導(dǎo)語：如何才能寫好一篇干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

目的： 利用簡化無血清培養(yǎng)基和連續(xù)傳代法，從成體小鼠腸管分離培養(yǎng)腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞(GNCSCs)，觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中增殖、分化的特點(diǎn). 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作為特異性標(biāo)志來鑒定GNCSCs及其分化的細(xì)胞系. 方法： 將新生1， 5 d的小鼠腸管制成單細(xì)胞懸液，接種于無血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)并觀察克隆球的形成過程. 將克隆球接種于含血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，觀察其分化現(xiàn)象. 用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法檢測克隆球及其分化細(xì)胞系特異性標(biāo)志物的表達(dá). 結(jié)果： 成體小鼠腸管中有少數(shù)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清誘導(dǎo)下可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞. 結(jié)論： 成體腸管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在體外GNCSCs可分化為腸神經(jīng)系統(tǒng)所必須的細(xì)胞類型.

【關(guān)鍵詞】 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞 小鼠 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞分化 Hirschsprung病

0引言

應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療某些神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和退行性疾病，經(jīng)過較長時間的實(shí)踐已被證明是行之有效的［1］. 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神經(jīng)管背側(cè)，具有干細(xì)胞特性［2］，將其用于治療先天性巨結(jié)腸癥及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞疾病的研究已引起人們的關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)著重進(jìn)行GNCSCs的基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用建立理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，體質(zhì)量不拘，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供. ① DMEM/F12完全培養(yǎng)基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF， vitrogen)， β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）. ② 促分化培養(yǎng)基組成：DMEM/F12完全培養(yǎng)基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗為TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培養(yǎng)頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機(jī)械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min，10 min，終止消化后反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，用200目，400目的濾網(wǎng)過濾，以800 r/min 離心 5 min，棄上清，用預(yù)先配置的無血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以 6×108個/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中水平放置，貼壁培養(yǎng). 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細(xì)胞，以2/3量換液，孵育3 d后進(jìn)行傳代，以6×108個/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)孵育40~48 h后再次傳代，如有細(xì)胞團(tuán)塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預(yù)先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2 mL，動態(tài)觀察克隆球的分化情況.

1.2.3克隆球及其分化細(xì)胞特異性標(biāo)志物的染色應(yīng)用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗體分別檢測克隆球及其分化細(xì)胞系的性質(zhì)，封片后分別用光學(xué)顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.

轉(zhuǎn)貼于

2結(jié)果

2.1克隆球的生長狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細(xì)胞和一些呈半球狀或不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán). 孵育24 h后，貼壁細(xì)胞胞呈圓形，胞體小，折光性好，部分貼壁細(xì)胞胞體增大，折光性增強(qiáng)，出現(xiàn)分裂相，形成2～5個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，另一部分呈聚集生長. 3 d后形成十幾或數(shù)十個細(xì)胞構(gòu)成的克隆球(圖1A)，克隆球增大的同時向周圍伸出放射狀的細(xì)胞索，形成較小的次級克隆，這些克隆球形態(tài)完整，折光性減弱，周邊界線清晰，但其中心密集，界限不清，無法觀察到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu) （圖1B）. 重新傳代培養(yǎng)，可觀察到細(xì)胞胞體增大，出現(xiàn)分裂相的克隆球數(shù)量逐漸增多，雜質(zhì)細(xì)胞減少，在連續(xù)傳代過程中克隆球逐漸純化.

2.2克隆球的分化接種含血清培養(yǎng)基12 h后，可見有細(xì)胞從克隆球中遷出，遷出的細(xì)胞貼壁生長；24 h后克隆球變扁，遷移出的細(xì)胞增多，相差顯微鏡下難以分別形態(tài)；48 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，逐漸形成單細(xì)胞層且細(xì)胞形態(tài)多元化.

2.3克隆球及其分化細(xì)胞系的免疫染色免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（圖1C，圖2， 3）.

3討論

許多研究表明GNCSCs在ENS的發(fā)生和發(fā)育起關(guān)鍵作用［3-4］. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關(guān)［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發(fā)生障礙，受累腸道的相應(yīng)神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)缺失，表明先天性巨結(jié)腸可能是一種干細(xì)胞疾病. 由于HSCR及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞性疾病在手術(shù)治療后仍遺留有嚴(yán)重的并發(fā)癥，因此用干細(xì)胞來進(jìn)行臨床治療已成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn). 鑒于胚胎干細(xì)胞的來源限制及免疫排斥問題，成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗(yàn)提供新契機(jī).

GNCSCs的培養(yǎng)方法建立在中樞神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上. 依據(jù)神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)典的培養(yǎng)方法，再結(jié)合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點(diǎn)，聯(lián)合應(yīng)用簡化的特殊培養(yǎng)劑和神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng). 連續(xù)傳10代后，GNCSCs的相對比例明顯增加，這種體外培養(yǎng)的方法能有效地分離和純化GNCSCs，但并不能完全消除其他細(xì)胞. 如果繼續(xù)傳代，其純化程度越高，后續(xù)的試驗(yàn)效果將更佳. 連續(xù)傳代不僅純化了GNCSCs，還證實(shí)了干細(xì)胞的自我更新特性. 在體外培養(yǎng)干細(xì)胞時，培養(yǎng)條件稍有變化可導(dǎo)致分化機(jī)制的啟動，因此采用血清促分化法誘導(dǎo)GNCSCs分化既簡單又可靠. 通過免疫染色，證實(shí)了GNCSCs分化細(xì)胞的類型，同時顯示了分化的亞型神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，并表明了成體干細(xì)胞的多向分化能力.

參考文獻(xiàn)

［1］ 楊帆，楊樹源. 神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用前景［J］.醫(yī)學(xué)綜述， 2002；8(8):491-493.

［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.

［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.

篇2

“細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)是在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的大量培養(yǎng)動物細(xì)胞的新興技術(shù)，目前，該技術(shù)在歐美國家僅用于小規(guī)模生產(chǎn)人用禽流感疫苗。”此前，山東信得有關(guān)負(fù)責(zé)人說，作為一家同時擁有生物制品、生化制藥、獸藥制劑、飼料添加劑及獸藥原料藥五大產(chǎn)品線的高科技公司，山東信得首次實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在動物用禽流感疫苗研發(fā)生產(chǎn)中的規(guī)?；瘧?yīng)用，而這一研發(fā)生產(chǎn)過程持續(xù)了7年之久，從“十一五”期間就開始了。產(chǎn)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目引起了業(yè)界關(guān)注，并得到國家科技部門的支持，作為我國獸藥行業(yè)加快提升行業(yè)生產(chǎn)技術(shù)水平的代表項(xiàng)目。

為此，在2010年，山東信得專門成立動物疫苗有限公司，并投資1.5億元建成了國內(nèi)首家大規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)高致病性禽流感滅活疫苗的GMP車間，并于次年初通過了農(nóng)業(yè)部的GMP動態(tài)驗(yàn)收，獲得GMP證書和獸藥生產(chǎn)許可證。2012年，山東信得獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的禽流感細(xì)胞苗新獸藥證書。

“此次獲得重組禽流感病毒（H5N1亞型）滅活疫苗的生產(chǎn)文號，標(biāo)志著山東信得研發(fā)生產(chǎn)的產(chǎn)品將由此進(jìn)入規(guī)模生產(chǎn)階段，并能面向市場供應(yīng)?！鄙綎|信得有關(guān)負(fù)責(zé)人表示，同時也說明了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)打破多年來動物疫苗生產(chǎn)行業(yè)一直采用雞胚生產(chǎn)禽流感疫苗的技術(shù)瓶頸，標(biāo)志著我國在禽流感疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)方面，已經(jīng)走到了世界技術(shù)前沿，具有極大的引領(lǐng)和示范作用。

據(jù)了解，采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)高致病性禽流感疫苗，基本上能夠克服雞胚孵化生產(chǎn)工藝的缺點(diǎn)，是我國動物疫苗生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。具體來說，該技術(shù)避免了雞胚培養(yǎng)中由于含有大量雜蛋白而存在的安全隱患問題，以及由于雞胚廢棄物處理不當(dāng)而存在的散毒危險(xiǎn)。同時，由于各種技術(shù)參數(shù)由電腦程序統(tǒng)一操控，整個生產(chǎn)過程更加可控，無外源病毒污染和母源抗體影響，疫苗質(zhì)量批間差異最小化，產(chǎn)品更加穩(wěn)定。“簡單來說，就是技術(shù)更先進(jìn)、質(zhì)量更可控。”山東信得這位負(fù)責(zé)人認(rèn)為，該工藝的改進(jìn)，給我國乃至世界動物疫苗產(chǎn)業(yè)帶來了技術(shù)升級，將提升疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)水平，為養(yǎng)殖戶提供安全、優(yōu)質(zhì)、高效的疫苗。

篇3

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；大鼠

【中圖分類號】R587.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2013）03-0044-02

引言

研究表明，骨髓含有造血干細(xì)胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多種成體干細(xì)胞。EPCs主要分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，有助于血管疾病組織的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潛力的特點(diǎn)，研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化為成骨、軟骨、心肌、肌腱、上皮、內(nèi)皮等幾乎所有三胚層類型細(xì)胞的能力[1-3]，基于這個特性使BMMSCs成為了中藥誘導(dǎo)、臨床移植及一些分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞源。因此，本實(shí)驗(yàn)采用最簡單普通貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠BMMSCs，若能得到較為純凈BMMSCs，在節(jié)約了培養(yǎng)BMMSCs成本基礎(chǔ)上，提供了一種既簡單又能穩(wěn)定獲得純凈BMMSCs的方法，為相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提供豐富的BMMSCs。

1 材料和方法

時間及地點(diǎn)：于2009-09/2011-02在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。材料：清潔級SD大鼠，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的動物實(shí)驗(yàn)操作程序經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審議批準(zhǔn)。主要試劑：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）

實(shí)驗(yàn)方法：

大鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)：頸椎脫臼法處死2～3周齡SD大鼠，無菌條件下手術(shù)取下兩側(cè)完整股骨（連同肌肉），浸入0.1%新吉爾滅15 min；剝離股骨附著肌肉，并用含雙抗的D-PBS反復(fù)清洗。剪開股骨兩端，用D-PBS沖洗骨髓腔，收集含骨髓細(xì)胞的洗脫液，1000 g離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基重懸浮，每只大鼠分離的骨髓細(xì)胞接種兩個T25培養(yǎng)瓶，置37 °C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2 d換液1次，同時洗脫未貼壁的血細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下每日觀察細(xì)胞生長情況并照相。當(dāng)BMMSCs生長匯合度達(dá)60～70 %時，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105個/ml細(xì)胞密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

大鼠BMMSCs表型鑒定：取第3代BMMSCs進(jìn)行CD45、CD29和CD90表型分子的流式細(xì)胞儀檢測，具體步驟如下：0.125%胰酶消化BMMSCs并制成單細(xì)胞懸液，1000 g離心5 min；棄上清，加入D-PBS振蕩混勻，1000 g離心5 min；棄上清，加入適量D-PBS振蕩混勻；向預(yù)先加入各表型分子抗體的流式檢測管內(nèi)加入100 ?l細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)不少于100 000個），各管分別含PE Mouse IgG1/FITC Armenian Hamster IgG、PE anti-rat CD45/FITC anti-mouse/rat CD29及PE anti-rat CD90/mouse CD90.1不同熒光素標(biāo)記的流式細(xì)胞儀檢測抗體，振蕩混勻，避光孵育20 min；每管加入2 ml D-PBS，振蕩混勻，1000 g 離心5 min；棄上清，每管加入250 ?l 1%多聚甲醛固定液，振蕩混勻，4 ?C保存待此后上機(jī)檢測。

篇4

關(guān)鍵詞：IPS細(xì)胞；分化；造血干細(xì)胞

0 引言

目前，臨床上普遍使用造血干細(xì)胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細(xì)胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進(jìn)行骨髓移植，則需要進(jìn)行人體的白細(xì)胞抗原配型，否則發(fā)生免疫排異會危及患者生命。現(xiàn)有臍帶血庫儲存的造血干細(xì)胞免疫原性弱，但數(shù)量供不應(yīng)求，使其在疾病中的臨床應(yīng)用中受到限制。隨著誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（IPS）提取技術(shù)的出現(xiàn)，使分化自身細(xì)胞變?yōu)榱爽F(xiàn)實(shí)，不但避免了倫理問題，解決了免疫排斥問題，造血干細(xì)胞的數(shù)量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過程報(bào)道如下：

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株的來源

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9購于美國ATCC，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞IPS由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。

1.2試劑和儀器

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9的培養(yǎng)基為α-MEM，內(nèi)含20%的胎牛血清，OP9細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基為α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠），CD34來自MACS公司?？贵w為APS-TRA-1-85，半固體培養(yǎng)基購于SCT公司。流式細(xì)胞儀為美國AccuriC6型，定量PCR儀為CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先鋪好1%的metrigel進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持對照組細(xì)胞的未分化狀態(tài)，OP9用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)時放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里，，每隔四天用胰酶消化傳代。細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為0.5，濕度飽和。

OP9細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)4天后，將OP9的培養(yǎng)液換成誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的培養(yǎng)液，將UC013細(xì)胞洗兩遍后，再對邊緣部位細(xì)胞進(jìn)行消化，將細(xì)胞吸出后加入Dispace，再用槍頭吹吸混勻細(xì)胞后，將其轉(zhuǎn)移到加有分化培養(yǎng)液的細(xì)胞盤中搖勻，在與上述培養(yǎng)的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的第二天將培養(yǎng)液換為共培養(yǎng)液，第四天開始每隔一天半換一次培養(yǎng)液，第九天收樣品。

免疫磁珠法分選CD34+細(xì)胞，將細(xì)胞用PBS洗兩遍，接著用胰蛋白酶進(jìn)行消化，制備單細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞收集到離心管中進(jìn)行離心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均勻。過濾后，向其中加入FCR和 CD34標(biāo)記細(xì)胞，30秒后加入流式細(xì)胞緩沖液，再離心，然后吸取上清，加入流式細(xì)胞緩沖液重懸。將制備好的細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離，通過流式細(xì)胞儀分離柱的CD34-細(xì)胞被移出分離柱棄之，最終，通過加壓洗脫分離柱上黏附的細(xì)胞，即得到CD34+細(xì)胞。

用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，將共培養(yǎng)9天后的細(xì)胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制備單細(xì)胞懸液，收集到離心管中，靜置五秒后，用加有2%血清的流式緩沖液重懸，細(xì)胞過濾后，加入FCR和抗體，孵育15min，再用流式緩沖液清洗，重懸，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

集落形成實(shí)驗(yàn)。將分選的CD34+細(xì)胞接種到半固體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔接種1萬個細(xì)胞，培養(yǎng)14-16天。然后，在顯微鏡下根據(jù)集落成的血細(xì)胞形成特征，對集落細(xì)胞進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。同時，提取共培養(yǎng)2、4、6、8、10和12天的細(xì)胞的RNA，用RT-PCR法檢測各基因在細(xì)胞中的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，結(jié)果顯示，對照組未分化的人體細(xì)胞集落狀生長，呈扁平狀，排列緊密，沒有分化的跡象。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2天后的細(xì)胞，表面布滿細(xì)胞集落，已進(jìn)行造血干細(xì)胞分化。OP9細(xì)胞貼著細(xì)胞壁生長，細(xì)胞為三角形，周圍向外出伸出像纖維狀的偽足，細(xì)胞排列規(guī)則，生長迅速，培養(yǎng)4天后細(xì)胞鋪滿了培養(yǎng)皿底。

2.2誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化

通過在本實(shí)驗(yàn)組的誘導(dǎo)分化條件下，對實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分化到一定程度后，便開始大量克隆，細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生了分化，接著，OP9細(xì)胞開始出現(xiàn)老化跡象。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測

共培養(yǎng)9天后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞造血表面標(biāo)志物表達(dá)情況，用流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)細(xì)胞的CD34、CD43、CD31的表達(dá)情況，結(jié)果顯示表達(dá)上述表面標(biāo)志物的細(xì)胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR檢測

運(yùn)用RT-PCR對共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)檢測，結(jié)果顯示，IPS細(xì)胞發(fā)生造血分化時，Oct-4基因的表達(dá)慢慢消失；造血轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)緩慢升高；Runx-1基因在造血干細(xì)胞分化12天當(dāng)中的表達(dá)呈波浪式變化，其中分化第二天表達(dá)量最高，第四天開始下降，第八天開始升高；CD34在造血分化過程中的基因表達(dá)量逐漸增高。

2.5 CD34+細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)

CD34+細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)造血干細(xì)胞的形態(tài)特征，對細(xì)胞集落進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，紅系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落數(shù)量持續(xù)升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落數(shù)量逐漸降至最低。

3 討論

隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，通過誘導(dǎo)分化得到造血干細(xì)胞已經(jīng)成為事實(shí)。相對于多能干細(xì)胞而言，IPS通過導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子以及重編程進(jìn)行定向分化的比例較低，，但是IPS的獲得方法比較簡單穩(wěn)定，避免了胚胎干細(xì)胞面臨的倫理和法律等問題，使IPS可以應(yīng)用于細(xì)胞替代性治療，并可以進(jìn)行疾病的機(jī)理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細(xì)胞分化得到的造血干細(xì)胞免疫原性較低，解決了移植排斥的問題。

在本文的研究中，沒有外加細(xì)胞因子，直接將IPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞，結(jié)果獲得了20%的CD34+細(xì)胞，即造血干細(xì)胞，CD34是表達(dá)于造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，表明IPS可以分化為造血干細(xì)胞，但是轉(zhuǎn)化率比較低。Runx1是調(diào)控造血干細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，期基因的表達(dá)量在分化過程中呈現(xiàn)波浪式的變化，Gata-2的表達(dá)則逐漸升高。體外分化得到的造血干細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中成集落狀態(tài)，說明IPS可以向各細(xì)胞系進(jìn)行分化。

現(xiàn)在多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的方法主要有：一是形成胚狀體后再進(jìn)行誘導(dǎo)生成造血干細(xì)胞；二是基質(zhì)細(xì)胞與多能干細(xì)胞共培養(yǎng)；三是形成EB后與OP9進(jìn)行共培養(yǎng)；四是單層誘導(dǎo)ESC生成造血干細(xì)胞。利用OP9細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的造血微環(huán)境，為研究細(xì)胞定向分化為造血干細(xì)胞創(chuàng)造了可能性，OP9細(xì)胞主要支持早期的造血干細(xì)胞分化，并協(xié)助B淋巴細(xì)胞增殖。基質(zhì)細(xì)胞通過釋放的細(xì)胞因子支持造血干細(xì)胞的分化。這種誘導(dǎo)方法分化時間短，為臨床造血干細(xì)胞的移植提供了便利。誘導(dǎo)分化過程中不用添加細(xì)胞因子，比較經(jīng)濟(jì)。但該誘導(dǎo)方法也存在著一定的缺點(diǎn)，即存在鼠源性污染細(xì)胞的可能性，加之所用血清的成分的不明確性，限制了其在臨床應(yīng)用。

目前臨床上移植造血干細(xì)胞主要是用臍血和骨髓來源的造血干細(xì)胞，而體外分化和擴(kuò)增得到造血干細(xì)胞只能通過動物試驗(yàn)來獲得。將造血干細(xì)胞植入重建小鼠體內(nèi)，可以評價(jià)造血干細(xì)胞的功能。體外分化獲得的造血干細(xì)胞和臍血中的造血干細(xì)胞與重建小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)差異較大，需要進(jìn)一步優(yōu)化體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的過程，才能滿足該實(shí)驗(yàn)需求

4 小結(jié)

通過將IPS定向分化為造血干細(xì)胞的研究，成功誘導(dǎo)了造血干細(xì)胞，分化得到的細(xì)胞在體外培養(yǎng)中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技術(shù)方法希望可以為IPS細(xì)胞在造血疾病中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張坤等.體外誘導(dǎo)人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化為造血干/祖細(xì)胞的研究，中國實(shí)驗(yàn)血液雜志，2014.01.

篇5

 

一、分子水平的克隆—PCR技術(shù)

 

該科技技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。

 

PCR由三個基本反應(yīng)步驟：①模板DNA的高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解旋，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合;②模板DNA與引物的低溫退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;③引物的適溫延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。

 

二、細(xì)胞水平的克隆—動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

 

動物細(xì)胞培養(yǎng)是用酶解法將組織碎塊分離成單個細(xì)胞，用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液，在體外適宜條件下使細(xì)胞生長繁殖，并保留一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。

 

(一)細(xì)胞培養(yǎng)所需的條件

 

1.培養(yǎng)液

 

現(xiàn)多用合成培養(yǎng)液。合成培養(yǎng)液有多種，不同培養(yǎng)液適用于不同細(xì)胞?？筛鶕?jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進(jìn)行添加：抗生素、有機(jī)補(bǔ)充物(如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等)、促細(xì)胞分裂因子(生長因子類的FGF等)、貼壁和鋪展因子(如膠原蛋白，纖粘蛋白等)。

 

2.血清

 

在細(xì)胞培養(yǎng)液中必須添加一定量的血清方能獲得成功。血清中除了含有細(xì)胞生長的部分氨基酸外，還有促進(jìn)細(xì)胞生長和貼壁的成分。不同動物血清的作用差別很大，即使同一種動物的不同個體間的差異也很顯著。不同種細(xì)胞要求血清量也不同，大部分細(xì)胞生長液中加入10%血清已可滿足細(xì)胞生長要求。目前國內(nèi)外正在研制無血清培養(yǎng)液，以避免血清中某些物質(zhì)對細(xì)胞生長和病毒復(fù)制的影響。

 

3.PH

 

細(xì)胞生長的PH為6.6-7.8，但最適PH 7.0-7.4。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽、磷酸氫鹽和血清。

 

4.溫度

 

細(xì)胞培養(yǎng)的最適宜溫度應(yīng)與細(xì)胞來源的動物體溫一致。

 

此外，成功的細(xì)胞培養(yǎng)還需要嚴(yán)格的無菌操作及潔凈的培養(yǎng)器皿。

 

(二)細(xì)胞生長的三個階段

 

1.潛伏期

 

細(xì)胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。

 

2.指數(shù)生長期

 

指數(shù)生長期是細(xì)胞活力最好的時期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。

 

3.停滯期

 

即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，PH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。

 

(三)動物細(xì)胞的培養(yǎng)

 

1.原代細(xì)胞(primary cell)

 

動物組

 

織經(jīng)胰蛋白酶等消化、分散、獲得單個細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中大多數(shù)組織均可制備原代細(xì)胞，但生長的快慢及難易程度不一。原代細(xì)胞一般對病毒較易感染，尤其是來源于胚胎或幼畜組織的細(xì)胞。

 

2.二倍體細(xì)胞株(diploid cell strain)

 

將長成的原代細(xì)胞消化分散成單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，仍為二倍體。此種細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)大，對病毒的易感性則基本無變化。

 

3.傳代細(xì)胞系(establishell cell line)

 

與上述兩類細(xì)胞不同，這類細(xì)胞在傳代過程中染色體發(fā)生異常變異，在體外可無限制分裂。

 

三、個體水平的克隆—動物細(xì)胞核移植技術(shù)

 

所謂細(xì)胞核移植技術(shù)，就是將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育成新個體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。

 

(一)供體核的獲得

 

供體核可以是早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞。早期都采用合子核到64細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞核質(zhì)體分裂球作供體細(xì)胞核，80年代開始，隨著胚胎干細(xì)胞(embryo stem cells，ES)的建立和對其研究的深入，人們對胚胎干細(xì)胞在核移植方面的應(yīng)用前景寄予厚望，但ES建系太困難，僅在小鼠上獲得成功。1997年 Dolly羊的出現(xiàn)，開始了體細(xì)胞的核移植，并發(fā)展很快。

 

(二)受體細(xì)胞去核

 

作為細(xì)胞核移植的受體細(xì)胞主要有三類：去核的卵母細(xì)胞、受精卵和2-細(xì)胞胚胎，其中卵母細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛。研究證明，體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞核移植成功率不如體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，其原因可能是卵母細(xì)胞在體外成熟過程中，需要合成一些蛋白質(zhì)來完成第一次減數(shù)分裂，其活動有可能受到抑制。

 

(三)核卵重組

 

在顯微操作儀操縱下，用一直徑接近卵裂球大的移植針吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核的受體卵母細(xì)胞的間隙中，根據(jù)移入的部位不同，可分為帶下移植和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。在移植針移開后，對移植卵裂球上方的透明帶施加壓力使卵裂球與卵母細(xì)胞接觸。

 

(四)細(xì)胞融合與激活

 

由于卵細(xì)胞去核過程中破壞了卵膜和一部分細(xì)胞質(zhì)，若直接移植，成功率很低，故需對重組胚融合，其采用的方法有仙臺病毒法、物理或化學(xué)方法(如電融合法、鈣離子載體、乙醇、蛋白質(zhì)酶合成抑制劑等)激活受體細(xì)胞，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過程，電融合法更常用。

 

(五)重構(gòu)胚培養(yǎng)與移植

 

重構(gòu)胚需一定時間的培養(yǎng)，方可移植到受體，家兔和豬重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)24h以內(nèi)，就可通過非手術(shù)移植，而羊和牛重構(gòu)胚所需培養(yǎng)時間較長，一般發(fā)育到囊胚或桑椹胚時移植。

篇6

失誤帶來美容技術(shù)革命

目前筆者采訪了GSG的研發(fā)中心王健教授。王教授向記者談到：我們研發(fā)中心其實(shí)是研發(fā)細(xì)胞、基因技術(shù)和產(chǎn)品的研發(fā)機(jī)構(gòu)。對于GSC產(chǎn)品的出現(xiàn)完全是一次意外的失誤。一名研究人員將GSC液體瓶錯誤地放到了細(xì)胞培養(yǎng)皿中。事后發(fā)現(xiàn)了，但為時已晚。我們都認(rèn)為這一批細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)白做了，但經(jīng)過7天的培養(yǎng)之后，意外情況出現(xiàn)了：培養(yǎng)皿中的細(xì)胞不但沒有死掉，反而生長的比以前還要好。特別是培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，間充質(zhì)干細(xì)胞比其他細(xì)胞生長得更好。并且間充質(zhì)干細(xì)胞向成纖維前體細(xì)胞分化，而成纖維前體細(xì)胞最終發(fā)育為成纖維細(xì)胞。大家都知道，成纖維細(xì)胞是延緩皮膚衰老的最關(guān)鍵的生物物質(zhì)。

自我調(diào)控細(xì)胞生長代謝

談到GSC產(chǎn)品恢復(fù)皮膚健康年輕態(tài)王教授說道：維持皮膚中各種細(xì)胞新陳代謝青春水平不是隨心所欲的，有兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：一是細(xì)胞代謝不是越快越好，而是要將細(xì)胞代謝的周期調(diào)節(jié)到年輕時的節(jié)奏。二是調(diào)節(jié)細(xì)胞恢復(fù)代謝節(jié)奏，只能通過自身生理功能來完成。大家都知道，人是無法直接吸收細(xì)胞的，皮膚上直接涂抹的細(xì)胞也是無法進(jìn)入人體的，包括一些大分子的蛋白。所謂細(xì)胞美容或干細(xì)胞美容，都是一種宣傳上的噱頭。真正意義上的細(xì)胞美容是通過小分子的細(xì)胞因子通過透皮吸收后，進(jìn)入人體，與自身細(xì)胞上的受體結(jié)合，刺激自身細(xì)胞活躍起來，加快增殖分化速度，增加新生細(xì)胞的數(shù)量，滿足皮膚的生理需要，從而到達(dá)美容的目的。GSC活膚液都是小于10～15個氨基酸的小分子，我們稱之為生物細(xì)胞因子群。從細(xì)胞生物學(xué)角度講，細(xì)胞在人體內(nèi)的生長發(fā)育，依賴于一個小環(huán)境，也就是“微生態(tài)環(huán)境”。在這樣一個小環(huán)境之中，細(xì)胞受到多種細(xì)胞因子和營養(yǎng)蛋白的調(diào)控，才能使細(xì)胞本身正常生長發(fā)育。單一的或少量的細(xì)胞因子是不能為細(xì)胞創(chuàng)造一個最佳“微生態(tài)環(huán)境”的。這些細(xì)胞因子的體積很小，可以在皮膚細(xì)胞之間通過。因此，可以透皮吸收，進(jìn)入到真皮與皮下組織之間，激發(fā)那里的間充質(zhì)干細(xì)胞的活力，使之加快增殖分化的速度。使真皮組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量增加、活性增強(qiáng)。細(xì)胞因子在表皮的基底層部分，激發(fā)了那里的基底層表皮干細(xì)胞活力，使表皮干細(xì)胞加快增殖分化的速度，通過真皮和表皮新生細(xì)胞加快生長，使皮膚細(xì)胞新陳代謝恢復(fù)到年輕狀態(tài)。

延緩皮膚衰老的法寶

GSC產(chǎn)品首席科學(xué)家陸敏醫(yī)學(xué)博士告訴筆者：GSC活膚液能夠增加真皮組織中成纖維細(xì)胞的數(shù)量和活性，這是一場美容界的革命。真皮組織的衰老、塌陷，是造成皮膚暗啞、粗糙、皺紋的主要原因。而真皮組織中膠原蛋白的保有量隨著年齡的增加而逐漸減少是造成皮膚衰老的最重要的生理原因。因此，膠原蛋白一定要依靠自身生理功能來補(bǔ)充，真皮組織中的膠原蛋白主要來源于成纖維細(xì)胞的分泌。真皮組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量和活性，決定了真皮組織中膠原蛋白數(shù)量的多少。GSC活膚液通過增加自體成纖維細(xì)胞的數(shù)量和活性，達(dá)到增加皮膚內(nèi)膠原蛋白數(shù)量的方法，完全是一種生理性調(diào)節(jié)、依靠自身生理功能提高而達(dá)到延緩皮膚衰老的方法，是純天然、無損傷、保健型的美膚方法。

篇7

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 光感受器細(xì)胞 誘導(dǎo)分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)，是一群具有多向分化潛能的均質(zhì)性成體干細(xì)胞，它具有兩項(xiàng)干細(xì)胞最顯著的生物學(xué)特性：自我更新 (self-renewa1)能力及多向分化潛能。1968年, Friedenstein[1]等學(xué)者首先報(bào)告骨髓中存在一種細(xì)胞具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,他們認(rèn)為這種細(xì)胞可能是間充質(zhì)細(xì)胞的前體。隨著研究的發(fā)現(xiàn)，MSC具有向中內(nèi)外胚層組織細(xì)胞分化的能力 ,可以在體外被誘導(dǎo)分化為肌肉細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[2, 3]。近年來，BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞的分化的研究成為了研究的熱點(diǎn)。可利用抗氧化劑、生長因子、維甲酸、共培養(yǎng)等將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細(xì)胞[4-6]。本文探索了利用視網(wǎng)膜光感受器培養(yǎng)上清液體外誘導(dǎo)BMSCs分化為視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級健康Sprague-Dawley（SD）大鼠20只40眼，重量100~125g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司； DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司) ，Neurobasal培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），B27(美國Invitrogen公司) ，胎牛血清（美國Hyclone公司），0.25％胰蛋白酶（美國Hyclone公司），木瓜蛋白酶（美國sigma公司），多聚賴酸（美國sigma公司），小鼠抗大鼠單CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE，以及相應(yīng)同型對照單抗小鼠IgG1-FITC, IgG1-PE和IgG2a PE（Beckman-Coulter公司），神經(jīng)元特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠醇化酶（美國 Fisher Scientific公司），光感受器特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(zhì)(Rhodopsin)（RET-P1，美國Millipore公司），星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)（美國 Fisher Scientific公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司），總抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），THERMO FORMA 3111 CO2培養(yǎng)箱（美國），OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本），OLYMPUS BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本），Beckman-Coulter Epics XL 流式細(xì)胞儀（美國），臺式高速冷凍離心機(jī)（上海），Gene Amp 9700型PCR 擴(kuò)增儀（美國），Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)（Gel DOC2000）（美國），AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺（蘇州）。

1.2 方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

取清潔級SD大鼠，4mL／kg水合氯醛 (100g/L)進(jìn)行腹腔麻醉。碘伏消毒，無菌條件下取出大鼠的雙側(cè)脛骨和股骨， 分別剪斷股骨干和脛骨中間及兩端的干骺剪斷，用含有肝素的培養(yǎng)液10mL進(jìn)行反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)200目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩網(wǎng)過濾組織塊以及已凝血塊后，進(jìn)行離心后用20%FBS的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液接種于25cm2 培養(yǎng)瓶中，24h后首次換液去除未貼壁細(xì)胞，以后每2d換液一次，換液前PBS洗去部分未貼壁細(xì)胞，當(dāng)70％～80％細(xì)胞達(dá)到融合時用0.25%胰蛋自酶消化傳代，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表達(dá)[7]。

1.2.2視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

在暗環(huán)境下無菌取下清潔級SD大鼠的眼球，游離出完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。利用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化分離出光感受器細(xì)胞，用Neurobasal培養(yǎng)基A 1mL（加入1:50的B27和0.5mM L-glutamine）進(jìn)行避光培養(yǎng)，兩天換液一次，將視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞培養(yǎng)換液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，通過0.22um過濾篩過濾后按2:3比例與DMEM培養(yǎng)液混合后備用。分別把消化前和消化后的視網(wǎng)膜片進(jìn)行HE染色,在顯微鏡下觀察，同時對分離的光感受器細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。

1.2.3對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)以及鑒定

將3代的rMSCs接種在6孔板中。分為2個對照組，4個實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組加入光感受器細(xì)胞上清液與10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（2:3）進(jìn)行誘導(dǎo)，對照組用Neurobasal培養(yǎng)基A與10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（2:3）進(jìn)行培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長及分化情況，誘導(dǎo)后14天，行免疫細(xì)胞化學(xué)和Rt-PCR鑒定，免疫細(xì)胞化學(xué)：PBS洗滌3次，多聚甲醛固定，0.2％Triton-X作用10 min，過氧化酶阻斷，非免疫動物血清孵育 10 min，加Rhodopsin(1:100), NSE(1:200) ,GFAP(1:100) 抗

體，4℃過夜，加入生物素標(biāo)記的第二抗體，鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶溶液，DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。RT―PCR法檢測實(shí)驗(yàn)組和對照當(dāng)中的GFAP，NSE， Rhodopsin的表達(dá)。Rhodopsin引物上游引物ATGTTCGTGGTCCACTTCA3’，下游引物5’ CGTTGTCCTCA

GCCGATG 3’，擴(kuò)增長度為107bp；NSE引物上游引物：5’ CTGTGGTGGAGCAGGAGA 3’，下游引物5’ GGGAGATAGC

GGTGTAAC 3’，擴(kuò)增長度為156bp；GFAP引物上游引物：5’TAGGAGTGGTAGGGCAGACTTG3’，下游引物5’GCAACC

AGGAATAGACCTTCACAA 3’，擴(kuò)增長度為482bp；內(nèi)參Rat GAPDH 為5’CAGTGCCAGCCTCGTCTC 3’，BC050110為5’ AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’，擴(kuò)增長度為595bp。參照TRIZOL試劑說明書對誘導(dǎo)的MSC分別提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增，將 PCR產(chǎn)物電泳后進(jìn)行圖像分析儀采集圖像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包(statistical package for the social science)分析，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

培養(yǎng)的大鼠的BMSCs接種后24小時開始貼壁，前3天細(xì)胞增殖慢，數(shù)量比較少，第3開始細(xì)胞的增長速度明顯增加，7天后就達(dá)到融合狀態(tài)，呈現(xiàn)漩渦狀、狀。第三代時，細(xì)胞仍呈梭形，生長旺盛。BMSCs標(biāo)志鑒定結(jié)果表明，培養(yǎng)的第三代BMSCs干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90陽性（CD90+/CD34-：92%），基質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志CD44陽性（CD44+/CD34-：93%）（見圖1）。

圖1 大鼠MSC流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（A: CD90+/CD34-：92%;B: CD44+/CD34-：93%)

2.2 視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的鑒定

取下來的視網(wǎng)膜在消化前后分別進(jìn)行HE染色，消化前可以很清楚地觀察到九層細(xì)胞，說明取下來的是完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，不含有色素上皮，消化后的視網(wǎng)膜片，光感受器層的細(xì)胞變少，其它層細(xì)胞完整，光感受器細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)示，光感受器細(xì)胞的特異標(biāo)志物視紫紅質(zhì)的表達(dá)率達(dá)95%以上。

2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)組BMSCs誘導(dǎo)后的第4天細(xì)胞形態(tài)開始變化，可見小的突起。隨后細(xì)胞便圓，突起增長，出現(xiàn)少量神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)，到14天最為明顯，出現(xiàn)一、二級分支，相互之間連接呈網(wǎng)狀。對照組也有少量的細(xì)胞呈神經(jīng)樣的形態(tài)。誘導(dǎo)后的神經(jīng)元樣細(xì)胞GFAP，NSE，Rhodopsin呈強(qiáng)陽性。非神經(jīng)元樣細(xì)胞呈多邊形或梭形，上述抗體染色呈弱陽性。陰性對照未見染色。

免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，共培養(yǎng)2周后，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示： rMSC的Rhodopsin表達(dá)率實(shí)驗(yàn)組為35.1%±6.2 %（圖2A）,而對照組中無Rhodopsin陽性的細(xì)胞（圖2B）， rMSC的NSE表達(dá)率實(shí)驗(yàn)組為33.6%±4.0 %（圖3A），對照組為10.6%±5.0%（圖3B）, rMSC的GFAP實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)率為9.6%±1.5 %（圖4A），對照組為：13.7%±3.0 %（圖4B）； 對照組與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行兩樣本的t檢驗(yàn)NSE：F =0.09，方差齊，P < 0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GFAP：F =1.726，方差齊，P ＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:實(shí)驗(yàn)組大量表達(dá)Rhodopsin(×100)；B:對照組未表達(dá)Rhodopsin(×100)

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)rMSCs表達(dá)Rhodopsin結(jié)果

A:實(shí)驗(yàn)組大量表達(dá)NSE(×100)；B:對照組少量表達(dá)NSE(×100)

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)rMSCs表達(dá)NSE結(jié)果

A:實(shí)驗(yàn)組表達(dá)有GFAP(×100)；B：對照組表達(dá)有GFAP(×100)

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)rMSCs表達(dá)GFAP結(jié)果

RT-PCR鑒定結(jié)果分析顯示，實(shí)驗(yàn)組MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達(dá)，其中GFAP表達(dá)比較弱；而對照組的只表達(dá)GFAP和NSE，且均較弱，未見Rhodopsin條帶(圖5)。

A:為實(shí)驗(yàn)組，GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達(dá)；B:為對照組，只表達(dá)GFAP和NSE。

圖5 Rt-PCR檢測GFAP、NSE、Rhodopsin

3 討論

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M視網(wǎng)膜體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為視網(wǎng)膜細(xì)胞，利視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞培養(yǎng)上清液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行向視網(wǎng)膜樣細(xì)胞誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)關(guān)于視紫紅質(zhì)的檢測，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)率高達(dá)35.1 %±6.2 %，對照組沒有表達(dá)，說明其光感受器條件培養(yǎng)基能使MSC向光感受器細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。從而驗(yàn)證了大鼠MSC確實(shí)可以在體外被誘導(dǎo)為表達(dá)視紫紅質(zhì)的光感受器樣細(xì)胞，Tomita M[8]研究表明不管是利用BDNF, NGF, and bFGF或與視網(wǎng)膜片共培養(yǎng)，均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)Rhodopsin的證據(jù)。Anthony等[5]對BMSCs向視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞誘導(dǎo)分化進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。利用維甲酸、牛磺酸和EGF體外將小鼠 BMSCs成功誘導(dǎo)為視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞可以表達(dá)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞特異性標(biāo)志物：視紫紅質(zhì)、視蛋白和恢復(fù)蛋白，最近國內(nèi)學(xué)者單純用EGF也可以誘導(dǎo)rMSC表達(dá)Rhodopsin[9]。本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中NSE表達(dá)率也明顯高于對照組，而GFAP，兩組表達(dá)并無差異，說明，光感受器條件培養(yǎng)基促進(jìn)rMSC向神經(jīng)元細(xì)胞方向分化，而對于膠質(zhì)細(xì)胞方向分化并無誘導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)的對照并未加誘劑的rMSC也能表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志，Tomita M[8] 研究說明沒有生長因子誘導(dǎo)的MSC沒有向神經(jīng)方向分的證據(jù)，強(qiáng)調(diào)生長因子在神經(jīng)分化中的重要地位，但是也有許多學(xué)者提出了在未誘的條件下仍發(fā)現(xiàn)神經(jīng)特異性標(biāo)志物的表達(dá)，Tondreau T等[10]發(fā)現(xiàn)未誘的的MSC也可以表達(dá)神經(jīng)特異標(biāo)記物，如Nestin和β微管蛋白Ⅲ，酪氨酸羥化酶等。Deng J[11]研究中也證實(shí)，體外培養(yǎng)大鼠的MSC具有自發(fā)表達(dá)早期的神經(jīng)標(biāo)記物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物，如神經(jīng)微絲M（FNM），這些跟本實(shí)驗(yàn)對照組仍能誘導(dǎo)的MSC能表達(dá)NSE相一致。

我們的實(shí)驗(yàn)利用光感受器細(xì)胞上清液模擬視網(wǎng)膜體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液可能在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活與分化方面起重要作用。盡管BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究已獲得了一些令人鼓舞的結(jié)果，但是還面對了許多待進(jìn)一步解決的問題：（1）對于BMSC的鑒定一直都沒有一個統(tǒng)一的說法，對BMSC的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)和分化各階段細(xì)胞標(biāo)志物的進(jìn)一步研究；（2）光感受器細(xì)胞在體外的外節(jié)容易脫落變性，如何進(jìn)一步保持其完整性以及存活時間；（3）體外BMSC向視網(wǎng)膜樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化模式和分子調(diào)控機(jī)制還不甚清楚，其誘導(dǎo)的微環(huán)境還比較復(fù)雜，有的學(xué)者直接采用雞尾酒式的加入好幾種生長因子進(jìn)行誘導(dǎo)，對于其中各生長因子具體作用以及相互間的作用仍不清楚；（4）對于本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)出來表達(dá)視紫紅質(zhì)的MSC細(xì)胞的與真正的光感受器細(xì)胞之間不管是從形態(tài)上還是都有很大的差距，縮短這一差別，將MSC真正應(yīng)用于眼科臨床，還需進(jìn)一步深入的研究探索。

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篇8

【摘要】 ［目的］探討骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植對股骨頭缺血性壞死的治療作用和修復(fù)機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。［方法］24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為兩組，A組為髓芯減壓組，B組為干細(xì)胞移植組。采用液氮冷凍法造模。A組鉆孔后植入空白明膠海綿，B組鉆孔后植入復(fù)合有骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的明膠海綿。術(shù)后每組分別于2、4、6、8周各處死3只動物，做X線及組織學(xué)檢查。［結(jié)果］（1）X線結(jié)果：2周時A、B組鉆孔區(qū)均呈低密度，4周時A組鉆孔邊緣密度增加，B組整個鉆孔區(qū)密度增加，8周時A組鉆孔區(qū)均呈低密度，邊緣形成硬化線，B組鉆孔區(qū)形成骨小梁結(jié)構(gòu)。（2）組織學(xué)結(jié)果：2周時A組鉆孔區(qū)出現(xiàn)少許炎癥細(xì)胞，邊緣出現(xiàn)較多成骨細(xì)胞并有骨組織形成，至8周時，鉆孔區(qū)內(nèi)形成骨髓組織，只在邊緣形成骨小梁結(jié)構(gòu)。2周時B組鉆孔區(qū)有大量的成骨細(xì)胞，邊緣有較多骨組織形成，4周時鉆孔區(qū)內(nèi)充滿新生骨小梁結(jié)構(gòu)，8周時鉆孔區(qū)內(nèi)骨小梁成熟，小梁有骨髓組織填充。［結(jié)論］骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對兔股骨頭缺血性壞死有良好的修復(fù)作用。

【關(guān)鍵詞】 股骨頭缺血性壞死； 動物模型； 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞培養(yǎng)； 移植

Experimental study on treatment of femoral head necrosis in rabbit with transplantation of bone marrow stromal cells∥

Abstract：［Objective］To investigate the repairing effect and mechanism for treatment of femoral head necrosis on transplantation of bone marrow stromal cells.［Method］Twenty-four Newzland rabbits were pided into two groups randomly，Group A as core decompression group and Group B as Bone marrow stromal cells autograft group.Animal femoral head neorosis model was made by freezing method with liquid nitrogen.After freezing and drilling，The drilled necrotic cavities of Group A was implanted with gelatin sponge，while of Group B was with gelatin sponge combined by bone marrow stromal cells.Three animals in every group were sacrificed respectively at 2，4，6，8 weeks and subjected to radiograph and microscope examination.［Result］（1）Radiograph examination:At 2 weeks，the drilled holes in Group A and B all presented low density images.At 4 weeks，the density in the drilled holes increased in group B and the density around the drilled holes increased in group A.At 8 weeks，sclerotic line formed around the drilled holes in Group A and trabeculae appeared in the drilled holes in group B.（2）Microscope examination:in group A，at 2 weeks，a few inflamatory cells appeared in the holes with many osteoblasts and ostoid appeared around the drilled holes.At 8 weeks，marrow formed in the drilled holes in group B，at 2 weeks，there were a large amount of osteoblasts in the drilled holes and some ostoid formed around thc drilled holes.At 4 weeks，the drilled holes were full of trabeculae.At 8 weeks，the trabeculae matured with the marrow appeared in the intertrabecular space.［Conclusion］Bone marrow stromal cells autografting may be an effective way to treat rabbit femoral head necrosis.

Key words：femoral head necrosis； animal model; bone marrow stromal cell； cell culture; transplantation

近年來一些研究發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cell，BMSC）減少與股骨頭缺血性壞死有密切關(guān)系。有報(bào)道用自體紅骨髓移植治療股骨頭缺血性壞死取得了較好的療效。認(rèn)為移植于股骨頭內(nèi)BMSC的數(shù)目決定著治療的成敗。本實(shí)驗(yàn)用移植體外增殖的BMSC治療兔股骨頭缺血性壞死，探討B(tài)MSC在早期股骨頭缺血性壞死治療中的作用及修復(fù)機(jī)理，為臨床提供理論依據(jù)和合理的治療方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組

成年新西蘭大白兔24只，雌雄不限，年齡4～5個月，體重2.5～3.5 kg。由白求恩國際和平醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分為A、B 2組，每組12只。A組為髓芯減壓組，B組為細(xì)胞移植組。

1.2 主要試劑

地塞米松磷酸鈉注射液，浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H330220827，批號：041105。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，GIBCO公司。胎牛血清，杭州四季青公司。

1.3 BMSC的獲取和培養(yǎng)

從實(shí)驗(yàn)動物髂后上嵴處抽取骨髓。全骨髓培養(yǎng)。用硬膜外穿刺針刺入髂骨1～1.5 mm，以含有100 μ／ml肝素0.2 ml的5 ml注射器，迅速抽取骨髓2 ml，所獲骨髓種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔種植1 ml，每只實(shí)驗(yàn)動物種植2個孔。加入含20%胎牛血清DMEM液5 ml，反復(fù)吹打，再加入地塞米松10-8 mmol／L，微型震蕩器上震蕩2 min，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度37 ℃，含5%CO2，100%飽和濕度。5 d后換液，沖去紅細(xì)胞，可見多個成纖維細(xì)胞克隆貼壁生長。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)孔面積一半時，用0.25%胰蛋白酶消化，原孔傳代，2～3 d可見細(xì)胞長滿培養(yǎng)孔，將其按1×106／cm2密度傳入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。待第3代細(xì)胞長滿后，消化細(xì)胞并將細(xì)胞配成2×106／ml細(xì)胞懸液，復(fù)合于3 cm×4 cm的明膠海綿上。每塊明膠海綿含細(xì)胞懸液50 μl，共10萬個細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h備用。

1.4 動物造模及細(xì)胞移植

所有動物雙側(cè)股骨頭均參加實(shí)驗(yàn)。取俯臥位。硫賁妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉。后側(cè)入路，暴露股骨頭后不脫位。用液氮棉球連續(xù)冷凍3 min。自然復(fù)溫后，用直徑為3.5 mm鉆頭從股骨頸內(nèi)后側(cè)向股骨頭內(nèi)鉆入4 mm，到達(dá)關(guān)節(jié)軟骨下。A組鉆孔后，植入明膠海綿。B組鉆孔后，植入復(fù)合有自體BMSC的明膠海綿，關(guān)閉傷口。術(shù)后連續(xù)3 d臀大肌注入硫酸慶大霉素注射液，2 ml／只，每日1次。兩組各于術(shù)后2、4、6、8周各處死3只動物，作大體觀察、X線檢查和組織學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的生長觀察及鑒定

骨髓培養(yǎng)到第5 d，沖去表面紅細(xì)胞，可見每個孔內(nèi)有3～7個成纖維細(xì)胞樣克隆集落貼壁生長，呈放射狀，直徑大小不等。單個細(xì)胞呈長梭形，胞漿豐富，細(xì)胞核居中，換液2～3 d后細(xì)胞克隆增大，待細(xì)胞生長占滿培養(yǎng)孔一半時，消化傳代。消化傳代后細(xì)胞首先呈圓形透亮，2～4 h后貼壁生長變成短梭形，2～3 d后細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底，呈長梭形緊密排列。3代細(xì)胞接種后2～7 d呈指數(shù)生長，倍增時間為48 h。

2.2 動物的一般觀察

術(shù)后1周內(nèi)，動物雙側(cè)后肢輕度跛行，運(yùn)動減少，采食減少。而后采食增加，運(yùn)動增多，步態(tài)轉(zhuǎn)好。2周后恢復(fù)術(shù)前狀態(tài)，傷口Ⅰ期愈合。

2.3 股骨頭標(biāo)本大體觀察

術(shù)后2周標(biāo)本，A、B 2組股骨頭外形均圓，關(guān)節(jié)軟骨呈蒼白色，A組有1個標(biāo)本關(guān)節(jié)軟骨面有少許剝脫。4周標(biāo)本，兩組股骨頭外形均圓，關(guān)節(jié)軟骨呈蒼白色，所有關(guān)節(jié)軟骨輕度剝脫。6周時，除A組有1個股骨頭標(biāo)本輕度塌陷外，兩組其余股骨頭標(biāo)本外形均圓，軟骨呈蒼白色，關(guān)節(jié)軟骨剝脫加重。8周股骨頭標(biāo)本，兩組股骨頭外形均圓，關(guān)節(jié)軟骨剝脫比6周時加重，部分關(guān)節(jié)軟骨下骨輕度暴露，軟骨呈蒼白色。

2.4 X線觀察

A、B 2組標(biāo)本在鉆孔缺損區(qū)以外的變化大致相似，術(shù)后2周，兩組股骨頭密度有所增加，4周標(biāo)本，除股骨頭密度略比2周時增高外，其余無明顯變化，6周標(biāo)本，骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，軟骨下囊性變，8周標(biāo)本，股骨頭密度高，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂加重，軟骨下囊性變明顯。兩組標(biāo)本在鉆孔缺損內(nèi)有著不同的變化，術(shù)后2周時，2組鉆孔缺損區(qū)密度低，4周標(biāo)本，A組鉆孔缺損區(qū)中心密度低，邊緣密度有所增高，B組整個鉆孔缺損區(qū)密度增高。6周標(biāo)本，A組仍呈現(xiàn)鉆孔缺損區(qū)中心低密度，邊緣高密度，B組鉆孔缺損區(qū)出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)。8周標(biāo)本，A組鉆孔缺損區(qū)中心密度低，邊緣密度增高，形成硬化線，B組鉆孔缺損區(qū)有正常骨小梁結(jié)構(gòu)。

轉(zhuǎn)貼于

2.5 組織學(xué)觀察

A、B組缺損區(qū)以外的病理變化過程大致相似，都出現(xiàn)了壞死和修復(fù)現(xiàn)象，在缺損區(qū)內(nèi)，兩組修復(fù)現(xiàn)象有很大不同。A組2周標(biāo)本，缺損區(qū)內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞，邊緣有較多成骨細(xì)胞，并且有類骨質(zhì)和骨小梁產(chǎn)生（圖1）。4周與2周比差別不大，缺損區(qū)邊緣骨小梁增多。6周缺損區(qū)出現(xiàn)骨髓組織。8周缺損區(qū)邊緣仍然在修復(fù)，缺損區(qū)出現(xiàn)大量骨髓組織無骨小梁組織（圖2）。B組2周標(biāo)本缺損區(qū)內(nèi)有大量的成骨細(xì)胞（圖3），缺損邊緣有較多的類骨質(zhì)和新生骨小梁。4周標(biāo)本，缺損區(qū)內(nèi)有大量骨小梁及類骨質(zhì)填充。6周標(biāo)本缺損區(qū)內(nèi)出現(xiàn)比較成熟的骨小梁，骨髓組織出現(xiàn)。8周標(biāo)本缺損區(qū)內(nèi)骨小梁成熟，骨髓組織形成（圖4）。

3 討論

股骨頭缺血性壞死與多種致病因素有關(guān)，除創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死發(fā)病機(jī)理清楚外，非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死發(fā)病機(jī)理并不完全明了。治療早期股骨頭缺血性壞死的目的主要是促進(jìn)壞死股骨頭的修復(fù)，避免出現(xiàn)股骨頭塌陷。髓芯減壓是治療早期股骨頭缺血性壞死的常用方法，其有效率在30%～90%之間〔1〕。

有報(bào)道〔2〕髓芯減壓可以打開骨質(zhì)，增加股骨頭血流量，但組織學(xué)發(fā)現(xiàn)髓芯減壓管道內(nèi)，充滿著幼稚的骨髓和無骨小梁結(jié)構(gòu)組織，股骨頭修復(fù)并不完全。這可能是由于爬行替代過程中BMSC太少所致〔3〕。Hernigou等〔4〕研究了激素和酒精股骨頭缺血性壞死患者髂骨BMSC和造血干細(xì)胞數(shù)目的變化，通過對骨髓培養(yǎng)形成的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞先祖細(xì)胞（GMP）和成纖維細(xì)胞克隆形成集落單位（FCF）計(jì)數(shù)評價(jià)骨髓造血干細(xì)胞和BMSC的活性。發(fā)現(xiàn)股骨頭缺血性壞死患者GMP和FCF計(jì)數(shù)與健康骨髓捐獻(xiàn)志愿者相比有明顯下降。表明股骨頭缺血性壞死與BMSC減少密切相關(guān)。

嚴(yán)軍等〔5〕通過自體骨髓移植治療兔Perthes病模型的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)自體骨髓移植組壞死骨修復(fù)較空白對照組活躍，骺板損傷處可見少量軟骨細(xì)胞，單純鉆孔組以纖維修復(fù)為主。認(rèn)為由于BMSC數(shù)目較少，自體骨髓移植治療兔Perthes病模型能力有限，體外培養(yǎng)增殖BMSC，增加植入細(xì)胞數(shù)目，結(jié)合適當(dāng)?shù)募?xì)胞載體，可能更有利于股骨頭壞死的修復(fù)。Valerie等〔6〕運(yùn)用髓芯減壓加經(jīng)過離心方法處理的自體紅骨髓移植方法治療13例18個處于ARCOⅠ～Ⅱ期缺血壞死的股骨頭，隨訪24個月，骨髓移植組10個關(guān)節(jié)只有1個髖關(guān)節(jié)進(jìn)入到Ⅲ期，而對照組8個關(guān)節(jié)有5個髖關(guān)節(jié)進(jìn)入到Ⅲ期。

骨髓移植治療股骨頭缺血性壞死可以增加股骨頭內(nèi)的BMSC數(shù)量，增強(qiáng)其修復(fù)能力。但是骨髓中含有BMSC數(shù)量有限，必然影響到骨髓移植后的修復(fù)效果。研究發(fā)現(xiàn)骨髓中每10萬個有核細(xì)胞中才含有1個BMSC，因此增加BMSC數(shù)量仍然是這項(xiàng)技術(shù)的焦點(diǎn)。盡管人們采用各種各樣的離心方法處理骨髓，以增加單位體積內(nèi)有核細(xì)胞數(shù)目，但是這種方法作用畢竟有限，難以達(dá)到臨床要求。因此本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)增殖的BMSC移植于壞死的股骨頭內(nèi)，以提高單位體積內(nèi)移植細(xì)胞數(shù)目。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單純行髓芯減壓的股骨頭，2周標(biāo)本缺損處成骨細(xì)胞稀少，只在鉆孔邊緣形成少量的類骨質(zhì)及骨小梁，隨著時間的延長，鉆孔區(qū)逐漸形成骨髓組織，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而移植骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組，2周標(biāo)本缺損處有大量的成骨細(xì)胞，鉆孔邊緣形成較多的類骨質(zhì)及骨小梁。4周時鉆孔區(qū)已經(jīng)被新生骨小梁填滿。6周標(biāo)本骨小梁相對成熟，骨髓出現(xiàn)。8周標(biāo)本形成正常骨小梁和骨髓組織，本實(shí)驗(yàn)每個股骨頭內(nèi)移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目為10萬個，這表明BMSC數(shù)目在股骨頭缺血性壞死修復(fù)過程中起著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)在股骨頭缺血性壞死修復(fù)過程中出現(xiàn)了膜內(nèi)化骨和軟骨化骨兩種形式，其規(guī)律是在壞死骨小梁周圍以膜內(nèi)化骨為主，在軟骨面和骺板附近以軟骨化骨為主。這可能與BMSC周邊環(huán)境中不同的誘導(dǎo)因子有關(guān)。兩組在鉆孔缺損區(qū)以外都出現(xiàn)同樣的壞死和修復(fù)過程，說明骨傳導(dǎo)在修復(fù)過程中并未起明顯作用。

本實(shí)驗(yàn)采用BMSC移植治療兔股骨頭缺血性壞死取得了良好的效果，但干細(xì)胞移植的最佳密度和數(shù)量以及其與誘導(dǎo)因子及載體結(jié)合后對股骨頭缺血性壞死修復(fù)的效果都需進(jìn)一步研究。 【參考文獻(xiàn)】

〔1〕 Mont MAI，Carbone JJ，F(xiàn)airbank Ac.Core decompression versus nonoperative management for osteonecrosis of hip［J］.Clin Orthop，324：169178.

〔2〕 衛(wèi)小春.掃描電鏡觀察股骨頭缺血壞死后的變化［J］.中華骨科雜志，1991，5：377379.

〔3〕 Hernigou P，Beaujean F，Lambotte JC.Decrease of mesenchymal stem cell pool in the upper femoral extremity of patients with osteonecrosis related to corticosteroid therapy［J］.J Bone Jiont Surg，1999，81:349355.

〔4〕 Hernigou P，Beaujean F.Abnormalities in bone marrow of iliac crest in patients who have osteonecrosis secondary to cortieosteroid therapy or alcohol abuse［J］.J Bone Joint Surg，1997，79:10471053.

〔5〕 嚴(yán)軍，董天華，楊照耀，等.自體骨髓移植治療兔Perthes病模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國矯形外科雜志，2002，10：790792.

篇9

這個名為SCLGL實(shí)驗(yàn)室的主人是日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)助教授、圣釋（北京）生物工程有限公司首席科學(xué)家郭鐳。郭是世界首例成人活體肝移植手術(shù)的實(shí)施者、東京大學(xué)名譽(yù)教授幕內(nèi)雅敏（Makuuchi Masatoshi）的學(xué)生，并曾榮獲美國臟器移植學(xué)會青年研究學(xué)者獎。

但在反對者眼中，干細(xì)胞研究早已臭名昭著。它總是與人類胚胎、克隆人或者是電影《弗蘭肯斯坦》中那些奇丑無比的人形怪物聯(lián)系起來。自從 1998 年“干細(xì)胞研究之父”美國科學(xué)家詹姆斯·湯姆遜（JamesThomson）成功分離出人類胚胎干細(xì)胞以來，圍繞干細(xì)胞展開的拉鋸戰(zhàn)就從未停止過。

體積微小的干細(xì)胞可令人了解生命如何從一個單一細(xì)胞發(fā)展而來，但這項(xiàng)研究目前在很多國家尚處禁地。在郭鐳眼中，這是一項(xiàng)令人振奮而且大有前途的研究，其重要性不亞于基因排序研究。孟山都公司前CEO理查德·馬奧尼（Richard Mahoney）說：“生物學(xué)是下一波引發(fā)巨變的科學(xué)浪潮，而干細(xì)胞的早期開發(fā)則是孕育這些變化的源泉?！?/p>

解凍期或即將很快到來。2011年，韓國食品藥品管理局準(zhǔn)許由FCB-Pharmicell公司開發(fā)的心臟病治療藥物Hearticellgram-AMI自7月1日起投放市場銷售。它的問世標(biāo)志著世界首例干細(xì)胞治療藥物在韓國正式誕生。

按所處發(fā)育階段劃分，干細(xì)胞可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。這種細(xì)胞可分裂、轉(zhuǎn)變成為各種器官、組織，因此或?qū)⒈挥糜谛迯?fù)、治療損傷、病變的組織，這一技術(shù)被稱為再生醫(yī)療。來至人類胚胎的全能干細(xì)胞，可以增殖并分化為全身200多種細(xì)胞類型，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官。

支持者認(rèn)為干細(xì)胞可治療心臟病、肝病、糖尿病等其他疾病。而最有發(fā)展前途、效果最好、用途最廣的干細(xì)胞則是胚胎干細(xì)胞，它只存在于細(xì)胞分裂但尚未開始發(fā)育的前幾天里。當(dāng)然，人們對其爭議亦最激烈—它是胚胎的一部分，它們在皮氏培養(yǎng)皿中由體積只及針頭十分之一大小的細(xì)胞球培養(yǎng)而成，在提取過程中，胚胎將被摧毀。正因如此，胚胎干細(xì)胞研究在道德倫理范疇上產(chǎn)生了嚴(yán)重分歧，其反對者包括教皇保羅二世及美國前總統(tǒng)布什。

干細(xì)胞對于當(dāng)今那些藥物無法治療的頑癥患者來說堪稱福音—成熟細(xì)胞之間通過數(shù)以千計(jì)的細(xì)小分子實(shí)現(xiàn)交流，其中每個分子均包含特定的“細(xì)胞語言”，多數(shù)頑癥是由分子間語言交流的突然缺失而造成的，而傳統(tǒng)藥物每次僅能對付某一種分子。例如幫助心臟病人打通阻塞血管以暫時遏制心臟病的發(fā)作，但不足以阻止所有誘發(fā)心臟病的分子病理因素。

而干細(xì)胞治療則不然。作為早期發(fā)育敏感度極強(qiáng)的細(xì)胞，它可熟練地運(yùn)用“細(xì)胞語言”，同時迅速彌補(bǔ)分子缺失信息。例如對于心臟病病人，它的反應(yīng)是形成血管和心肌。對于神經(jīng)細(xì)胞損傷，則是取代已經(jīng)死去的神經(jīng)細(xì)胞，從而成為與大腦的對話中毫厘不差的組成部分。美國路易斯維爾大學(xué)心臟中心主任Roberto Bolli教授曾利用僅產(chǎn)生心肌細(xì)胞的干細(xì)胞來修復(fù)心臟衰竭患者。治療前，其心臟泵血量平均僅為全身血液量的30%。治療四個月后，這一數(shù)字提升至38.5%。一年后則飆升至42.5%。

用人類基因組科學(xué)公司（Human Genome Sciences）的首席執(zhí)行官哈茲爾廷（William Haseltine）的話來說，干細(xì)胞似乎是在“提醒身體它知道如何治愈自己”。哈佛大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)家伊萬·施耐德（Evan Snyder）則稱其為“神奇的種子”。

不過，要想獲得這些神奇的種子卻并非易事。它需要數(shù)以億計(jì)的實(shí)驗(yàn)室硬件投資—其投資回報(bào)周期長達(dá)十年甚至更久，政策法律倫理巨大，風(fēng)險(xiǎn)投資家亦躊躇不前。

異度空間

不過，郭鐳卻幸運(yùn)的多。一場奇遇改變了他的命運(yùn)。

2008年3月，國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)吉林大學(xué)第二附屬醫(yī)院開展干細(xì)胞移植技術(shù)臨床應(yīng)用，郭是這一項(xiàng)目的主要負(fù)責(zé)人。這是中國首次正式批準(zhǔn)干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)入臨床應(yīng)用的單位。這可能是全球范圍內(nèi)接受干細(xì)胞臨床診療人數(shù)最多的醫(yī)院，人數(shù)可達(dá)數(shù)千人之多。

2010年12月，科技部中國生物技術(shù)發(fā)展中心官方網(wǎng)站的《“863”計(jì)劃生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域項(xiàng)目申報(bào)指南》顯示，干細(xì)胞治療技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用研究、數(shù)字化醫(yī)療工程技術(shù)開發(fā)作為主題項(xiàng)目獲得資助，而體外診斷技術(shù)產(chǎn)品開發(fā)、重大化工產(chǎn)品的先進(jìn)生物制造則作為重大項(xiàng)目獲得資助。上述4個項(xiàng)目科研經(jīng)費(fèi)高達(dá)7.87億元。

郭鐳亦一度是該項(xiàng)目最有力的申請者之一，一路闖入最后評審環(huán)節(jié)。因郭精湛的醫(yī)術(shù)，病人中不乏慕名而來者。

2011年5月，一架極致奢華的專機(jī)飛抵長春，機(jī)上有兩位尊貴的客人—沙特親王·本·圖爾基·沙特和王妃哈娜·雅德。哈娜1991年因交通意外而患有高位脊椎損傷。在來長春之前，哈娜曾在美國馬里蘭州約翰霍普金斯醫(yī)院進(jìn)行診治，后者連續(xù)20年名列全美最佳醫(yī)院榜首。但哈娜治療效果卻并不理想，需要借助呼吸機(jī)，靜脈營養(yǎng)維持生命。

郭鐳為哈娜制定嚴(yán)格的干細(xì)胞治療方案。經(jīng)過近80天的診療，哈娜先后接受了十余次干細(xì)胞移植，病情得到顯著緩解。離開長春時，她已脫離呼吸機(jī)正常呼吸，正常吞咽食物，借助助步器直立行走。

彼時，偉東集團(tuán)有限責(zé)任公司董事長、融銀資本投資管理有限公司董事長王端瑞正在吉林省負(fù)責(zé)一個基金。王端端所居住的香格里拉飯店亦是沙特王族下榻的飯店，倍感好奇的王端端向郭提出試用干細(xì)胞的請求。不久前，王端端曾在美國邁阿密被灼傷眼睛，看東西如墜霧中，后經(jīng)檢查得知其眼球過早老化，這種病在正常人中只有千分之幾的可逆概率，有失明之憂。郭在三個月內(nèi)為王端端注射三針干細(xì)胞，后者眼睛很快出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。

這一神奇經(jīng)歷吸引了王端端，由此對干細(xì)胞著迷。

提取這些干細(xì)胞并非易事。在郭鐳的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，你能看到如下場景：身穿白大褂的技術(shù)人員將營養(yǎng)液從移液管中滴至皮氏培養(yǎng)皿中—數(shù)以千計(jì)的培養(yǎng)皿被儲存在小冰箱里。要想進(jìn)入它們的地盤，你必須潔凈全身，身著無菌服。這里的人擔(dān)心的是闖入者會讓細(xì)胞感染病菌，而不是相反?！斑@可能是你在地球上能進(jìn)入的最潔凈的地方?！蓖醵硕烁嬖V《環(huán)球企業(yè)家》。

保證干細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一就是實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施的規(guī)劃與數(shù)據(jù)化建設(shè)。為了確保質(zhì)量，郭鐳必須對以下要素進(jìn)行控制：標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的操作程序、極其苛刻的人員管理、科學(xué)規(guī)范的數(shù)據(jù)采集，分析，挖掘程序等等。其管理流程全部由云中心數(shù)據(jù)支持。

從昂貴的電子顯微鏡中看過去，其中一些培養(yǎng)皿中的梭形旋渦狀物質(zhì)看似假睫毛一樣漂在粉紅色水中，另一些則像被壓扁的蟲卵。其實(shí)，粉紅色液體是氨基酸、細(xì)胞因子等營養(yǎng)物質(zhì)，而“蟲卵”則是從“假睫毛”中生長的神經(jīng)干細(xì)胞。這些細(xì)胞正在圣釋實(shí)驗(yàn)室中大量培育，以便取代由于病變受損的神經(jīng)細(xì)胞，治療帕金森綜合癥、老年癡呆癥等。

實(shí)驗(yàn)室彷佛一個與世隔絕的容器，內(nèi)部空氣負(fù)壓為8至10兆帕以避免外部氣體溢入。地板用沒有任何接縫的特殊材質(zhì)制成，用于打掃地面的水需蒸餾凈化兩次，用于清理實(shí)驗(yàn)操作臺面的超純水則還需加入過氧乙酸、新潔爾滅等消毒材料，價(jià)值數(shù)十萬的制水機(jī)占地相當(dāng)于一輛邁騰轎車的占地面積，其材質(zhì)亦為316不銹鋼—通常這種材料被用來制作手術(shù)刀。

其中，風(fēng)淋室、細(xì)胞培養(yǎng)室可達(dá)萬級潔凈，小于0.3微米粒徑的微塵數(shù)量被嚴(yán)格控制在每立方米1萬個以內(nèi)，走廊內(nèi)則是十萬級潔凈，操作臺則是百級。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的空氣亦經(jīng)過三層過濾，特制的空氣濾網(wǎng)每45天即會更換一次。周圍則是精密設(shè)備。比如熱電CO2培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、COBE Spectra 血細(xì)胞分離機(jī)、Millipore Quotation超純水處理系統(tǒng)、Eppendoref微量移液器、尼康倒置顯微鏡等。這些設(shè)備價(jià)值不菲，僅一臺流式細(xì)胞儀其售價(jià)就高達(dá)數(shù)百萬元。

在這里，制造干細(xì)胞的原料是臍帶組織，由一些合作醫(yī)院提供。當(dāng)孕婦生育完成后，臍帶必須在三個小時以內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。超過此時間則被廢棄。為了保持其活性，這些細(xì)胞被冷凍在-196℃的液氮中。不過，別指望解凍復(fù)蘇后很快就會培養(yǎng)出大量的細(xì)胞，即使小心翼翼，亦只有0.1%到1%的細(xì)胞能夠存活下來。

實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人梁素麗博士每天長時間用顯微鏡觀察細(xì)胞，熟悉分化前的細(xì)胞特征，以預(yù)測下一步細(xì)胞的變化。實(shí)驗(yàn)人員每天例行的記錄內(nèi)容林林總總，包括二氧化碳?xì)獗?、耗材使用、儀器設(shè)備使用記錄、液氮量、室內(nèi)壓力、溫度、濕度等等。為了確保實(shí)驗(yàn)室的無菌操作，SCLGL實(shí)驗(yàn)室每天為實(shí)驗(yàn)員提供四套無菌制服。試劑及耗材均為符合醫(yī)療人體應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)口一次性材料，例如鑷子、試劑管、槍頭等，每天消耗量高達(dá)數(shù)百個，僅此一項(xiàng)每日花費(fèi)就達(dá)數(shù)千元?！斑@里的實(shí)驗(yàn)環(huán)境是我之前工作的單位沒法比的，你能想象在一棟別墅里做實(shí)驗(yàn)嗎？”梁素麗對《環(huán)球企業(yè)家》說。

在漩渦中

類似的干細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)曾經(jīng)招致了科學(xué)家的尖銳批評。斯坦福大學(xué)干細(xì)胞研究先驅(qū)伊夫林·魏斯曼（Irving Weissman）在《自然》雜志上與人合撰的報(bào)告里警告說：“一哄而上搞試驗(yàn)，可能會給患者造成危險(xiǎn)。”魏斯曼認(rèn)為，對干細(xì)胞的臨床應(yīng)用操之過急的醫(yī)生猶如莽撞的牛仔。

郭鐳亦認(rèn)為上述質(zhì)疑不無道理。時至今日，臨床醫(yī)生們并不知曉干細(xì)胞究竟應(yīng)該如何應(yīng)用才能讓治療效果穩(wěn)定，甚至最好，從細(xì)胞種類、細(xì)胞質(zhì)量、細(xì)胞活性單位、移植周期到病人臨床化驗(yàn)指標(biāo)等均不確定。就連哪種移植方式效果最好，亦無公認(rèn)做法—比如治療肝病，是單純靜脈注射？肝動脈介入？還是門靜脈介入？臨床醫(yī)生頗感犯難。最激烈的批評是針對胚胎干細(xì)胞的—分離人體胚胎干細(xì)胞必須破壞早期胚胎。而臍帶干細(xì)胞引發(fā)的宗教和倫理問題則小得多。

干細(xì)胞療法市場的主角顯然是郭鐳這樣的醫(yī)生。越來越多的研究者競相加入這場全球性的科研競賽。全球干細(xì)胞醫(yī)療領(lǐng)域是一個兩年內(nèi)有著800億美元發(fā)展?jié)撃艿摹敖鸬V”。而未來5年，中國干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)規(guī)模將會從目前的20億元增長到300億元，年均增長率達(dá)170%。

長期以來，對這一領(lǐng)域的研究執(zhí)牛耳者是美國，其論文數(shù)量是排名第二的日本的3.92倍，美國專利總數(shù)占全球總量的56.77%，而中國專利排名僅為第七名。全球前20位頂級研究機(jī)構(gòu)中，其中16家為美國所有，3家為日本所有，1家為加拿大所有。

現(xiàn)在，中國人試圖扳回一局，亦將干細(xì)胞研究上升為國家戰(zhàn)略。僅“十一五”期間，中國通過973計(jì)劃、863計(jì)劃、發(fā)育與生殖國家研究重大科學(xué)研究計(jì)劃和國家自然科學(xué)基金等給予其重點(diǎn)投入。

與西方研究多集中于基礎(chǔ)性研究不同，而中國的獨(dú)特優(yōu)勢在于臨床經(jīng)驗(yàn)。頗具諷刺意味的是這“得益”于中國糟糕的醫(yī)療監(jiān)管環(huán)境以及管理的滯后。一些醫(yī)療機(jī)構(gòu)已經(jīng)急不可耐地將干細(xì)胞應(yīng)用到臨床治療當(dāng)中。在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈鞣结t(yī)學(xué)界，如此草率的應(yīng)用并不合理。但空白的監(jiān)管灰色地帶正促使許多病人飛往中國接受干細(xì)胞治療，有時甚至演變?yōu)閺仡^徹尾的醫(yī)療欺詐。

早在2007年，國家食品與藥品監(jiān)督管理局基本停止了干細(xì)胞藥物的審評工作，而對于干細(xì)胞臨床治療的應(yīng)用和監(jiān)管卻并無規(guī)定?！皣覉?zhí)業(yè)醫(yī)師法允許醫(yī)院可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療，許多搞干細(xì)胞的就鉆了空子?！罢f句實(shí)話這種情況蠻嚴(yán)重的，很多上海地區(qū)大醫(yī)院都沒有放開，小的醫(yī)院卻在隨便做?！鄙虾ｉL海醫(yī)院干細(xì)胞研究中心副主任付強(qiáng)對《環(huán)球企業(yè)家》說。 2009年，衛(wèi)生部將干細(xì)胞技術(shù)歸入“第三類醫(yī)療技術(shù)”，指其“涉及重大倫理問題，安全性、有效性尚需經(jīng)規(guī)范的臨床試驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證”，并要求若用于臨床治療，須經(jīng)衛(wèi)生部審批。

2012年1月，中國衛(wèi)生部下令停止所有未經(jīng)批準(zhǔn)的干細(xì)胞臨床項(xiàng)目。

但上述規(guī)定并未有效執(zhí)行?！皝y象背后還是利益因素，一方面是病人需求與醫(yī)院盈利驅(qū)動，另一方面源于中國傳統(tǒng)中醫(yī)文化對‘偏方’的容忍度較高，干細(xì)胞走的是非正常藥品的開發(fā)途徑，用類似中醫(yī)驗(yàn)方手法和氛圍在做?！敝锌圃簞游锔杉?xì)胞研究所主任胡寶洋說。

國家干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心主任韓忠朝亦稱中國干細(xì)胞之“亂”，最顯著的癥狀就是“被嚴(yán)重?cái)U(kuò)大使用了”。此外，還有費(fèi)用高昂、資質(zhì)缺失、質(zhì)量失控等問題。

此外，學(xué)術(shù)界對干細(xì)胞安全性亦有疑慮，稱其可能會引發(fā)致癌基因的活性—在京都大學(xué)以老鼠為對象的試驗(yàn)中，有20%產(chǎn)生了腫瘤?！叭伺c老鼠還是很很大區(qū)別的。干細(xì)胞質(zhì)量若規(guī)范化控制，幾乎是零風(fēng)險(xiǎn)?！惫D對《環(huán)球企業(yè)家》說。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，郭鐳則身體力行—他靜脈注射干細(xì)胞已超過五年，至今無礙。不過，胡寶洋卻并不這么看?！艾F(xiàn)有干細(xì)胞的安全性都是基于非正常途徑獲得數(shù)據(jù)，病人治療后的癌癥及癌癥風(fēng)險(xiǎn)尚不好說，畢竟現(xiàn)有的跟蹤研究還不夠的，而風(fēng)險(xiǎn)并不會長期阻止干細(xì)胞走向臨床試驗(yàn)?！焙f。

改變

“若要了解干細(xì)胞療法的所有好處，就必須解決一些緊迫問題： 哪些細(xì)胞能派上用場？怎樣和何時植入這些細(xì)胞效果最好？對哪些患者最適用？除非懂得干細(xì)胞療法的臨床醫(yī)生們能更好地理解其對病患究竟做了些什么，否則這些疑問無解?！惫D說。

郭希望圣釋能改變這一切。“每個養(yǎng)細(xì)胞的人都知道，要確保干細(xì)質(zhì)量恒定，養(yǎng)干細(xì)胞比養(yǎng)孩子都難?！惫D說。首當(dāng)其沖的是確保原料安全性，即臍帶原料是否攜帶肝病、甲乙丙肝、愛滋病以及基因染色體圖譜是否存在缺陷等。一旦確認(rèn)合格，醫(yī)院會讓孕婦對所有檢查結(jié)果簽字確認(rèn)，告知并簽署臍帶處理同意書。此外，圣釋在干細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程中、冷凍保存前、移植應(yīng)用前會進(jìn)行總計(jì)六次安全性檢測。為了確保萬無一失，其中三次為外檢。

其次是細(xì)胞形態(tài)及質(zhì)量。區(qū)分細(xì)胞質(zhì)量和活性需要諸多數(shù)據(jù)，涉及分子水平、蛋白水平、基因水平、染色體水平、細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞活性、分化能力等六個方面。研發(fā)人員可以鎖定某種細(xì)胞治療某種病，并研究出分離及檢驗(yàn)方法，圣釋會在干細(xì)胞培養(yǎng)的每個階段拍攝細(xì)胞形態(tài)的照片，記錄其生長細(xì)節(jié)。行業(yè)內(nèi)對細(xì)胞功能性檢測通常不到5項(xiàng)，而圣釋則多達(dá)42項(xiàng)?！拔乙竺恳徊蕉甲鰯?shù)據(jù)分析，按照標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的流程操作，確保干細(xì)胞活性恒定。”郭說。圣釋對細(xì)胞活性要求嚴(yán)格，其存活率要在95%之上。

干細(xì)胞生長周期長短各異，短則兩天，長則一個月甚至更久。期間影響細(xì)胞生長質(zhì)量的要素頗多，若想實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的安全有效、活性恒定頗為艱難。既要保證細(xì)胞的活性，又得阻止它們發(fā)育。這是一個障礙重重的世界，

只要在郭鐳的實(shí)驗(yàn)室里待上幾個小時，你就會了解干細(xì)胞科學(xué)家將要忍受多么大的幽閉恐怖。實(shí)驗(yàn)室里擁擠不堪，你必須從一群實(shí)驗(yàn)人員中擠出一條縫來，還得小心別碰倒旁邊的顯微鏡以及各種試劑。為確保適宜的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，僅空氣處理凈化程序就極為復(fù)雜，空氣必須經(jīng)過氣流—初效空氣處理—空調(diào)—中效空氣處理—風(fēng)機(jī)送風(fēng)—凈化管道—高效送風(fēng)口—潔凈室—帶走塵?！仫L(fēng)夾道—新風(fēng)、初效空氣處理，并輔以臭氧消毒，如此重復(fù)以實(shí)現(xiàn)空氣凈化。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，抽風(fēng)機(jī)、過濾空調(diào)的噪聲巨大，此外，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室里空氣溫度恒定，長年維持60-80%的濕度，不見陽光，這種感覺梁素麗將其形容為“西安夏天最悶熱時的感覺”。

通常，每次試驗(yàn)短則三個小時，長則持續(xù)十二個小時?！白蠲Φ臅r候，你必須沒日沒夜都在實(shí)驗(yàn)室呆著。”梁素麗說，“你必須訓(xùn)練一個助手在自己生病或休假的時候來培養(yǎng)細(xì)胞。一個人單獨(dú)做這份工作實(shí)在是太費(fèi)心了?！?/p>

在梁看來，郭鐳的最大優(yōu)勢在于其是臨床醫(yī)生與實(shí)驗(yàn)室科學(xué)家的混合體。“你在中科院找一個年紀(jì)差不多培養(yǎng)干細(xì)胞的人，可能比郭厲害，但他做的細(xì)胞敢不敢在臨床上用，給什么疾病的用，要注意哪些注意事項(xiàng)，怎么去規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)？他不知道。”王端端解釋說。

細(xì)胞培養(yǎng)一半靠理論，一半靠經(jīng)驗(yàn)。王端端認(rèn)為若將其產(chǎn)業(yè)化，僅憑經(jīng)驗(yàn)是不行的，一個頗為大膽的想法是借助計(jì)算機(jī)控制干細(xì)胞的培養(yǎng)周期、質(zhì)量控制、活性單位等具體生長指標(biāo)，結(jié)合診療者的生理性、病理性檢測指標(biāo)，用計(jì)算機(jī)處理海量信息數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，建立干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。

對于特殊疾病治療來說，臨床實(shí)踐尤為重要。郭鐳選擇與有治療特長的三級甲等醫(yī)院進(jìn)行研究合作，例如北京大學(xué)第一附屬醫(yī)院、總醫(yī)院等?！八鼈儗Σ∪说呐袛唷⒎e累及治療效果往往更科學(xué)?！惫D說。

圣釋要求專家組成員必須具備副教授以上的職稱，以便對干細(xì)胞治療過程中的反應(yīng)做出正確判斷。干細(xì)胞并非注射后一勞永逸，會被疾病“清洗”，清洗時間長短因人而異，治療時間間隔亦各不相同。經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床醫(yī)生根據(jù)患者各項(xiàng)指標(biāo)判定療效，確定再次注射的時間。只要出現(xiàn)任何異常反應(yīng)，醫(yī)生應(yīng)將其完整記錄。如遇困難，專家成員則對癥狀、體征及化驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行會診，并確定用藥方法。整個治療過程會被整合到數(shù)據(jù)庫。以幫助醫(yī)生調(diào)整治療準(zhǔn)確度。

“所謂風(fēng)險(xiǎn)就是認(rèn)知的風(fēng)險(xiǎn)，”郭鐳估計(jì)超過60%的醫(yī)生對干細(xì)胞并還不了解亦不認(rèn)可。例如在注射干細(xì)胞前是否需要為病人麻醉，外科大夫們并不知曉。

時至今日，郭鐳本人已親身經(jīng)歷過超過千例臨床治療過程?！搬槍δ承┨囟膊?，未來干細(xì)胞診療也許會替代傳統(tǒng)的藥物治療，成為全新的第三類診療技術(shù)。數(shù)據(jù)化、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室是干細(xì)胞臨床應(yīng)用必要前提。”郭說。

這一構(gòu)想最終得到王端端的支持。“一個科研項(xiàng)目能與臨床研究結(jié)合，并用臨床的數(shù)據(jù)支持實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)采集，我認(rèn)為這個商業(yè)模型太好了?！蓖醵硕苏f。

在王端端的支持下，在此后的兩年間，王端端、郭鐳前往世界各地考察各大實(shí)驗(yàn)室。王端端主要觀察實(shí)驗(yàn)室如何服務(wù)于企業(yè)及商業(yè)化，郭則看實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化管理、數(shù)據(jù)化的深度挖掘及先進(jìn)設(shè)備儀器。。令王端端印象最深的是以色列的一家實(shí)驗(yàn)室，其實(shí)驗(yàn)設(shè)備的人性化程度令人贊嘆不已。例如椅子的大小、高低、寬窄及材料等均依照實(shí)驗(yàn)室人員體型定制?！耙粋€真正頂級的實(shí)驗(yàn)室一定是服務(wù)于人的，如果能為人創(chuàng)造出舒適的環(huán)境，他就能創(chuàng)造出偉大的作品?！蓖醵硕烁锌恼f。

回國之后，兩人展開了分工。王端端負(fù)責(zé)搭建IT系統(tǒng)，郭則負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室硬件及標(biāo)準(zhǔn)化流程。圣釋花費(fèi)巨資邀請德國公司依照全球藥廠的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行流程梳理，并請專業(yè)設(shè)計(jì)公司提供實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并施工。

最棘手難題在建立一套與現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室環(huán)境相匹配的運(yùn)營數(shù)據(jù)化體系。郭鐳希望將云計(jì)算和原材料管理BOM系統(tǒng)軟件引入實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞管理，同時開發(fā)了干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、凍存管理、干細(xì)胞運(yùn)營管理、公司財(cái)務(wù)管理、干細(xì)胞診療、電子病歷及數(shù)據(jù)挖掘分析統(tǒng)計(jì)等系統(tǒng)軟件。“未來行業(yè)的競爭，就是數(shù)據(jù)化管理、標(biāo)準(zhǔn)制訂和專業(yè)服務(wù)。最有價(jià)值的不是產(chǎn)品本身而是數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)。海量的數(shù)據(jù)和科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)就意味著發(fā)言權(quán)?！蓖醵硕苏f。

不過，若想從疾病治療中賺到真金白銀并非易事。目前干細(xì)胞的市場化尚處初期，一些業(yè)內(nèi)人士稱干細(xì)胞治療至少需要5至10年才能實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。

“我感覺現(xiàn)在是黎明前最黑暗的時候，這個行業(yè)的人都很迷茫，不知道下一步該怎么弄。

也許大突破就在最近幾年會發(fā)生。“付強(qiáng)說。

歐美的情況亦不樂觀。2011年，干細(xì)胞醫(yī)療先鋒美國Geron公司曾決定退出對干細(xì)胞用于治療脊髓損傷造成的癱瘓者的研究項(xiàng)目。就商業(yè)化產(chǎn)品而言，目前尚無干細(xì)胞治療藥品獲得美國食品藥品管理局的批準(zhǔn)。

這與美國苛刻的醫(yī)療監(jiān)管體系有關(guān)。例如Geron若想申請臨床試驗(yàn)，必須有足夠的動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明其安全性才行，其申請材料厚度可達(dá)數(shù)尺。而中國的監(jiān)管寬松程度令人瞠目結(jié)舌?！按蠖鄶?shù)的情況是不做動物實(shí)驗(yàn)，就直接臨床了?！焙鷮氀笳f。

改變或?qū)l(fā)生。2011年10月，科技部會同中科院、自然科學(xué)基金會等部門在北京召開了第一屆國家干細(xì)胞研究指導(dǎo)協(xié)調(diào)委員會成立大會。胡寶洋透露今年兩會前后，中國有可能出臺干細(xì)胞的相關(guān)監(jiān)管條例，并對干細(xì)胞醫(yī)院臨床資質(zhì)、實(shí)驗(yàn)要求等實(shí)行準(zhǔn)入制。

“未來最大的風(fēng)險(xiǎn)就是你管理的不夠嚴(yán)格，質(zhì)量出問題”。王端端說。不過，在紛繁復(fù)雜用于治療疾病的臨床試驗(yàn)之外，亦有最便捷變現(xiàn)之道—將干細(xì)胞引入高端人群的保健領(lǐng)域。在圣釋實(shí)驗(yàn)室旁側(cè)，一棟別墅已被改建為康復(fù)病房，病人在經(jīng)過仔細(xì)檢查之后會被注射干細(xì)胞。

這一生意正處于監(jiān)管盲區(qū)之中—國家并未對干細(xì)胞保健從業(yè)資質(zhì)有過詳細(xì)且可行的限定?！皬寞熜峡创_實(shí)很明顯，但干細(xì)胞到底通過什么途徑實(shí)現(xiàn)的，科學(xué)家尚不清楚。效果是肯定的，原因和機(jī)制不明白，這種情況政府如何監(jiān)管？我也說不出來，只能走一步看一步?！焙鷮氀髮Α董h(huán)球企業(yè)家》說。

圣釋甚至吸引了超豪華酒店悅榕莊的注意。悅榕莊品牌及創(chuàng)始人何光平、張齊娥夫婦在2011年元旦曾放棄歐洲度假之旅，專程飛往長春。在參觀郭鐳的干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之后，何光平夫婦與王端端談及將干細(xì)胞與SPA產(chǎn)品融合的事宜。當(dāng)年9月，悅榕莊即與圣釋簽訂正式合作協(xié)議，計(jì)劃將干細(xì)胞診療融入悅榕莊SPA產(chǎn)品中。2014年，吉林悅榕莊將成為第一家引入干細(xì)胞診療的酒店，還將擴(kuò)展到10家。

不過，眼下可不是舉杯慶賀的時候。兩場突如其來的變故差點(diǎn)毀了這一切。在過去一年，圣釋曾不止一次卷入商業(yè)間諜案中，實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)險(xiǎn)些泄密，實(shí)驗(yàn)室電腦及移動硬盤亦兩次被盜。公安機(jī)關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示此事乃內(nèi)部員工所為，后者竟是競爭對手安插的臥底。幾名員工因此鋃鐺入獄。

篇10

此前，為了研究未經(jīng)批準(zhǔn)的干細(xì)胞系，研究人員不得不建立獨(dú)立的、私人融資性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室，然后還要經(jīng)過一系列繁瑣的會計(jì)程序，以確保聯(lián)邦撥款的每一分錢都不會用在干細(xì)胞研究中。但這樣的情況不會再繼續(xù)下去了。取消禁令“將給這一領(lǐng)域和其他領(lǐng)域的研究人員大開方便之門?！迸f金山加利福尼亞大學(xué)的干細(xì)胞研究人員阿諾德 克里格斯汀作如上表示。

喬治?Q?戴利博士在波士頓兒童醫(yī)院研究兒童血液病，他說，他利用私人資金進(jìn)行研究，已獲得15條人類干細(xì)胞株，如今他首次可以向美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)申請撥款來研究這些干細(xì)胞。

奧巴馬總統(tǒng)支持胚胎干細(xì)胞研究的時機(jī)正與世界干細(xì)胞研究取得重大進(jìn)展的背景不謀而合，日本生物學(xué)家山中伸彌在2007年發(fā)現(xiàn)，成體細(xì)胞能夠重新編程回到胚胎狀態(tài)，其容易程度令人驚訝。這項(xiàng)技術(shù)“有可能最終使得胚胎干細(xì)胞用于治療和診斷的技術(shù)變得相形見絀?！备杉?xì)胞用于治療的前景雖然還很遙遠(yuǎn)，但如果能用病人自己的身體細(xì)胞進(jìn)行治療，可避免免疫排斥問題。

美國一些國會議員和其他一些倡導(dǎo)與疾病作斗爭人士一直看好人類胚胎干細(xì)胞研究，認(rèn)為它是快速治愈一些頑固性疾病的可靠途徑。

但在私下里，許多研究人員的胚胎干細(xì)胞研究目標(biāo)定得還是比較實(shí)際，他們主要的興趣在于從一些特定疾病的患者那里獲得胚胎干細(xì)胞系，通過跟蹤觀察這些細(xì)胞在試管內(nèi)的生長情況了解疾病如何發(fā)展的基本知識。

盡管美國杰龍生物醫(yī)藥公司利用人體胚胎干細(xì)胞醫(yī)治脊髓損傷病人的試驗(yàn)已在今年1月獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)，許多科學(xué)家還是認(rèn)為，把干細(xì)胞衍生的組織移植到患者體內(nèi)還有很長的路要走。胚胎干細(xì)胞有其自身缺陷，它們易產(chǎn)生腫瘤，從干細(xì)胞中分離出來的成體細(xì)胞有可能會受到患者自身免疫系統(tǒng)的排斥。此外，無論是什么樣的疾病過程造成了病人組織細(xì)胞的死亡，也同樣有可能殺死外來移植的細(xì)胞。所有這些問題也許都有可能得到解決，但至今為止還沒有一個得到解決。

克林頓總統(tǒng)曾過允許NI H給研究員提供資金研究人體胚胎干細(xì)胞的設(shè)想，但一直沒實(shí)行這項(xiàng)政策，直到2001年8月才開始有了這方面的研究，當(dāng)時的美國總統(tǒng)布什尋求以一種不同的方式同避國會對干細(xì)胞研究的限制，規(guī)定研究人員可以使用在此之前獲得的干細(xì)胞系進(jìn)行研究。

奧巴馬將克林頓當(dāng)年提議的政策付諸實(shí)行，但美舊國會的限制依然存在。研究人員仍然禁止使用聯(lián)邦資金來獲得新的人類胚胎干細(xì)胞系。不過，他們將被允許對私人投資實(shí)驗(yàn)室里培養(yǎng)出來的新的干細(xì)胞系進(jìn)行研究。