學(xué)雜志,1991,7(6):731.

[4]楊濤,梁康,侯緯敏,等.四種中草藥成分對(duì)醛糖還原酶和脂類過氧化的抑制作用[J].生物化學(xué)雜志,1992,8(2):169.

[5]陳曉青,蔣新宇,劉佳佳.中草藥成分分離分析技術(shù)與方法[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:17.

[6]FemeniaA,SanchezeS,SimalS,positionalfeaturesofpolysaccharidesfromAloeVera(AloeBarbadensisMiller)planttissue[J].CarbohydratePolymers,1999,39:109.

[7]林啟壽.中草藥成分化學(xué)[M].北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1997:36.

[8]徐雯,姚克,王凱軍.Calpains在過氧化氫誘發(fā)大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡中的機(jī)制探討[J].眼科研究,2003,21(3):246.

[9]劉興強(qiáng).晶狀體上皮細(xì)胞凋亡與白內(nèi)障形成的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華實(shí)用醫(yī)學(xué),2001,3(21):1.

[10]YongRW.AgeRelatedCataract[M].NewYork:OxfordUniversityPress,1991:21.

[11]DownesJE,SwannPG,HolmesRS.Ultravioletlightinducedpathologyintheeye:associatedchangesinocularaldehydedehydrogenaseandalcoholdehydrogenaseactivities[J].Cornea,1993,12:241.

[12]CarperDA,SunJK,IwataT,eta1.Oxidativestressinducesdifferentialgeneexpressioninahumanlensepithelialcellline[J].InvestOphthalmolVisSci,2002,40:400.

[13]ReddyVN.Glutathioneanditsfunctioninthelens:AnOverview[J].ExpEyeRes,1990,50:771.

[14]DevamanoharanPS,AliAH,VarmaSD.Preventionoflensproteinglycationbytaurine[J].MolCellBiochem,1997,177(2):245.

[15]陳曉梅,肖盛元,郭順星.鐵皮石斛與金釵石斛化學(xué)成分的比較[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2006,28(4):524.