導(dǎo)語：藥物設(shè)計學(xué)課程教學(xué)案例設(shè)計研究一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

[摘要]在藥學(xué)本科生的藥物設(shè)計學(xué)課程中，以細(xì)菌RNA聚合酶抑制劑的虛擬篩選為例，利用AutoDockvina軟件對小分子化合物庫進(jìn)行分子對接虛擬篩選，用PyMOL和LigPlot軟件進(jìn)行結(jié)果分析。該教學(xué)案例的設(shè)計可以幫助學(xué)生理解基于分子對接的藥物虛擬篩選方法，認(rèn)識小分子抑制劑與靶蛋白的作用機(jī)制，幫助學(xué)生更好理解藥物分子設(shè)計，有效調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，達(dá)到了提高教學(xué)質(zhì)量的目的。

[關(guān)鍵詞]教學(xué)改革；分子對接；AutoDockvina軟件；虛擬篩選；藥物化學(xué)

藥物設(shè)計是藥物化學(xué)的重要研究內(nèi)容，藥物設(shè)計主要基于經(jīng)典的藥物化學(xué)原理、生物大分子的結(jié)構(gòu)信息和已知化合物的結(jié)構(gòu)信息，構(gòu)建具有藥理活性的小分子化合物，旨在提供候選藥物，為創(chuàng)新藥物的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。藥物設(shè)計學(xué)課程的目標(biāo)是讓藥學(xué)本科生掌握藥物分子設(shè)計的基本原理、研究內(nèi)容和研究方法，建立藥物分子設(shè)計的思路和理念[1]。分子對接(MolecularDocking)是兩個或多個分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識別的過程[2-3]。分子對接在藥物分子設(shè)計中具有十分重要的意義。分子對接也是藥物虛擬篩選的一種常用方法，通過分子對接可以從化合物庫中篩選出潛在的活性先導(dǎo)化合物，也可以揭示藥物小分子和生物靶點之間的相互作用方式，預(yù)測化合物的親和力及活性，也可以用于先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化等[4]。目前，多重耐藥菌以及耐藥菌感染引發(fā)的死亡等問題已成為全球關(guān)注的醫(yī)學(xué)與社會問題，嚴(yán)重地威脅著感染性疾病的治療，為此迫切需要能夠抵抗多重耐藥菌的具有新結(jié)構(gòu)與新作用機(jī)制的抗菌藥物[5-6]。而細(xì)菌RNA聚合酶已成為最熱門的一類抗菌藥物靶標(biāo)，開發(fā)其相應(yīng)的抑制劑克服已有抗生素的耐藥性具有重要的意義[7]。分子對接作為藥物設(shè)計學(xué)課程中主要內(nèi)容，既是學(xué)習(xí)的重點也是難點。筆者根據(jù)多年從事新型抗菌藥物的研究經(jīng)歷，結(jié)合科研工作實踐，在桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)專業(yè)的藥物設(shè)計學(xué)課程的教學(xué)案例中，以“虛擬篩選細(xì)菌RNA聚合酶抑制劑”作為教學(xué)切入點，以AutoDockvina、PyMOL和LigPlot等藥物設(shè)計軟件來進(jìn)行虛擬篩選，通過自建的小型化合物庫，虛擬篩選細(xì)菌RNA聚合酶抑制劑。本案例的設(shè)計目的是讓學(xué)生熟悉如何從數(shù)據(jù)庫選擇合適的靶點作為研究對象，化合物庫的構(gòu)建，蛋白及小分子的預(yù)處理，以及AutoDockvina的對接流程，PyMOL和LigPlot的作圖方法等，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，了解和熟練掌握通過虛擬篩選的手段從化合物庫中發(fā)現(xiàn)新型活性先導(dǎo)化合物的方法。

1教學(xué)案例的設(shè)計

1.1軟件介紹

AutoDock是由美國Scripps研究所的OIson小組開發(fā)的分子對接軟件包[8-9]。AutoDock程序目前最新的版本為4.2.6。AutoDockvina是一個開源的分子對接程序[10]，最初由OlegTrott博士在Scripps研究所的分子圖形實驗室設(shè)計和開發(fā)的。AutoDockvina與AutoDock相比，前者大大提高了準(zhǔn)確性，而且AutoDockvina可以利用系統(tǒng)上的多個CPU或CPU內(nèi)核來顯著縮短運(yùn)行時間。AutoDockvina是目前最為廣泛使用的虛擬篩選軟件之一。PyMOL是一款經(jīng)典的三維分子結(jié)構(gòu)顯示軟件[11-12]。PyMOL已廣泛應(yīng)用于正式發(fā)表的科學(xué)研究文獻(xiàn)中的三維分子結(jié)構(gòu)顯示。本教學(xué)案例使用的PyMOL版本為1.7.4。LigPlot是一款針對學(xué)術(shù)用戶的軟件[13]，是免費、開源二維的結(jié)構(gòu)顯示軟件，可自動生成二維配體-蛋白質(zhì)相互作用圖，最新版本是LigPlot+v2.2，能夠鏈接到PyMOL軟件。1.2AutoDock分子對接方法的建立1.2.1小分子化合物庫的建立在本次教學(xué)案例中，首先安排學(xué)生在課前進(jìn)行化合物庫的建立。從文獻(xiàn)中收集具有抗菌活性的中藥單體化合物，先使用ChemDraw軟件繪制出單體化合物的結(jié)構(gòu)，再用Caculations-MM2-MinimizeEnergy模塊對小分子化合物進(jìn)行能量優(yōu)化，并保存成mol2格式。用raccoon軟件將mol2格式批量轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，創(chuàng)建一個包含5個化合物(化合物1-5)的小型數(shù)據(jù)庫。1.2.2蛋白的預(yù)處理從PDB數(shù)據(jù)庫獲取細(xì)菌RNA聚合酶三維結(jié)構(gòu)(PDBID：3DXJ)。利用PyMOL1.7.4軟件，保留蛋白的C和D鏈，除去其他鏈，除去水分子(保留D鏈的H2O1539)，除去金屬離子，將處理好的蛋白保存為3dxjp.pdb。在AutoDock4.2軟件中，將3dxjp.pdb添加氫原子，計算電荷，設(shè)置原子類型為AssignAD4type，并保存為3dxjp.pdbqt格式。1.2.3配體小分子的預(yù)處理利用PyMOL軟件，從蛋白晶體復(fù)合物中提取出共晶配體NE6，并保存為NE6.pdb格式。將NE6.pdb在Chem3DPro14.0中使用MM2力場進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化，保存為pdb格式。在AutoDockTools中的Ligand模塊打開此配體，在Ligand模塊中選擇ChooseTorsions彈出的TorsionCount對話框，并保存為NE6.pdbqt文件。1.2.4設(shè)置Grid參數(shù)打開3dxjp.pdbqt和NE6.pdbqt，設(shè)置Grid參數(shù)，以蛋白的活性位點(centerx=-11.5，centery=58.49，centerz=4.587)為中心；設(shè)置x=50，y=50，z=50，xyz分別表示在各方向上的格點的數(shù)量；Spacing設(shè)置為0.375?，設(shè)置完成后保存為grid.gpf文件。1.2.5設(shè)置Docking參數(shù)在AutoDockTools中的Docking模塊打開保存好的兩個pdbqt文件，SearchParameters選擇遺傳算法(GeneticAlgorithm)，NumberofGARuns設(shè)置為10，MaximumNumberofevals設(shè)置為250000，其他參數(shù)為默認(rèn)，輸出文件保存為dock.dpf文件。1.2.6執(zhí)行運(yùn)算圖1對接配體和共晶配體OLF的構(gòu)象對比圖，綠色為對接配體，紫色為共晶配體OLFFig.1Conformationofthedockedligandandco-crystallizedligand.Thegreenrepresentedthedockedligand,andpurplerepresentedco-crystallizedligandOLF在鍵盤運(yùn)行win+R，輸入cmd命令，使用cd命令進(jìn)入工作文件夾。輸入autogrid4-grid.gpf-lgrid.glg運(yùn)行程序，輸出grid.glg文件。再輸入autodock4-pdock.dpf-ldock.dlg，輸出dock.dlg文件。在AutoDockTools的Analyze板塊中對dlg格式文件進(jìn)行分析，保存最優(yōu)構(gòu)象。為檢查Autodock4.2參數(shù)設(shè)置的合理性，將共晶配體NE6與蛋白3DXJ按上述參數(shù)設(shè)置進(jìn)行分子對接，然后把對接前后的NE6的結(jié)構(gòu)相比較。在VMD1.9.3軟件中，對NE6和保存的最優(yōu)構(gòu)象計算均方根偏差(RMSD)值，如果RMSD值＜2?，說明建立的分子對接模型可靠性較高。也可以利用PyMOL軟件比較對接前后的共晶配體的構(gòu)象(圖1)，如果疊合度很高，也能說明對接模型的可靠性較高。

1.3AutoDockvina虛擬篩選

根據(jù)以上建立的分子對接模型，將對接參數(shù)寫進(jìn)AutoDockvina的配置文件conf.txt，這個文件里面寫上用于對接的詳細(xì)參數(shù)。然后通過win+R進(jìn)入運(yùn)行窗口，輸入“cmd”進(jìn)入命令行窗口，進(jìn)入AutoDockvina工作文件夾。輸入“vina--configconf.txt”，回車，運(yùn)行該程序完成對接的虛擬篩選。所得對接結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，化合物4與靶標(biāo)蛋白3DXJ的親和力(Affinity=-9.8kcal/mol)最強(qiáng)，而其他化合物對靶標(biāo)的親和力較弱(＞-7.0kcal/mol)。

1.4虛擬篩選結(jié)果分析

本教學(xué)案例中，我們利用PyMOL和LigPlot軟件這2種經(jīng)典的分子結(jié)構(gòu)顯示軟件，分析預(yù)測得到的活性最強(qiáng)的化合物4與靶標(biāo)蛋白的相互作用模式。通過PyMOL的外部GUI窗口(ExternalGUI)File-Open打開AutoDock對接后產(chǎn)生的dlg文件，然后打開純蛋白文件3dxyp.pdb文件，點擊PyMOL的all，選擇A(Action)＞preset＞ligandssites＞cartoon。蛋白3DXJ與化合物的4三維作用模式如圖2A所示。打開LigPlot程序，點擊File＞OpenPDBFile打開在PyMOL處理好的蛋白和最優(yōu)構(gòu)象的復(fù)合物pdb文件，并顯示成2D作用模式圖(圖2B)。對接結(jié)果顯示Ser1084、Gln1019、Gly620、Leu618等關(guān)鍵氨基酸分別與化合物4上與氮原子直接相連的羰基、羥基及六元環(huán)上氧原子存在氫鍵相互作用；而其他氨基酸如Val1466、Trp1038、Val1037、Glu1034、Leu619、Asn617、Lys621、Ile1467等與該化合物有疏水作用。

2教學(xué)效果及學(xué)生反饋

在實際的教學(xué)中，學(xué)生對受體蛋白的預(yù)處理和對接過程會遇到一些困難，老師會重點解答同學(xué)們的以下幾個疑問：(1)為什么要對受體蛋白進(jìn)行加氫處理？蛋白晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中通常會缺少氫原子的坐標(biāo)，而氫原子尤其是極性氫原子對計算靜電作用是必須的。因此，在利用AutoDock進(jìn)行對接時，需要給蛋白加上氫原子，也可以利用PyMOL軟件來快速完成這個操作，依次點選Edit-Hydrogen-Add-Polaronly，加上的氫原子會以白色短線形式出現(xiàn)。(2)可以通過幾種途徑來準(zhǔn)備配體小分子？①利用ChemDraw軟件準(zhǔn)備配體小分子。如果是未有文獻(xiàn)報道的小分子化合物，先在ChemDraw2D畫好結(jié)構(gòu)式，然后復(fù)制到ChemDraw3D做能量優(yōu)化。能量優(yōu)化步驟：Caculations-MM2-minimizeenergy-Run，然后File-Saveas-SYBYL2(*.mol2)，留待在AutoDock中進(jìn)一步處理備用。②利用PubChem數(shù)據(jù)庫下載復(fù)雜分子。如果是已知的化合物，尤其一些結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的分子，例如細(xì)菌RNA聚合酶抑制劑利福霉素(Rifamycin)，如果我們還是用ChemDraw2D來畫結(jié)構(gòu)式，會很容易畫錯，所以建議大家直接登錄PubChem數(shù)據(jù)庫下載2D或者3D結(jié)構(gòu)。那么怎樣選擇一個合適的蛋白作為研究對象呢？在實際的課堂教學(xué)中，我們一般會建議學(xué)生基于如下條件選取晶體結(jié)構(gòu)：解析度盡可能高、盡可能未有氨基酸殘基缺失或突變、優(yōu)先選擇人源、有文獻(xiàn)報道的且?guī)в泄簿潴w的復(fù)合物晶體等。總之，我們建議同學(xué)們在不知道怎么選蛋白作為研究對象的情況下，就多看文獻(xiàn)找思路。(3)如何在分子模擬水平上驗證分子對接結(jié)果的可靠性？如果已經(jīng)有明確的共晶配體分子的晶體復(fù)合物作為研究對象，我們在建立分子對接模型用于虛擬篩選之前，必須進(jìn)行晶體復(fù)合物重現(xiàn)性研究，即Re-dock研究。也就是要用復(fù)合物中的共晶配體作為配體小分子，在AutoDock中設(shè)置相關(guān)參數(shù)，對接以后得到的構(gòu)象，再與對接前的原配體的構(gòu)象進(jìn)行比較，以RMSD值來評價兩者之間相似度的差距。一般認(rèn)為RMSD＜2?，才能說明對接后得到的構(gòu)象與原配體差別較小，如果分子對接可以很好重現(xiàn)了復(fù)合物中蛋白與配體小分子的結(jié)合情況，即側(cè)面證明了分子對接方法可靠性較高。本課程的授課對象為藥學(xué)三年級的本科生，學(xué)生已學(xué)習(xí)過藥物化學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)等專業(yè)課程，具備一定的藥學(xué)專業(yè)知識基礎(chǔ)，也具有一定藥學(xué)實驗基礎(chǔ)。但是，部分同學(xué)初次接觸計算機(jī)輔助藥物設(shè)計軟件，專業(yè)外語的基礎(chǔ)薄弱，導(dǎo)致在學(xué)習(xí)藥物分子設(shè)計的軟件過程中會遇到許多困難。通過對以上學(xué)情的分析，筆者在本案例的教學(xué)過程中，首先通過雨課堂的方式把相關(guān)藥物分子設(shè)計的軟件操作教程提前發(fā)送給學(xué)生，并錄制軟件的操作視頻，讓學(xué)生課前充分地熟悉軟件的使用方法。在實際的課堂教學(xué)中，老師從小分子化合物庫的構(gòu)建及預(yù)處理，蛋白大分子的下載以及優(yōu)化等最簡單的步驟開始演示，對學(xué)生的疑問進(jìn)行現(xiàn)場解答。鼓勵學(xué)生自主學(xué)習(xí)與探索，采用小組交流討論，鼓勵同學(xué)之間互相幫助。通過這些舉措，學(xué)生可快速學(xué)會軟件的用法，顯著提高了學(xué)生的積極性和學(xué)習(xí)興趣。該教學(xué)案例的設(shè)計也融入藥物設(shè)計學(xué)課程考核中，是重要的考核內(nèi)容。藥物設(shè)計學(xué)課程的成績組成為：期評成績=教學(xué)案例的課程作業(yè)+文獻(xiàn)報告+課堂表現(xiàn)+PPT制作及講解。我們要求學(xué)生在實施這個教學(xué)案例后，把分子對接的結(jié)果發(fā)送給老師，以及通過PyMOL和LigPLot軟件制作小分子與蛋白靶標(biāo)的相互作用圖，通過PPT制作與講解，鼓勵和引導(dǎo)學(xué)生走上講臺，加深對知識點理解的同時，培養(yǎng)了學(xué)生分析解決問題能力、團(tuán)隊協(xié)作能力以及表達(dá)能力。在課后調(diào)研過程中，學(xué)生均表示了對藥物設(shè)計軟件的歡迎，也有同學(xué)表示在老師課堂演示之后，分子對接實踐由學(xué)生自行開展，對軟件的安裝、熟悉和使用需要花費一定的時間精力，部分學(xué)生由于計算機(jī)基礎(chǔ)較弱，學(xué)習(xí)具體操作存在一定困難，而被卡在某操作環(huán)節(jié)，這個時候更加需要老師和同學(xué)幫助其解決技術(shù)難關(guān)。調(diào)研結(jié)果同時表明，學(xué)生很喜歡這種極具實戰(zhàn)性的藥物分子虛擬篩選的案例課程，也希望學(xué)校多配置高性能計算機(jī)，多開展專門的藥物設(shè)計軟件的系統(tǒng)培訓(xùn)，從而幫助我校藥學(xué)專業(yè)學(xué)生更好地熟悉軟件的使用，提高學(xué)生藥物分子設(shè)計和虛擬篩選的能力。

3結(jié)語

本案例已運(yùn)用于桂林醫(yī)學(xué)院藥物設(shè)計學(xué)課程的實際教學(xué)中，并取得了良好的教學(xué)效果。本教學(xué)案例設(shè)計的內(nèi)容包括化合物庫的構(gòu)建、靶蛋白的下載與預(yù)處理、小分子的結(jié)構(gòu)獲取及優(yōu)化、AutoDock分子對接模型的建立，AutoDockvina虛擬篩選，以及利用PyMOL、LigPlot進(jìn)行結(jié)果分析等實驗內(nèi)容。通過本案例虛擬篩選的練習(xí)，學(xué)生們可以掌握基于免費的藥物設(shè)計軟件AutoDockvina來進(jìn)行虛擬篩選，學(xué)會利用PyMOL和LigPlot軟件分析靶標(biāo)蛋白與小分子相互作用模式，掌握計算機(jī)輔助輔助藥物設(shè)計的研究方法，為藥學(xué)專業(yè)本科生進(jìn)行先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供新的思路和手段，提升學(xué)生的藥物分子設(shè)計能力。總之，該教學(xué)案例的設(shè)計，加深學(xué)生對虛擬篩選的認(rèn)識，并極大地提升了學(xué)生學(xué)習(xí)藥物分子設(shè)計的興趣，為未來從事藥物分子設(shè)計研究打下堅實基礎(chǔ)。

作者：譚相端 呂良 單位：桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院