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篇1

關鍵詞：固態(tài)發(fā)酵；單細胞蛋白；影響因素；單菌；混合菌

中圖分類號 S816.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）19-105-04

Study on the Process of Producing Single Cell Protein Feed by the Skin of Grapefruit

Zhang Haitao1，2 et al.

（1 Hunan Agricultural University，Changsha 41000，China；2 Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou 425000，China）

Abstract：Taking grapefruit bran as raw material，koningii，white mold，yeast，geotrichum as fermentation bacteria.through the standard curve with ovalbumin and Biuret reagent. the paper probed the single cell protein content after solid-state fermentation of single strain and mixed strain. It was found that the combination of Geotrichum with koningii has the best fermentation effect，and after 7d fermentation the medium content 8.060g protein，accounting for about 19% of the dry weight of the medium.Fermentation affected by the temperature，pH，inoculum size，medium’s water content. The orthogonal experiment showed that the combination of Geotrichum with koningii ’s best fermentation condition ，the optimum pH value is 5.5，the optimum fermentation temperature is 25℃，the optimum inoculation amount is 15%，the optimum medium moisture content is 65%. The impact of various factors on fermentation is fermentation temperature>medium’s water content> inoculation amount>pH.

Key words： Solid state fermentation；Single cell protein；Influencing factors；Single strain；Mixed strain

傳統柚子果實加工后剩下的大量柚子皮往往被隨意丟棄或集中作一般處理，對環(huán)境造成污染的同時也造成了資源浪費。研究表明，柚子皮中含有5%的果膠，還含有豐富的油皮苷、胡蘿卜素、VB、VC、VP以及有機酸和高級醇，并且可以提取精油、柚苷[1]，因此柚子皮可以作為一種發(fā)酵基質，為微生物的生長提供豐富的營養(yǎng)成分。單細胞蛋白所含的物質成分豐富，被廣泛用于飼料加工中，通過柚子皮渣固態(tài)發(fā)酵來生產單細胞蛋白，從而提高柚子皮中粗蛋白含量，使柚子皮作為一種飼料供動物食用，同時解決了廢棄柚子皮渣對環(huán)境的污染，具有良好的社會效益和經濟效益。本研究以柚子皮渣為原料，以白地霉、酵母菌、產朊假絲酵母、康寧木霉單菌種以及它們的混合菌種為發(fā)酵菌種[2]，篩選出最佳混菌組合以及最佳發(fā)酵條件，對提高柚子皮渣固態(tài)發(fā)酵效率和粗蛋白產量，以及保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 （1）牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基：在燒杯內加蒸餾水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g，瓊脂1.5g。燒杯外標記，加熱溶解后加入瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值為5.0～6.5，分裝在各個試管內，高壓蒸汽鍋內121℃滅菌30min，室溫后倒入試管制成斜面（8個），冷卻后保存?zhèn)溆谩＃?）液體牛肉膏培養(yǎng)基制備：在燒杯內加蒸餾水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g。燒杯外標記，加熱溶解，補足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值為5.0～6.5，分裝于8個三角瓶中，高壓蒸汽鍋內121℃滅菌30min，冷卻至室溫后備用。（3）柚子皮渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備：柚皮渣80g，麩皮20g，尿素1.5g，硫酸銨1.5g，磷酸氫二鉀0.6g，硫酸鎂0.05g，水65～70g，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調pH值為5.0～6.5，高壓蒸汽鍋內121℃滅菌20min。

1.1.2 主要試劑與儀器 硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂為分析純，購于上海永葉生物科技有限公司；其它化學試劑均為分析純。TG16C/TG16臺式高速離心機，PHS-802中文臺式酸度計，722型分光光度計等。

1.1.3 菌種 4株菌株都為真菌，分別為白地霉（Geotrichum candidum）；產朊假絲酵母（Candida utilis）；康寧木霉（Corning Trichoderma）；酵母菌（Yeast）。從武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）購買，放冰箱冷凍保藏備用。

1.1.4 柚皮渣與麩皮來源 柚子為江永的香柚，將柚子洗干凈剝開，取其柚子皮（果實以外的部分）用刀切成小塊狀，然后放入干燥箱里烘干至恒量，用研缽研碎，過100目篩，放干燥處室溫保存?zhèn)溆谩Ｋ玫柠熎挠乐菔辛懔陞^(qū)的農產品市場購買，然后經過20目篩篩選后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 雙縮脲試劑的配制 將1g氫氧化鈉溶于10mL水中，制成雙縮脲試劑A；將0.1g硫酸銅溶于10mL水中，制成雙縮脲試劑B。

1.2.2 菌種的活化與保藏 將冷凍保存的4菌株接種于4個斜面培養(yǎng)基上活化，在22～35℃條件下培養(yǎng)48h，再將斜面菌種挑取一環(huán)接于液體試管培養(yǎng)基中，22～35℃培養(yǎng)48h，作為一級種子培養(yǎng)基；以10%接種量接入裝液量20mL/50mL于三角瓶液體培養(yǎng)基中，于22～35℃ 240r?min-1振蕩培養(yǎng)24h，作為二級種子培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 標準曲線的制作 用卵清蛋白作為標準樣品制作標準曲線。準確稱取卵清蛋白，以蒸餾水為溶液配制成2.0mg?mL-1的蛋白質溶液，取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL分別注入7支比試管中，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B，在15～25℃下放置30min，以介質溶液調零，測定標準液在560nm處的吸光度。

1.2.4 單菌種的發(fā)酵 用移液槍分別取4種二級種子培養(yǎng)液各4mL接種于4個不同的已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時更換一次槍頭），置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，以粗蛋白質含量為檢測指標，分析各個菌種發(fā)酵前后產物中蛋白質含量的變化情況。

1.2.5 組合菌株的發(fā)酵 （1）雙菌種的發(fā)酵。將4菌株分別“兩兩組合”，同時按1∶1的比例各取2mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，記錄數據。（2）3菌種的發(fā)酵。將4菌株分別“三三組合”，同時按1∶1∶1的比例各取1.3mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，記錄數據。（3）4菌種的發(fā)酵。將4菌株分別按1∶1∶1∶1的比例各取1mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同種菌種時更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒量。

1.2.6 粗蛋白質含量的測定 （1）單菌種發(fā)酵培養(yǎng)皿中粗蛋白質含量的測定：從單菌種發(fā)酵的4個培養(yǎng)皿中取烘干之后的培養(yǎng)物各5g，分別用研缽研碎后倒入試管中，然后滴加95%乙醇，搖晃試管5min，取上清液于離心管中，反復3次，離心完成之后倒掉液體，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），搖晃離心管，然后將雙縮脲倒入分光光度計玻璃柱中進行檢測。（2）組合菌種發(fā)酵培養(yǎng)皿中粗蛋白質含量的測定：從組合菌種發(fā)酵的4個培養(yǎng)皿中取烘干之后的培養(yǎng)物各5g，分別用研缽研碎后倒入試管當中，然后滴加95%乙醇，搖晃試管5min，取上清液于離心管中，反復3次，離心完成后倒掉液體，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），搖晃離心管，然后將雙縮脲倒入分光光度計玻璃柱中進行檢測。

1.2.7 發(fā)酵因子對最佳菌種組合產粗蛋白質量的影響[3-4]

1.2.7.1 發(fā)酵溫度 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉菌溶液各2mL混合，平均加入到7個已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中，分別放入溫度為10、15、20、25、30、35、40℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測不同溫度產物中蛋白質含量。

1.2.7.2 發(fā)酵pH值 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液各2mL混合，平均加入到7個已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中，分別調節(jié)pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5后放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測不同pH值條件下產物中蛋白質含量。

1.2.7.3 接種量 按照1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液分別以接種量10%、15%、20%、25%、30%對固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基進行發(fā)酵，調pH值為5.5，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測產物中蛋白質含量。

1.2.7.4 培養(yǎng)基的含水量 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液各2mL，平均加入到7個已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中（pH值為5.5），分別調節(jié)培養(yǎng)中的含水量為50%、55%、60%、65%、70%，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測產物中蛋白質含量。

1.2.8 正交實驗 發(fā)酵溫度、pH值、接種量、培養(yǎng)基的含水量都對菌種的生長代謝產生影響，通過取4因素（溫度、pH、目篩目數、含水量）3水平的正交實驗來確定最佳發(fā)酵條件組合[5]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 用卵清蛋白作為標準樣品來制作標準曲線，通過計算稱量后，準確稱取卵清蛋白，以蒸餾水為溶液配制成2mg?mL-1的蛋白質溶液，分別取出0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL注入7支比試管中，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），在15～25℃下放置30min，調零，測定560nm處的吸光度依次為0、0.182、0.311、0.453、0.581、0.705、0.837，根據數據繪制標準曲線，如圖1所示。

[y=0.4556x+0.0284

R2=0.9969][標準蛋白質溶液體積（mL）][吸光度（A）][1

0.8

0.6

0.4

0.2

0][0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1]

圖1 標準曲線

2.2 粗蛋白質的檢測結果 根據測得的吸光度通過標準曲線計算出待測液濃度值，經換算可得粗蛋白產量。

2.2.1 單菌種發(fā)酵后粗蛋白的檢測結果 康寧木霉、產阮假絲酵母、酵母菌、白地霉4菌種分別發(fā)酵后的粗蛋白含量為5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉發(fā)酵獲得的粗蛋白含量最高，達到6.316g。

2.2.2 混合菌種發(fā)酵后粗蛋白質含量的檢測結果 不同菌種混合在相同條件下發(fā)酵后的粗蛋白含量如表1所示，從表1可知，11組混合菌中，白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵產生的粗蛋白含量最高，達到8.060g。

表1 不同混菌組合發(fā)酵后產生的粗蛋白質含量

[菌種組合＼&粗蛋白質含量（g）＼&產阮假絲酵母+酵母菌＼&5.589＼&白地霉+康寧木霉＼&8.060＼&康寧木霉+酵母菌＼&5.786＼&白地霉+產阮假絲酵母＼&7.155＼&白地霉+酵母菌＼&4.098＼&康寧木霉+產阮假絲酵母＼&4.240＼&康寧木霉+產阮假絲酵母+酵母菌＼&4.125＼&康寧木霉+白地霉+酵母菌＼&5.554＼&產阮假絲酵母+酵母菌+白地霉＼&5.506＼&康寧木霉+產阮假絲酵母+白地霉＼&5.272＼&康寧木霉+產阮假絲酵母+白地霉+酵母菌＼&6.650＼&]

2.2.3 白地霉與康寧木霉混合固態(tài)發(fā)酵所產粗蛋白的影響因子分析 白地霉與康寧木霉組合在同等條件下固態(tài)發(fā)酵后所產粗蛋白含量最高，取該菌種組合進行影響因子分析，探尋該菌種組合最佳固態(tài)發(fā)酵條件。

2.2.3.1 不同溫度對發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響 分別以10、15、20、25、30、35、40℃進行分組發(fā)酵試驗，發(fā)酵后培養(yǎng)基中粗蛋白的含量如圖2所示，從圖2可知，當溫度為10～25℃時，發(fā)酵后產物中的蛋白質含量不斷增加，且溫度為25℃時，產物中粗蛋白含量為最高，達到8.46g；當溫度為25～40℃時，發(fā)酵后產物中的粗蛋白含量呈下降趨勢，且溫度在35～40℃范圍內下降得最為明顯。因此，可認定25℃為康寧木霉與白地霉菌種組合的最佳反應溫度。

[粗蛋白含量（g）][10

8

6

4

2

0][0 10 20 30 40 50][溫度（℃）][1.331][5.321][7.941][8.460][7.772][7.125][3.125]

圖2 溫度對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.2 不同pH值對發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響 pH值對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響如圖3所示。從圖3可知，該菌種組合發(fā)酵產物粗蛋白含量在pH值4～4.5以及5.5～7之間出現先增長后減少的趨勢，而在pH值為5.5時發(fā)酵后的粗蛋白產量最高，達到8.161g。因此，可得出pH5.5為康寧木霉與白地霉組合菌種的最佳反應酸堿度。

[9

8

7

6

5][粗蛋白含量（g）][4.5 5 5.5 6 6.5 7][pH值][5.321][6.941][8.161][7.027][6.125]

圖3 pH值對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.3 不同接種量對發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響 通過接種量的改變，來檢測不同接種量對發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響。從圖4可知，該組合菌種固態(tài)發(fā)酵后產物中粗蛋白產量隨著接種量的改變而改變，當接種量為15%時，最有利于發(fā)酵產物中粗蛋白的產生。

[8.4

8.2

8

7.8

7.6

7.4][粗蛋白含量（g）][10 15 20 25 30 35][接種量（%）][7.43][8.25][8.11][7.92][7.82]

圖4 接種量對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.4 不同培養(yǎng)基含水量對發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響 不同培養(yǎng)基含水量對發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響如圖5所示，從圖5可知，培養(yǎng)基含水量在50%～70%，該組合菌種發(fā)酵后產物中產粗蛋白的量都比較高，當培養(yǎng)基含水量為65%時，發(fā)酵后產物中的粗蛋白產量最高，達到8.075g。這是因為影響固態(tài)發(fā)酵速率的因素與是否有游離水的存在相關，因此基質含水量的變化對微生物的代謝與生長產生重要的影響。戴超[4]在影響固態(tài)發(fā)酵速率的因素及其控制策略中通過驗證實驗也證明了這一點，可知培養(yǎng)基含水量在65%為康寧木霉與白地霉組合菌種的最佳反應環(huán)境。

[9

8.58

7.5

7

6.5][粗蛋白含量（g）][50 55 60 65 70 75][培養(yǎng)基含水量（%）][6.845][7.883][8.102][8.705][8.012]

圖5 培養(yǎng)基含水量對地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產物中

粗蛋白含量的影響

2.4 正交實驗結果 取4因素3水平的正交實驗確定最佳發(fā)酵組合如表2所示，從表2可知，最適水平最佳配比組合為A2B2C3D2。從正交表數據可知，溫度25℃、pH值5.5、最佳接種量為15%、培養(yǎng)基含水量65%為最佳條件組合，由R值可知，各因素對發(fā)酵的影響大小為發(fā)酵溫度>培養(yǎng)基含水量>接種量>pH。

表2 4因素3水平正交實驗結果

[試驗號＼&溫度

（℃）＼&pH＼&接種量

（%）＼&培養(yǎng)基含

水量（%）＼&粗蛋白質量（g）＼&1＼&1（15）＼&1（4.5）＼&1（10）＼&1（60）＼&6.026＼&2＼&1（15）＼&2（5.5）＼&2（15）＼&2（65）＼&7.161＼&3＼&1（15）＼&3（6.5）＼&3（20）＼&3（70）＼&8.072＼&4＼&2（25）＼&1（4.5）＼&2（15）＼&3（65）＼&8.883＼&5＼&2（25）＼&2（5.5）＼&3（20）＼&1（60）＼&8.436＼&6＼&2（25）＼&3（6.5）＼&1（15）＼&2（65）＼&6.535＼&7＼&3（35）＼&1（4.5）＼&3（20）＼&2（65）＼&4.323＼&8＼&3（35）＼&2（6.5）＼&1（10）＼&3（70）＼&4.251＼&9＼&3（35）＼&3（6.5）＼&2（15）＼&1（60）＼&3.377＼&Ⅰ＼&14.564＼&13.936＼&16.812＼&17.839＼&T=57.064＼&Ⅱ＼&25.391＼&19.232＼&19.421＼&18.019＼&Ⅲ＼&11.911＼&17.984＼&20.831＼&21.206＼&K1＼&4.854＼&4.312＼&5.604＼&4.170＼&K2＼&8.463＼&6.410＼&6.474＼&6.999＼&K3＼&3.970＼&5.995＼&6.944＼&7.069＼&R＼&4.493＼&2.098＼&1.340＼&2.899＼&]

3 結論

（1）白地霉、產朊假絲酵母、康寧木霉與酵母菌分別發(fā)酵培養(yǎng)后產生的粗蛋白含量為5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉發(fā)酵后產生的粗蛋白質含量最高，達到6.316g。

（2）白地霉、產朊假絲酵母、康寧木霉與酵母菌分別進行2菌種、3菌種以及4菌種混合固態(tài)發(fā)酵，檢測固態(tài)發(fā)酵產物中發(fā)現康寧木霉與白地霉混合柚子皮渣生產蛋白質量高，達到8.060g，占培養(yǎng)基干重的19%左右。

（3）正交實驗采用3水平（溫度：A1=15℃，A2=25℃，A3=35℃；pH值：B1=4.5，B2=5.5，B3=6.5；接種量：C1=10%，C2=15%，C3=20%；培養(yǎng)基含水量：D1=60%，D2=65%，D3=70%）4因素（發(fā)酵溫度，pH，接種量，培養(yǎng)基含水量）進行設計，結果發(fā)現康寧木霉與白地霉菌種混合組最佳條件組合為A2B2C3D2，即在溫度25℃、pH5.5、接種量15%、培養(yǎng)基含水量65%的條件下最有利于柚子皮渣培養(yǎng)基的發(fā)酵。

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篇2

摘要：目的：探討人臍血單個核細胞的分離培養(yǎng)和誘導后神經干細胞標志物mRNA的表達，并觀察其致瘤性。方法：使用密度梯度離心法得到臍血單個核細胞，用體外貼壁生長的方法獲得臍血間質干細胞(MSCs)。觀察培養(yǎng)過程中臍血MSCs形態(tài)的變化，通過流式細胞儀檢測干細胞表面抗原的表達。使用NGF和RA聯合誘導后，用RT―PCR方法鑒定誘導前后神經干細胞(NSCs)標志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表達；收集培養(yǎng)后7d的MSCs，接種于裸鼠皮下，觀察是否有增生物的出現，并觀察細胞組織形態(tài)學變化。結果：臍血單個核細胞貼壁生長后大部分細胞呈梭形，誘導后可分化為神經元樣細胞。流式細胞儀檢測該細胞不表達CD34，CDlla和CD11b，強表達CD29，符合MSCs特征。誘導后，NSCs表面標志Nestin及Musshi-1表達明顯增強(P＜0.05)，48h達高峰，然后逐漸減弱：細胞接種后12周，在裸鼠皮下不能形成腫瘤，與對照組相比，細胞形態(tài)學未出現惡性變化。結論：臍血中存在MSCs。分離后可以體外擴增，誘導后分化為神經元樣細胞，并表達NSCs表面標志。在裸鼠體內不具有成瘤性。臍血能夠成為NSCs的新來源。

關鍵詞：臍血單個核細胞；神經干細胞；誘導分化；巢蛋白：致瘤性

中圖分類號：R741

干細胞是指具有自我更新與多向分化潛能的細胞，它們在細胞療法、基因治療、發(fā)育學研究、藥理及毒理學等研究中己顯示出無可比擬的作用和優(yōu)越性。近年來，神經干細胞fneural stem eells,NSCs)移植治療中樞神經系統疾病引起人們的普遍關注，在動物實驗中獲得了較好的療效，NSCs被認為是治療神經系統疾病的良好載體。但是，由于來源的局限，NSCs的應用受到限制。成體干細胞是存在于發(fā)育成熟個體組織中的可自我更新和分化為原組織所有細胞類型的未分化細胞。根據其發(fā)育潛能可分為全能干細胞、多胚層多能干細胞、單胚層多能干細胞和定向專能干細胞。存在于骨髓基質中的間質干細胞(mesenehymal stem cdls,MSCs)是研究最早和最為深入的一類多能干細胞，其來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有廣泛的分化潛能，已經有多項研究顯示，外源骨髓MSCs移植入腦內，可以分化為神經細胞。表達神經元特異性標志蛋白。因為臍帶血來源的MSCs和骨髓MScs有極其一致的生物學特性，且易于采集、制備及保存。免疫反應性低，因此可能更易于在臨床上使用。本研究結合密度梯度離心和體外貼壁生長的方法得到臍血MSCs，誘導后檢測其NSCs標志物Nesfin及Musashi-I的表達情況，并將培養(yǎng)后的臍血MSCs接種于裸鼠皮下，觀察臍血MSCs對裸鼠的致瘤性，為應用于組織及其功能修復中提高該細胞的生物安全性提供新的依據。

1．材料和方法

1．1主垂試劑

高糖IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴細胞分層液(Cibco公司)；RNA提取試劑Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、異丙醇為國產分析純試劑；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)；瓊脂糖(sigma公司)。

1．2實驗方法

1．2．1臍血間質干細胞的體外分離和擴增培養(yǎng)無菌條件下采集健康產婦足月妊娠順產或剖腹產的嬰兒臍帶血50～100md肝素抗凝，與0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混勻，再與3％的明膠1:1混勻，靜置60min沉降紅細胞。吸上清離心，棄上清，用PBS制成單細胞懸液，疊加到相對密度1.077的淋巴細胞分離液上，2000dr/min離心20min，取界面層，加PBS制成單細胞懸液，離心洗滌3次，棄上清。所得細胞以1.0x102／cm2(T-25培養(yǎng)瓶)的密度接種于含有15％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液(Hyclone公司，置于37℃、體積分數為5％的cm2、飽和濕度的孵箱內培養(yǎng)，3d后換液，棄去懸浮細胞，貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的改變并照相。待細胞長到80％融合時，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后傳代。

收集分離后1h、培養(yǎng)后36、48、72h和5d的細胞，離心洗滌，在顯微鏡下，臺盼藍染色、計數，調整細胞密度備用。

1．2．2流式細胞儀檢測取擴增一代的臍血間質干細胞，PBS洗滌后用2．5 WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的單細胞懸液，共7管，1號管和2號管為陰性對照，分別加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE單克隆抗體各5ml，其余5管分別加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44單抗各5m1．室溫下孵育20min，流式細胞儀檢測。

1．2．3臍血間質干細胞的誘導分化取原代細胞，加入20ng/m1 NGF和RA聯合誘導培養(yǎng)，收集誘導前，誘導后36、48、72 h、5d的細胞，調整細胞密度備用。

1．2．4 RNA提取取誘導前，誘導后36、48、72h、5d的細胞各3x106個，融于1 mlTRIZOL試劑中，用吸管反復吹打后室溫下孵育5min。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩后室溫下10min。4℃，12000r/min離心15min后將上層無色液體移入新的EP管中。加入異丙醇，室溫下放置10min，4℃，12000r/min離心10min棄去上清。加入75％乙醇，4℃，7500r/min離心5min，棄去上清液，風干，加入DEPC處理的純凈水40μl溶解后，55℃孵育15min。

1．2．5 RT-PCR采用相關軟件設計引物，并由賽百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC―TACCTCC 3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。對所提RNA進行定量，取1μgRNA轉錄成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCR buffer 1μl，RNase free H2O 3.75μl，dNTP lμ，RNase inhibor0.25μl，AMV逆轉錄酶0.5μl，oli-．go-dT接頭引物0.5μl，RNA樣品1μg，按照如下條件進行逆轉錄反應30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA進行PCR擴增。在EP管中依次加入下列物質：Taq酶0.25μl，10xPCR buffer10μl，純凈水27.75μl，

特異性上下游引物各0.5μl。內對照GAPDH上下游引物各0.5μl(30 μmol/L)，cDNA產物10μl，按照以下條件進行PCR反應。94℃預變性5min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，30個循環(huán)后，72℃延伸7min。取5μlPCR擴增產物加樣至含溴化乙錠(EB)20g/l的瓊脂糖凝膠中，在5V/cm下電泳60min，紫外透視儀下觀察結果，并用凝膠掃描成像系統照相，PCR定量分析軟件進行分析。

1．2．6致瘤性取18只BALB/C裸鼠，隨機分為3組，背部皮下組、頸部皮下組、對照組各6只。收集培養(yǎng)7d的MSCs，用PBS重懸并調整細胞密度為1x107/ml，非麻醉狀態(tài)下，于裸鼠背部及頸部皮下分別無菌注射細胞懸液0.5ml，每只各4點．注入生理鹽水作為對照組。定期觀察，于3d、2周和8周取材，制作冰凍切片，HE染色，鏡下觀察。之后繼續(xù)觀察裸鼠生長情況至12周。

1．3統計學方法

數據以x＋s表示。采用SPSSl2.0軟件對數據進行重復測量數據的分析，顯著性水準取α=0.05。

2．結果

2．1臍血單個核細胞體外分離、培養(yǎng)后形態(tài)改變

培養(yǎng)前，臍血單個核細胞胞體較小，呈大小均一的圓形，直徑約17μm，顏色較深，住高倍鏡下可見其不停振動；培養(yǎng)后，細胞胞體增大，有破骨樣細胞和梭形細胞兩種形態(tài)。破骨樣細胞胞體較大，呈圓形，多個核。梭形細胞大小不等。形態(tài)類似于骨髓MSCs，但較骨髓MSCs稍小。隨著時間的推移，破骨樣細胞減少而梭形細胞增多，即所需要的間質干細胞

2．2臍血干細胞的鑒定

流式細胞儀檢測顯示，擴增后的臍血MSCs既不表達造血干細胞的特異性表面標志CD34，也不表達內皮細胞的表面標志CD31，而CD29，CDl3，CD44等間質干細胞的表面標志均為陽性。這表明臍血MSCs是臍血中一群區(qū)別于造血細胞的處于未分化狀態(tài)的非定向干細胞。

2．3誘導后NSCs標志物的表達

Nestin和Musashi-1作為NSCs的標志物已經得到廣泛應用。通過RT-PCR檢測誘導后這兩個基因的表達，使用PCR定量分析軟件，分析各樣本的PCR光密度。將各樣本的PCR光密度值除以內參GAPDH的PCR平均光密度值，重復測量5次。結果發(fā)現Nestin RNA在誘導前細胞中低表達，誘導后36h逐漸升高(p＜0.05)，72h后開始降低(p＜0.05)：Musashi-1RNA在誘導前細胞中低表達，誘導后48h呈高表達(P＜0.05)。

2．4致瘤性

于注射后3d、2周和8周取材，肉眼觀察裸鼠背部無明顯增生物形成。組織學觀察接種3d局部有細胞團塊存在，團塊中心細胞部分壞死。2周時，細胞團塊不明顯，大部分細胞被吸收。8周時，接種區(qū)組織結構與未接種區(qū)無明顯區(qū)別。裸鼠存活12周以上，未見有腫瘤形成。與對照組比較，生長情況與皮膚狀況無明顯差別。

3．討論

NSCs具有自我更新和多分化潛能，為神經系統疾病如帕金森病、阿爾海默病、卒中的功能重建帶來了希望。無論是作為腦組織移植的供體，還是作為體內誘導分化的靶細胞，NSCs都為中樞神經系統功能重建和神經再生提供了一條新的途徑。但NSCs來源有限，不適于展開大規(guī)模臨床應用。如何獲取大量的NSC供臨床使用已成為當今干細胞研究的熱點和難點。近年發(fā)現骨髓MSCs和造血干細胞(hematopoldie stem cells，HSCs)可分化成神經細胞。由于臍血MSCs和骨髓MSCs有極其一致的生物學特性，臍血中的干細胞可能更原始，增殖分化能力更強；而且臍血來源廣泛、取材方便，所含有的干細胞數量更多。因此使用臍血干細胞定向誘導分化為NSCs用于臨床研究有廣闊的應前景。

目前國內外學者已經使用多種方法從臍血中分離干細胞，最常用的方法是利用臍血干細胞體外貼壁生長的特性，將其從造血系統細胞中分離。此外，還可利用密度梯度離心、流式細胞儀分離法和免疫磁珠等方法。最近，有學者采用負極免疫篩選及限制性稀釋的方法，分離得到臍血干細胞，使用流式細胞儀和免疫磁珠分離干細胞，操作方法復雜，花費高昂而且實驗條件要求高。本實驗結合使用密度梯度離心和體外貼壁生長的方法獲得臍血MSCs，簡單有效，成本低廉，對細胞損傷小，既適合各級實驗室進行基礎研究，也適合大規(guī)模將臍血細胞分離純化，用于臍血干細胞建庫㈣，應用于臨床。

成功分離臍血干細胞后，使用NGF和RA聯合誘導培養(yǎng)，用RT-PCR和免疫組織化學法檢測神經干細胞表面標志物巢蛋白(Nestin)和Musashi的表達。NeSin最早由Lendahl等發(fā)現，其表達始于神經胚形成時，當神經細胞遷移基本完成后，巢蛋白的表達量逐漸減少，并隨神經細胞分化的完成而停止表達。此外，Sakakibara等亦鑒定出一種RNA結合蛋白Musashi，作為神經干細胞的標志物，Nestin和Musashi作為早期原始神經細胞的標志物已被廣泛地應用于NSCs的鑒定。本研究發(fā)現新鮮分離的臍血干細胞弱表達Nestin.不表達Musashi-I；誘導后，臍血干細胞的Nestin和Musashi-1表達域逐漸增強，48 h達到最強，進而逐漸減少。這表明臍血細胞具有向神經細胞分化的潛能。

篇3

[關鍵詞]甘草酸；甘草總黃酮；細胞因子；抗炎

甘草作為常用中藥，活性高、作用廣，具有顯著的抗炎活性[1-3]，臨床用于急慢性肝炎、支氣管炎、銀屑病和艾滋病的治療[4-8]。其中甘草酸和甘草總黃酮類化合物是其抗炎、抗變應性炎癥的主要活性成分，其抗炎作用與減少巨噬細胞炎癥介質生成與釋放關系密切 [9]。 常規(guī)研究技術如ELISA、免疫組化和Western blotting等多針對于個別蛋白質進行研究，對甘草及其有效成分的抗炎作用機制研究雖然很多，但呈現指標分散和局限的特點，缺少對其抗炎作用的系統認識。

液相蛋白芯片技術是在流式細胞技術、ELISA技術和傳統芯片技術基礎上研發(fā)的新型蛋白質研究平臺，具有同步性好、特異性強、通量大和準確性高等特性，可高通量檢測多種細胞信號分子的表達水平，非常適合于細胞因子表達的系統研究。因此，本研究利用脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞RAW264.7炎癥細胞模型[10]，應用液相蛋白芯片技術[11]，通過測定甘草酸和甘草總黃酮對該模型細胞因子表達譜的影響，對甘草酸和甘草總黃酮的抗炎作用機制進行了較為系統全面的研究。

1 材料

甘草酸（純度為98%，批號ZL201203010A）和甘草總黃酮（純度為95%，批號ZL201204010A）購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司、地塞米松磷酸鈉注射液購自天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司（國藥準字H12020514）、脂多糖（Escherichia coli O111：B4，L2630）購自美國Sigma公司、小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心、Hyclone南美胎牛血清購自美國Thermo公司、DMEM高糖細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司、Bio-Plex ProTM Mouse Cytokine 23-plex Assay購自美國Bio-Rad公司、Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系統購自美國Bio-Rad公司、小鼠IL-6 ELISA試劑盒購自北京曠博生物技術有限公司。

2 方法

2.1 藥品配置 甘草酸、甘草總黃酮和脂多糖分別溶于高糖DMEM培養(yǎng)液中，配置成質量濃度均為1 g?L-1的溶液，溶液用0.2 μm注射器式過濾器過濾，分裝保存于15 mL錐型離心管，以上操作均在超凈臺中進行。

2.2 細胞培養(yǎng) 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7用含10%胎牛血清、100 U?mL-1青霉素和100 mg?L-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃， 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液，取對數生長期生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞進行實驗。

2.3 細胞分組及處理 將細胞分為正常對照組、模型組（1 mg?L-1 LPS）、甘草酸高中低劑量組（400，80，16 mg?L-1）、甘草總黃酮高中低劑量組（200，40，8 mg?L-1）和地塞米松組（5 mg?L-1）。取對數生長期生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞進行實驗，棄去原有培養(yǎng)液，加入適量高糖DMEM培養(yǎng)液，反復輕輕吹打制成每mL含1×105個細胞的單細胞懸液。24孔細胞板每孔接種1 mL細胞懸液，培養(yǎng)24 h。依照實驗分組分別向細胞板孔加入不同濃度的甘草酸、甘草總黃酮和地塞米松，孵育4 h后再加入LPS（1 mg?L-1）。20 h后收集各組細胞培養(yǎng)上清液，凍存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

2.4 Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系統檢測細胞因子 待檢測細胞上清液樣品在室溫下完全溶解，1萬r?min-1高速冷凍離心10 min，取上清液用緩沖液1∶10稀釋。依據試劑盒說明，每孔加入50 μL抗細胞因子抗體檢測磁珠，洗滌2次，向相應孔板加入緩沖液、標準曲線樣品溶液、待檢測細胞上清液樣品。室溫下避光500 r?min-1搖床上孵育30 min，洗滌3次。依次分別加入檢測抗體50 μL和Streptavidin-PE熒光色素50 μL，操作同上。每孔用125 μL緩沖液重懸微珠，放入Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系統讀取各孔熒光強度， 并根據標準品的熒光強度計算出樣品中白介素類因子IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，IL-17，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、嗜酸細胞活化趨化因子（Eotaxin）、干擾素-γ（IFN-γ）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1） 、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬細胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、巨噬細胞炎性蛋白-1β（MIP-1β）、受調節(jié)激活的正常T細胞排泌的因子（RANTES）、小鼠角化細胞源性細胞因子（KC）共23種細胞因子的濃度。

2.5 ELISA法測定IL-6濃度 待檢測細胞上清液樣品在室溫下完全溶解，1萬r?min-1高速冷凍離心10 min，取上清液用緩沖液1∶10稀釋。按照ELISA試劑盒說明書進行測定，根據標準曲線計算各組培養(yǎng)上清液中IL-6的濃度。

2.6 統計學處理 實驗數據用±s表示，組間比較采用單因素方差檢測法進行統計學處理，P

3 結果

3.1 LPS對RAW264.7細胞表達細胞因子的影響 在正常RAW264.7細胞中，各種細胞因子均有低表達，經LPS刺激后RAW264.7細胞表達大量的細胞因子（P

3.2 甘草酸對LPS誘導RAW264.7細胞表達細胞因子的影響 甘草酸可以明顯下調LPS誘導RAW264.7細胞表達多種細胞因子，其高劑量組的作用效果優(yōu)于5 mg?L-1地塞米松組。高劑量組對IL-1β，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，Eotaxin和TNF-α的表達水平有明顯的下調作用（P

3.3 甘草總黃酮對LPS誘導RAW264.7細胞表達細胞因子的影響 結果見表1。甘草總黃酮的作用效果接近于5 mg ?L-1地塞米松，對LPS誘導RAW264.7細胞表達的2種細胞因子水平有明顯的下調作用：高劑量組能極明顯下調IL-6的表達水平 （P

3.4 ELISA法檢測藥物對LPS誘導RAW264.7細胞表達IL-6的影響 ELISA法測定IL-6的實驗結果與Bio-plex液相蛋白芯片的相一致，表明液相蛋白芯片方法的敏感性與商品化ELISA試劑盒相當。甘草酸中、高劑量組和甘草總黃酮高劑量組能極明顯下調IL-6的表達水平 （P

4 討論

液相蛋白芯片技術同步性好、通量大、準確性高等特性能很好的突破傳統中藥研究中單個散在指標 的局限性，節(jié)約珍貴樣本，提高中藥研究結果的準確性和可靠性，全面把握中藥藥效作用的多個關鍵環(huán)節(jié)，系統地闡明中藥多通道、多靶點的作用機制。毛予龍等[12]報道了甘草酸苷能夠有效抑制LPS誘導小鼠RAW264.7細胞表達IL-6；王大南等[13]報道了甘草酸苷抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α；楊曉露等[2]報道了甘草黃酮類單體異甘草素能抑制RAW264.7細胞表達IL-1β和IL-6。與以往研究相比，本研究首次應用液相蛋白芯片技術檢測了甘草酸和甘草總黃酮對LPS誘導小鼠RAW264.7細胞表達的IL-6，IL-10和TNF-α等23種細胞因子的影響，首次發(fā)現了甘草酸能夠抑制LPS誘導小鼠RAW264.7細胞表達IL-1β，IL-3，IL-5，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13和Eotaxin，甘草總黃酮夠抑制Eotaxin的表達。

甘草酸能降低LPS誘導巨噬細胞產生的IL-1β，IL-3，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，Eotaxin和TNF-α共10種細胞因子的表達水平，從而抑制了T細胞的活化、B細胞的成熟、嗜酸性粒細胞和自然殺傷細胞的增殖；降低了抗體、前細胞因子、成纖維細胞產生的淋巴因子、集落刺激因子和急性期反應蛋白的表達水平；增強了單核巨噬細胞表面MHCⅡ類分子的表達；減輕了機體局部或整體的炎癥反應。甘草總黃酮能降低IL-6和Eotaxin的表達水平，從而減少了抗體的表達水平，抑制了嗜酸性粒細胞的增殖和趨化，起到了抗炎作用。甘草酸和甘草總黃酮的抗炎作用可能是通過抑制LPS與巨噬細胞表面TLR4受體結合，降低TLR4受體的活性，阻遏磷酸化的TLR4與MyD88蛋白的結合，抑制NIK蛋白激酶的自身磷酸化激活，阻遏IκB-α，IκB-β激酶的泛素化降解，穩(wěn)定NF-κB的非活性結構，抑制與炎癥反應相關基因的轉錄來實現的。

本研究顯示盡管甘草總黃酮抑制細胞因子的范圍不及甘草酸，但兩者都能通過有效抑制多種細胞因子的釋放，發(fā)揮多靶點抗炎效果，減輕系統性炎癥反應，起到顯著的抗炎作用；蛋白芯片研究技術可對甘草不同有效成分抑制細胞因子的釋放水平、抑制范圍和作用特點進行同步比較研究，能系統準確地把握中藥的抗炎機制作用特點，是適用于中藥及其成分藥效及分子機制研究的有效蛋白質組學技術。

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Effects of glycyrrhizin acid and licorice flavonoids on LPS-induced

cytokines expression in macrophage

LIU Zhao， ZHONG Ju-ying， GAO Er-ning， YANG Hong*

（Experimental Research Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Glycyrrhizin acid and licorice flavonoids are the component of Glycyrrhiza uralensis Fisch root that has been used for various medicinal purposes in traditional oriental medicine for thousands of years. Macrophages as a principal component of immune system play an important role in the initiation， modulation and final activation of immune response against pathogens.In the present study， glycyrrhizin acid and licorice flavonoids was investigated the anti-inflammatory effect on lipopolysaccharide （LPS）-induced macrophage cell line of RAW264.7. Well-grown RAW264.7 cells were collected and randomly divided into the blank control group， the LPS（1 mg?L-1）group， the dexamethasone（5 mg?L-1）with LPS group，the glycyrrhizin acid（400，80，16 mg?L-1）with LPS group and the licorice flavonoids（200，40，8 mg?L-1）with LPS group. RAW264.7 cells were cultured in 24-well plates， pre-incubated for 4 h with different concentrations of dexamethasone， glycyrrhizin acid ，or licorice flavonoids .Then cells were stimulated for 20 h with LPS. The supernatant of culture medium was collected from each well and determinated the concentrations of cytokines by means of Bio-Plex mouse cytokines assay. Compared with the control group， the LPS group could significantly induced relatively high levels of granulocyte colony stimulating factor （G-CSF），granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF），macrophage inflammatory protein-1 alpha （MIP-1α），macrophage inflammatory protein-1 beta（ MIP-1β），regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor（RANTES），tumor necrosis factor alpha（TNF-α），monocyte chemotactic protein 1（MCP-1），chemokine （C-X-C motif） ligand 1（KC），eotaxin，interleukin（IL）-1α，IL-1β，IL-3，IL-4， IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13， and IL-17 secretion（P

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隨著時代的進步以及經濟的發(fā)展，我國信用擔保體系也取得了一定突破。但在飛速發(fā)展的同時，信用擔保體系依舊面臨著一系列問題。本文從實際情況出發(fā)，對現存于中小企業(yè)信用擔保體系中的問題進行了深入分析，并進一步提出了可使我國中小企業(yè)信用擔保體系得到革新和完善的相關措施。

【關鍵詞】

中小企業(yè)；信用擔保體系；問題；解決措施

0 引言

為對中小企業(yè)的發(fā)展進行扶持和幫助，世界各國政府都制定了相關的中小企業(yè)信用擔保體系。當前，全世界共有50多個國家以及地區(qū)對中小企業(yè)信用擔保機構進行了建立。科學合理的中小企業(yè)信用擔保體系為中小企業(yè)解決了融資困難的問題，并有效地促進了當地中小企業(yè)的穩(wěn)步長效發(fā)展。另外，中小企業(yè)信用擔保體系對一國的經濟發(fā)展、社會穩(wěn)定也是有極大促進作用的。

1 現存于我國中小企業(yè)信用擔保制度中的問題

1.1信用擔保體系不具備完善的組織結構

當前，中小企業(yè)信用擔保結構主要由兩大類構成，一類是以美國為主的一級擔保結構，其分布在各地的分支機構由中央擔保機構設置；第二類是以日本為主的二級擔保結構，此類擔保結構由地方擔保機構和中央擔保機構組成。對這兩種中小企業(yè)信用擔保結構進行對比分析可知，其主要出資人都是政府部門，國家信用以及中央政府為其提供了保障。

當前，針對中小企業(yè)信用擔保體系，我國對“三層”的制度框架進行了確立。“三層”制度框架主要分為中央級、省級、地方市級，地方級主要對管轄范圍內受保企業(yè)的承保內容進行負責，省級則對地方市級擔保機構提供相應的擔保，而中央級則為地方級以及省級的小企業(yè)信用擔保機構提供擔保。不過到目前為止，國家級的再擔保機制卻并未得到建立。因此，擔保機制在施行的過程中，就會面臨國家財政支撐不足的問題，而中小企業(yè)也無法從中得到幫助。

1.2信用擔保資金缺乏穩(wěn)定的供給機制

對于中小企業(yè)信用擔保體系的穩(wěn)步運行而言，擔保資金補充機制是關鍵因素。在實際的運行過程中，隨著業(yè)務量的增大，代償資金也會隨之有所增長，單靠利息收入以及相關的擔保費，擔保機構是很難進行正常運營的。在我國，政策性擔保機構為非營利性組織，在收取擔保費時受到了國家的嚴格制約。商業(yè)性擔保機構雖然會通過提高擔保費來對資金進行補充，但在扣除各種經費以后，所剩的擔保資金也是非常少的。因此，受財力以及政策規(guī)章等因素的影響，我國中小企業(yè)擔保機構往往無法獲得充足的資金支持。這樣一來，擔保機構的承保能力就會逐步降低，中小企業(yè)的融資需求也得不到相應滿足。

1.3風險分散機制以及控制機制的缺乏

在為中小企業(yè)提供擔保的同時，擔保機構也需面臨一定的風險。當前，針對擔保機構，我國并未制定出科學合理的規(guī)章制度進行規(guī)范，國家級的信用再擔保機構也未得到建立，因此在面對擔保風險時，擔保機構就無法依靠再擔保方式對風險進行分散和控制。為了降低風險，擔保機構就不得不依靠反擔保措施，但第三擔保人的缺失、自身信用低等問題恰好是造成中小企業(yè)融資困難的主要因素。從理論層面來說，運用反擔保措施，擔保機構的風險會有所降低，但中小企業(yè)融資難的問題依舊無法得到合理解決。

1.4相關法制規(guī)章不具科學合理性

對于信用擔保企業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展而言，法制規(guī)章的完善是一大重要保障條件。在我國，與中小企業(yè)信用擔保行業(yè)有關的法律主要有：《擔保法》、《公司法》以及《中小企業(yè)促進法》等。但針對擔保機構，《公司法》并未進行明確規(guī)定；《擔保法》也沒有涉及到信用擔保機構；而《中小企業(yè)促進法》主要是起理論指導作用，并未對中小企業(yè)信用擔保體系的完善提供可行的操作方法。由于缺乏完整有效的信用擔保法律規(guī)章，因此在法律地位、運作規(guī)章、服務對象等方面，中小企業(yè)信用擔保機構都不具備明確的定位，而這也嚴重阻礙到了中小企業(yè)信用擔保體系的穩(wěn)步發(fā)展。

2 使我國中小企業(yè)信用擔保制度得到完善的相關措施

2.1對中小信用擔保體系的組織結構進行完善

2.1.1對扶持中小企業(yè)發(fā)展的中央政府機構進行建設

在西方，針對中小企業(yè)信用擔保機構，中央政府都設立了相關的管理扶持部門，而這也為中小企業(yè)信用擔保機制的完善和提升提供了保障。因此，在借鑒國外先進經驗的基礎之上，我們就需對相關的中央政府機構進行建設，對中小企業(yè)的扶持制度進行完善和落實，并對中小企業(yè)信用擔保結構的各項工作進行管理和幫助。在給予中小企業(yè)信用擔保機構幫助的同時，中央政府部門還需對中小企業(yè)信用擔保機構的業(yè)務標準、績效補償工作、行業(yè)監(jiān)督管理以及運行原則等進行管理。

2.1.2對多層次的再擔保機構進行建設

在擔保體系里面，對風險進行轉移和分散的一大主要方式就是再擔保。因此，我國信用擔保體系就需結合實際情況對再擔保制度進行建立，依靠再擔保的方式為中小企業(yè)信用擔保機構轉移部分風險。在我國，再擔保機構的建立主要可分為兩個層次，分別是省級再擔保機構以及全國性再擔保機構。對省內各地擔保機構的相關問題進行解決為省級再擔保機構的主要責任，而對省級再擔保機構的再擔保問題進行合理解決就是全國性再擔保機構的責任了。運用此種擔保機制，一方面可使擔保機構的擔保規(guī)模得到擴大，另一方面還能使擔保機構的部分風險得到有效減少。

2.2對科學合理的擔保資金供給機制進行建立

為了對有效的中小企業(yè)信用擔保體系進行建立，就需首先解決資金問題，使擔保體系擁有充足的資金來源。當前，我國各級政府部門都不具備雄厚的財力，而在收入分配中，居民部門以及實體部門都占據了較大的份額。因此，在對資金來源進行組織時，中小企業(yè)信用擔保機構需從實際情況出發(fā)，依靠多種渠道對擔保資金進行籌集。中小企業(yè)信用擔保機構還可以擴大對郵政儲蓄、社會保障基金以及保險基金等的融資力度，進而對資金進行獲取。倘若條件允許，一些商業(yè)性擔保機構還可以運用直接上市融資的方法籌集擔保資金。另外，政府可以依據一定比例從財政收入中拿出一部分錢對擔保資金進行補充，或者從征得的中小企業(yè)稅收總額中拿出一部分錢作為擔保機構的補償資金。最后，擔保機構可以依據一定比例從年利息收入和擔保費中提取一部分錢，用作風險補償資金。在條件允許的情況下，為了對擔保資金的外部補償進行實現，擔保機構還可運用到上市募集以及私募資金的方法。

2.3對風險分散機制以及控制機制進行完善

2.3.1擔保機構需和銀行之間建立起良好的合作關系

在為中小企業(yè)提供擔保業(yè)務以后，擔保機構幫助銀行減少了經營成本，使其信貸資金的安全性得到了提升。可見，擔保機構的擔保工作會為貸款銀行帶來直接利益。因此，協作銀行就需依據一定比例對擔保機構的貸款風險進行承擔，幫助擔保機構分散和避免風險。

2.3.2運用金融衍生品對風險進行分散

在我國，具有發(fā)展?jié)摿σ约昂诵母偁幜Φ闹行∑髽I(yè)是中小企業(yè)擔保機構的主要服務對象。因此，將合理的衍生工具，例如“擔保換期權模式”運用到中小企業(yè)信用擔保體系中，就可將中小企業(yè)的無形資產價值，即高增長潛力開發(fā)出來，使擔保機構由之前的承擔貸款風險變?yōu)橘Y本增值承擔風險，最終促使中小企業(yè)和擔保機構完成風險共擔。

2.3.3對動態(tài)的風險監(jiān)控機制進行建立

在進行擔保之前，擔保機構需對相關的擔保標準進行嚴格遵循，并在此基礎之上對中小企業(yè)的資信情況做出全面審查，審查內容為融資企業(yè)的資信狀況、償債能力、貸款申請、經營狀況以及反擔保措施等。在完成這一系列審查以后，才可決定是否為其提供擔保。在擔保的過程中，針對受保企業(yè)的資金使用情況、項目運行情況等，擔保機構需進行跟蹤監(jiān)測，旨在及時了解擔保風險的預警信息，并采取科學合理的方法完成風險防范。一旦出現了擔保風險，擔保機構就可依靠法律途徑對受保企業(yè)進行追償。

2.3.4對法制環(huán)境進行完善

為了推進中小企業(yè)擔保體系的完善和順利施行，我國就需加強法制建設，對相關的法律規(guī)章進行完善。另外，我國還需對信用擔保機構的相關法律進行調整，例如依據《中小企業(yè)促進法》，可對現有的《公司法》以及《擔保法》進行整理，進而制定出《中小企業(yè)信貸擔保法》，旨在對擔保機構的補償機制、性質、稅收機制、資本金來源以及風險分擔等方面進行明確，使中小企業(yè)信用擔保機構的順利施行得到法律上的保障。與此同時，還需對相關的配套法律進行完善，例如制定出中小企業(yè)促進法以及中小企業(yè)信貸法等，使各級政府所需承擔的責任得到明確，幫助信用擔保機構在債權保護、企業(yè)信息披露等方面獲得完整、有效的法律保障。另外，還需對涉及到社會信用體系的法律法規(guī)，即資信評估以及信用等級評定進行制定，最終促進中小企業(yè)信用擔保體系的穩(wěn)步發(fā)展。

3 結語

綜上所述，中小企業(yè)信用擔保制度的建設具有一定的復雜性以及系統性。因此，我們就需從我國的實際情況出發(fā)，對國外先進經驗進行借鑒，將理論和實踐結合起來，使信用擔保體系得到革新和完善，進而為我國中小企業(yè)的穩(wěn)步飛速發(fā)展提供幫助。這樣一來，我國中小企業(yè)的發(fā)展必定會走上一個新的臺階，并在社會主義現代化建設中發(fā)揮巨大作用。

【參考文獻】

[1]惲少景.中小企業(yè)信用擔保體系建設國際經驗及對我國的啟示[J]. 環(huán)渤海經濟望. 2013（09）.

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[關鍵詞] 細胞周期蛋白激酶抑制劑；腫瘤；細胞周期

[中圖分類號] R979.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）13-44-04

[Abstract] As normally accepted， the cell proliferation is regulated through cell cycle and the occurrence of tumor may lie in deregulation of cell cycle， directly resulted from the abnormal of the complex of cyclin dependent kinase（CDK）.It has become one of the most effective strategies to inhibit the activity of the complex for dealing with tumors.Thus，the study on CDK/Cylclin complex inhibitors is one of hot focuses in antitumor drug discovery.This thesis mainly discusses the types of CDK/Cyclin inhibitors and their clinical issues.

[Key words] Inhibitor；Cancer；Cell cycle

細胞周期的調控過程是在檢查點的監(jiān)視下，各種調控因子依次激活或滅活，從而啟動細胞完成DNA復制，分裂為2個子代細胞的過程。在諸多細胞周期調控因子中，細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）是處于核心位置，其與細胞周期蛋白Cyclins、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKIs）等組成細胞周期調控的網絡系統[1]。CDKs是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，目前有13種包括CDK1～13，分別在細胞周期調控CDKs（1～6）和轉錄調控CDKs（7～13）起作用。細胞周期的調控事實上就是檢查點的調控，其中以G1/S調控點最為重要。細胞周期受到外界信號如生長因子等刺激時，催化亞基CDK4/CDK6與調節(jié)亞基CyclinD結合后，CDKs殘基被磷酸化/去磷酸化修飾而被激活，CDKs激活后催化Rb蛋白使之磷酸化，Rb基因（retinob lastoma gene）又稱為視網膜母細胞瘤基因，是第一個被克隆的抑癌基因，其蛋白磷酸化后與轉錄因子（如E2F）形成復合物的能力喪失，E2F在細胞周期調控中起重要作用，能誘導CyclinE和CDK2的表達并形成CyclinE/CDK2復合體，后者進一步使Rb蛋白磷酸化，充分釋放E2F，隨后E2F進入核內激活一系列細胞周期進入S期的必須基因的表達。在S期內DNA復制晚期，CDK2被cyclinA激活，使轉錄因子E2F及時失活，阻止了由持續(xù)激活的E2F導致的細胞凋亡[2-3]。

1 CDK/Cyclin抑制劑的種類

研究統計顯示，有超過90%的人類癌癥中CDK、Cyclin、CKI和Rb途徑中相關基因發(fā)生了變異，其中CDK和其相應的調節(jié)亞基Cyclin的失常最為頻繁[2-3]。此外，細胞周期的波動促進了化療的抗性，降低了化療的效果。因此恢復細胞周期正常的CDK/Cyclin活性調控是治療腫瘤的策略之一。藥物研究人員已經把尋找不同類型CDK和Cyclin抑制劑作為前沿的抗腫瘤藥物的重點研究方向。目前CDK抑制劑主要有內源性的和外源性的兩種。

1.1 內源性小分子抑制劑

1.1.1 小分子量蛋白 內源性小分子抑制劑中最大的一類是低分子量蛋白質，根據結構功能的差異分為兩大類：一類稱雙重特異家族INK4，包括p15，p16，p18，p19，該蛋白家族可抑制cyclin D相關激酶的活性，其抑制作用依賴蛋白與相應的游離CDK4結合，從而阻斷CDK4與相應cyclin D結合形成具有催化功能的二聚體復合物。另一類叫Kip家族，包括p21，p27，p57，該蛋白家族可以和cyclin E/CDK2與cyclinA/CDK1組成的二聚體復合物再組成三聚體，通過封閉二聚體的催化活性中心從而發(fā)揮其抑制作用這些內源性抑制因子與激酶復合物結合后，可特異性地調節(jié)其活性，從而精確調節(jié)細胞由G1期向S期的轉化過程，內源性CDK調節(jié)劑的存在不僅提示細胞本身的分裂、增殖具有精密的調控機制，而且也反應了該信號轉導系統在細胞周期調控中的重要作用與地位[1-5]。研究表明，多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程與CDKs/cyclins的過度表達或其內源性抑制因子表達下降有關，如p16的缺失與小細胞和黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和結直腸癌的發(fā)生密切聯系[4-7]；p27蛋白的缺失常見于乳癌，前列腺癌，結腸癌以及消化道腫瘤[8-12]。因此，內源性CDKs抑制因子的缺失或基因突變是腫瘤診斷的重要參考指標。

1.1.2 非編碼小RNA 內源性小分子抑制劑還有一類是近年來發(fā)現的一類重要的非編碼RNA――microRNA，MicroRNA是一種長度在21～23nt的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3’UTR區(qū)的靶位點區(qū)域相互結合而快速有效地降解mRNA或抑制蛋白的翻譯，將蛋白控制在生命活動所需的較低或最佳的水平上。已發(fā)現的參與細胞周期調控的microRNA已有10余種，其中miR-1-2與miR-34分別靶向CDK4，細胞周期被停滯于G1期，近而抑制腫瘤細胞增殖[13-15]；miR-22靶向CDK6細胞周期停滯于G1期，誘導乳腺癌細胞衰老。在不同的生物學過程中，這些miRNA通過靶向E2F、CDK、cyclin、p21、p27、DNA多聚酶α等促進或阻滯細胞周期的關鍵調節(jié)因子，進而調控細胞周期的進程。

1.2 外源性小分子抑制劑

外源性的抑制劑包括反義核酸、抗體、小分子RNA干擾（siRNA）和小分子化合物四種。小分子化合物是最主要的一類外源性CDK抑制劑。

1.2.1 小分子化合物 近幾年來，由于對晶體結構的了解允許人們進行分子模擬研究，在設計開發(fā)高效、有選擇性的CDKs化學抑制劑的研究方面取得了突破性進展，可以說這類化合物每天都有新的成員在增加[15-17]。目前小分子CDK抑制劑可分為以下13類：（1）嘌呤類（Roscovitine and Olomoucin）、（2）嘧啶類（PD-033299）、（3）黃酮類（Flavopiridols）、（4）噻唑類（SNS-03）、（5）吲哚類及其衍生物（SU951）、（6）哌酮類（Paullones）、（7）咪唑并吡啶、吡唑并吡啶類（AZ703），（8）吡嗪類（AT751）、（9）丁酸內酯類（butyrolactone-1），（10）十字苞堿類（UCN-01）等13種，其中發(fā)展較快的為嘌呤類、嘧啶類、氨基噻唑類、黃酮類、吲哚咔唑類似物、Paullones、靛玉紅及其衍生物和吡嗪類。已有13個小分子抑制劑進入臨床實驗階段。它們都是平面雜環(huán)的小分子化學物，與ATP競爭性地結合在CDK激酶的ATP結合位點上。如Seliciclib[CYC202，（R）-roscovitine]是一個2，6，9-三元取代的嘌呤類似物，選擇性抑制CDKs/Cyclins，尤其是對CDK2/cyclinE的抑制作用最強。在體外對激酶活性的影響IC50值分別為CDK1/cyclinB（2.69μM）、CDK2/cyclinA（0.71μM）、CDK2/cyclinE（0.10μM）、CDK4/cyclinD1（14.21μM）、CDK7/cyclinH（0.49μM）、ERK-2（1.17μM）、PKA>50μM、PKC>100μM和SAPK>20μM。在體外，CYC202對多種人腫瘤細胞株的增殖有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等。IC50值范圍是7.9～30.2μM，在24h，達到80%凋亡率時，CYC202濃度是20μM。對正常細胞的毒性明顯低于對癌細胞的毒性，IC50在22.2～100μM這個范圍。CYC202能抑制凋亡抑制基因的表達，通過抑制MDM2的表達，阻滯p53的降解，誘導腫瘤細胞周期停滯G1/S與G2/M期，降低pRb的磷酸化水平，誘導細胞周期各個時相的細胞凋亡。體內實驗表明，CYC202耐藥性好，口服生理活性良好，對由人結腸癌、子宮癌細胞接種裸鼠體內的實體瘤有明顯的抑制作用。CYC202正在進行2個Ib期劑量增加的臨床實驗，在Ib期研究中發(fā)現，10例患有卵巢癌的患者服用CYC2024個月以上，腫瘤沒有增加和嚴重的治療相關的副作用，其中1個患者的腫瘤縮小了30%以上，治療1年以上的患者病情穩(wěn)定。Ⅱ期臨床研究發(fā)現，CYC202單獨應用效果稍差，與其他化療藥物聯合應用治療效果顯著。CYC202聯合卡培他濱治療乳腺癌，聯合2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷或順鉑治療肺癌、鼻咽癌的IIb期臨床實驗也在進行[18-24]。

1.2.2 小分子RNA干擾 小分子RNA干擾技術的發(fā)展和應用，使特異性的干預靶分子的基因表達的研究成為可能，有不少科學家開始從基因水平干預CDK/Cyclin的合成。Lima等[25-26]將靶向CyclinE的siRNA轉染到肝癌細胞Hep3B、HepG2、SNU449（CyclinE過表達），HuH7（CyclinE沒有過表達）后發(fā)現，在過表達CyclinE的細胞中，CyclinE的表達下降了90%，DNA合成明顯下降，細胞發(fā)生凋亡。Galimberti等[27]將分別靶向CyclinE、CDK2、CDK1的siRNA轉染鼠肺癌細胞HOP-62、H-522、H-23后，發(fā)現CyclinE/CDK2能引起細胞凋亡，抑制肺癌細胞的增殖，而CDK1siRNA對細胞凋亡無影響。CDK1 siRNA干擾導致的CDK1表達降低只引起細胞期阻滯，細胞增殖減慢；而CDK1和CDK2 siRNA的共同干擾作用導致的CDK1、CDK2表達同時降低，引起細胞周期S期和G2/M期的阻滯，同時誘導了細胞的凋亡。曹銀芳等[28]成功將靶向CDK2/CyclinE的siRNA重組表達載體轉染肝癌HepG2細胞后，發(fā)現CDK2和CyclinE mRNA表達顯著下降，細胞周期停滯于S期發(fā)生阻滯，G1期細胞明顯增多，Caspase-3活性增強，HepG2細胞發(fā)生了凋亡，并且細胞周期的改變與轉染后HepG2細胞體外增殖力下降是一致的。

2 問題與展望

CDK1，CDK2，CDK4，CDK6是熱門的抗癌靶標，但由于激酶ATP結合位點高度的保守性，選擇性小分子抑制劑的設計與開發(fā)是一個公認的難題。因激酶結構的保守性而產生的耐藥性和毒副作用，嚴重阻斷了化療藥物的抗腫瘤效應，限制和影響了治療的效果。研究發(fā)現CDKs/Cylcins抑制劑的臨床應用出現的最大問題是腫瘤的耐藥性導致了腫瘤的復發(fā)，療效明顯降低。其抗性的產生與該致癌激酶基因的擴增、補充途徑及信號通路的反饋調節(jié)相關。此外，其抗性還與藥物靶點的單一或群體突變有關，導致了藥物與靶點的親和性差。

siRNA藥物誘導的RNAi具有特異性和高效性，是對成癮性致癌基因實施靶向治療的理想選擇。研究發(fā)現，化療藥物與siRNA聯合作用于腫瘤細胞，具有協同作用，基因治療可作為化學治療藥物外的補充途徑。Wang等[29]發(fā)現，用livin-siRNA表達載體轉染腫瘤細胞導致livin基因沉默后，可激活caspase-3并增加腫瘤細胞對紫外線等其他促凋亡刺激信號的敏感性。用RNAi技術下調bcl-2或XIAP基因表達，可增加人乳腺癌細胞MCF-7依托泊苷及阿霉素的敏感性，表現為腫瘤細胞的數量與活性下降、凋亡率增加，較單一化療藥物處理組活性細胞數目明顯減少。Chistiane等[30]將針對多藥耐藥基因MDR1編碼的P-gp-siRNA轉染人胰腺癌細胞EPP85-181RDB和人胃癌細胞EPG85-257RDB，發(fā)現上述細胞對柔紅霉素的耐藥性分別下降了89%和58%。具有MDR特性的K562細胞經上述siRNA處理后，也觀察到類似效果。因此，siRNA干擾技術可能是解決臨床上藥物抗性的主要手段之一。

CDK及其相關蛋白表達異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。不少外源性或者是內源性的CDK抑制劑在抑制CDK后，都能很好的抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而單獨CDK抑制劑治療，會有腫瘤逃逸的現象，而無法根治腫瘤。因此與其他治療手段聯合的治療方式，將是CDK抑制劑研究的方向之一。

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篇6

關鍵詞：細胞凋亡；白介素1轉換酶；蛋白酶

1 概 述

細胞凋亡是區(qū)別于細胞壞死的一種細胞死亡形式，它是在一定的生理和病理條件下，一種并不引起機體炎癥反應的細胞程序性死亡（programmed cell Death， PCD）的過程。細胞凋亡這一概念最早由Kerr等提出的[1]，認為該種細胞死亡像秋天的樹葉凋謝一樣，故稱謂“Apoptosis”，希臘文即凋亡之意。細胞凋亡在形態(tài)學和生化改變方面具有特征性。形態(tài)學改變包括細胞皺縮，染色質濃縮，核裂解成碎片，最終細胞膜及內質網膜將完整細胞器及碎片包裹成多個分散的凋亡小體。生化改變以往認為內源性核酸內切酶活性增加染色質核小體間DNA斷裂是引起凋亡的一個啟動因子，但有些具有細胞凋亡特征性改變的卻沒有染色質核小體間DNA斷裂，有的甚至缺乏細胞核[1]，看來僅僅以此酶活性增加作為凋亡的啟動因子，不能得到滿意的解釋。目前許多學者都著重于對細胞內蛋白酶的研究，認為這些蛋白酶可能在細胞凋亡的啟動方面起著關鍵性作用。研究依據為：（1）在細胞凋亡早期已發(fā)現特異的、可復制的細胞內蛋白的降解[2]。（2）某些蛋白酶抑制劑可抑制細胞凋亡的發(fā)生[3]。（3）部分病毒蛋白質作用類似蛋白酶抑制劑，可以抑制細胞凋亡[4]。（4）基因刪除實驗證明某些蛋白酶在細胞凋亡中起著主要作用[5]。

2 白介素1轉換酶家族（ICE家族）

在蛋白酶的研究中，研究得最早且最多的為白介素1轉換酶（Interleukin 1 converting enzyme， ICE）是巰基蛋白酶的一種。ICE的作用是將無活性的31KD的前白介素1（在天冬氨酸羧基端降解為有活性的17.5KD的細胞因子。ICE由Black等和Kostura等[6]在1989年發(fā)現，此酶有高度的底物特異性。ICE高度表達導致細胞死亡，而ICE抑制劑如痘苗病毒CrmA可抑制由各種不同刺激因子誘導的細胞凋亡[7]。在線蟲C.elegans的遺傳學研究中發(fā)現1090個細胞中131個細胞出現了預定的細胞凋亡，調控該程序性死亡的基因已被確認。基因刪除實驗證明有2個基因ced-3和ced-4是引起細胞凋亡所必需的。盡管由ced-3編碼的多肽其功能還不十分清楚，但這一分子顯示與人類ICE有廣泛的相同部分，ced-3蛋白與ICE有29%氨基酸殘基同源性。ced-3蛋白最長的保護順序QACRG含有ICE活性所必需的半胱氨酸。14C碘乙酰胺標記和晶體學研究[8]均發(fā)現ICE活性位于半胱氨酸殘基，此基團在催化作用中起著關鍵作用。活性型ICE是一個四聚體，由兩個20KD和兩個10KD亞基因組成。它是由無活性型的45KD酶原在天冬氨酸-X連接處降解成20KD和10KD亞基。晶體學研究提示2個亞基均是酶活性所必需的[8]。由于ced-3蛋白和ICE間29%同源性促使對包括人類的哺乳類細胞凋亡過程中ICE作用的研究，已發(fā)現鼠成纖維細胞中ICE過度表達引起細胞凋亡。若涉及ICE催化活性半胱氨酸和甘氨酸基團突變，則導致催化活性和誘導轉染細胞凋亡的功能的喪失。由ATP誘導的鼠腹膜巨噬細胞凋亡及亞胺環(huán)已酮及腫瘤壞死因子誘導的Hela細胞凋亡過程中均發(fā)現有成熟的白介素1釋放[9]，提示ICE在細胞凋亡中被激活。目前對于與ICE活性有關的特異性底物還不十分清楚。隨著研究的不斷深入，ICE家族成員不斷擴大，統稱為ICE同類物（ICE homologues）。包括：1）Nedd-2，最初從鼠大腦細胞發(fā)育早期一組基因中發(fā)現的，后在人胎兒大腦細胞cDNA庫中分離得到相同的基因，命名為Ich-1（即ICE和ced-3同類物-1），其編碼蛋白順序與ICE和ced-3相同[10]，Ich-1有兩種不同的mRNA即長Ich-1和短Ich-1。長Ich-1過度表達誘導細胞凋亡。而短Ich-1過度表達抑制細胞凋亡。Ich和ICE相比不易被CrmA抑制[10]。2）CPP32與ced-3同源性為35%，與ICE同源性為30%，其在真核細胞內的表達能誘導細胞凋亡。CPP32又稱為YAMA和apopain。CPP32的底物特異性不同于ICE。前者在P1-P4位點偏向性為四 肽DEVD＞YVAD，而后者偏向于YVAD。前者易被DEVD-醛所抑制，后者易被YVAD-醛抑制。CPP32能降解多二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP），ICE及長Ich-1并不降解PARP。3）TX（亦稱為ICErelⅡ或Ich-2），與ICE有50%同源性，與ced-3有30%等同性[12]。該酶亦為巰基蛋白酶，能催化降解30KD的ICE前體變?yōu)橛谢钚缘腎CE[12]。TX在哺乳類動物細胞中的過度表達誘導細胞凋亡[12]。TX幾乎不降解前白介素1。4）ICErelⅢ與ICE等同性為52%，與ced-3同源性為25%。該酶也不降解前白介素1，但仍使轉染的Hela細胞發(fā)生凋亡。5）Mch2，是近年來發(fā)現的一個ICE家族成員，在氨基酸水平上與ced-3有35%等同性，與ICE有29%的同等性。Mch2不降解含有DEVD或YVAD產熒光的底物。Mch2底物的偏向性可能與CPP32或ICE的偏向性有很大不同。ICE家族偏向性成員的共同特性為：（1）這些蛋白酶參與催化降解作用依賴于P1位點的天冬氨酸，該特性與細胞毒T細胞特異的granzymeB有相同之處，后者為獨特的絲氨酸蛋白酶。（2）這些蛋白結構均為多聚體，一般為四聚體，由大為17-22KD，10-12KD的亞單位組成。大小亞單位由單一的轉錄編碼翻譯成酶原，然后在各種天冬氨酸-X鍵處降解為兩個亞單位。所有的ICE同類物都是具有相似的催化位點和相似的在等電點及天冬氨酸結合的部位。（3）這些蛋白酶均能自我催化或激活別的ICE同類物。由于在細胞凋亡過程中，ICE同類物并不是唯一的蛋白酶，許多描繪凋亡中蛋白酶的研究都是來源于蛋白酶抑制劑的研究，如TLCK、TPCK、TAME等，這些蛋白酶抑制劑抑制了與凋亡有關的各種細胞系統中DNA的降解[2，3，13]，故它們可能除了直接抑制ICE同類物外，還抑制ICE作用前或ICE作用后的蛋白酶（即非ICE蛋白酶）。

3 蛋白酶的底物特異性

近來研究顯示在COS細胞內過度表達的ICE、TX和Nedd2可降解PARP[14]，PARP是目前較明確的底物之一。CPP32除了降解PARP外，還降解固醇反應元件結合蛋白SREBP-1和SREBP-2。所有這些發(fā)現都提示盡管在ICE家族中成員間有部分功能的重疊，但底物特異性可以有所不同。如體外實驗純化的ICE濃度在降解PARP比降解前白介素1要高出50-100倍。ICE的天然底物是前白介素1，降解產生有活性的白介素1，奇怪的是granzyme A也激活前白介素1[15]。盡管granzyme A降解前白介素1的位點與ICE降解前白介素1的位點不同，但兩者激活的白介素1都具有生物學活性[15]，進一步證實了這樣一個觀點即存在不同種類的蛋白酶，其間有功能上的重疊。目前又發(fā)現層粘連蛋白（Laminin），能被稱為LamP的假定為ICE同源物蛋白酶降解。層粘連蛋白是較明確的一個底物，由于它的降解作為細胞核凋亡的一個標志，LamP的激活可能是凋亡過程終末階段的一個關鍵步驟。由于LamP至今還未被克隆化，到底其是否代表了ICE家族中的一個早已明確的成員？目前還不清楚。

4 iCE同類物間的相互作用

與ICE結構最相似的TX/ICErelⅡ和TX/ICErelⅢ（可能還包括其他成員）都不有效地降解前白介素1，這就意味著ICE主要作用是降解前白介素1，其它ICE同類物在過度表達時誘導細胞凋亡，由于這些蛋白酶在細胞凋亡中的作用的證據主要來源于其抑制劑的研究，而這些抑制劑如CrmA和AC-YVAD-CMK等并不具有高度特異性，其在不同程度上抑制所有ICE同類物，故不能區(qū)分到底是哪個蛋白酶在調節(jié)細胞凋亡中起主導作用。其次，CPP32可能降解PARP，Mch2也降解PARP及降解ICE，TX和Nedd2在足夠濃度時也降解PARP，故假定哺乳類動物（包括人類）細胞凋亡途徑涉及單一的某種ICE同類物似乎過于簡單化，所有這些都提示ICE同類物間是互相作用協同參與細胞凋亡的。

5 各種蛋白酶間的作用模式

如上所述，在細胞凋亡過程中涉及各種不同的蛋白酶，那么它們是如何協調的呢？由于大部分蛋白酶的底物還不清楚，部分蛋白酶還沒有被確認，因此要設想一個包容所有發(fā)現的單一模式似乎不可能。但不管怎樣，這些蛋白酶間的相互作用必為以下兩種模式的一種或不同階段以不同模式出現。（1）蛋白酶是同時被激活的，對凋亡信號的反應是彼此 獨立的，蛋白酶間沒有各種級別。（2）有級別的一系列級聯和/或連鎖反應。到底是何種模式，還有待于進一步研究。

6 蛋白酶抑制劑的作用

細胞外蛋白酶活性受內源性蛋白酶抑制劑高度調節(jié)，細胞內蛋白酶抑制劑已被發(fā)現。盡管后者被認為在調節(jié)細胞凋亡中起重要作用，但目前才開始受到重視。病毒serpin crmA的表達顯示能抑制由神經生長因子撤除誘導的脊髓背根神經節(jié)神經元的凋亡，還能抑制Fas配體和TNF誘導的不同類型的細胞株的凋亡[9，11]。目前還不清楚CrmA的抑制凋亡是由于ICE、CPP32的抑制或其它關鍵蛋白酶的抑制。近來又發(fā)現nexin1（另一種serpin）也可抑制自發(fā)的和axotmy誘導的小雞脊髓運動神經元的凋亡，血漿蛋白溶酶原激活抑制劑2（亦為serpin的一種），也顯示抑制TNF誘導的細胞凋亡。有趣的是，最近發(fā)現用熱誘導的FM3A細胞，用半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和天冬氨酸蛋白酶抑制劑pepstatin a測定FM3A細胞的高熱反應，結果顯示在加熱至44℃時出現顯著的細胞毒效應，提示蛋白酶抑制劑可能誘導細胞凋亡，該現象與以往認為蛋白酶抑制劑是抑制凋亡的現象不符合。那么就出現這樣一個問題：蛋白酶抑制劑是否存在雙向調節(jié)？在什么情況下可能出現誘導細胞凋亡？

7 目前存在的問題

近年報道與細胞凋亡有關的蛋白酶，除了ICE家族外，還包括：（1）fragmentin/granzymes（2）絲氨酸蛋白酶；（3）calpains（4）ubiquitin依賴的蛋白降解作用[17]（5）降解體內巰基蛋白酶如組織蛋白酶D（cathepsin d）[18]和組織蛋白酶B（cathepsinB）等。

近來發(fā)現組織蛋白酶D（天冬氨酸酶類）能促使干擾素、FAS和TNF誘導的細胞凋亡，且是調控細胞凋亡的一個限速酶。其抑制劑pestatin a抑制該系統細胞的死亡[18]。目前我們消化所實驗室也正在試圖研究在兩種不同的組織蛋白酶B表達的胃癌細胞株中的組織蛋白酶B抑制劑在細胞凋亡中的作用（待發(fā)表資料）。但是，我們尚缺乏足夠的證據表明以上蛋白酶在細胞凋亡過程中涉及的細胞內底物的性質和種類。事實上，在細胞凋亡過程中，絕大多數的細胞內蛋白質并未降解。另一方面即蛋白酶的良好底物使問題更趨復雜化。因此，研究和確認與細胞凋亡相關的蛋白酶的細胞內底物及該底物在細胞凋亡中的作用對于加深我們對細胞凋亡機制的了解具有重要意義。

8 細胞凋亡相關蛋白酶研究的臨床意義

眾多研究表明一種或多種蛋白酶可能在細胞凋亡發(fā)生、發(fā)展過程中起關鍵性作用。研究者們已認識到蛋白酶和蛋白酶抑制劑可能為臨床治療某些疾病，延緩或加速細胞凋亡過程提供新的途徑，例如可以應用一些蛋白酶抑制劑旨在延緩如缺血-缺氧所誘發(fā)的神經元、心肌腎臟上皮細胞的細胞凋亡進程。反之，可應用某些蛋白酶或某些蛋白酶激活劑（也有可能為某些蛋白酶抑制劑）來加速其細胞凋亡進程（如腫瘤等）。值得指出的是目前有關蛋白酶途徑在細胞凋亡中治療應用前景的討論還僅僅是一種推測，還需要作大量的實驗研究才能得到較明確的結論。

其中大致包括以下幾個方面：

第一，需了解細胞凋亡相關蛋白酶在細胞內是如何被激活的？激活過程是如何完成的？闡明蛋白酶在細胞內被激活過程及其調控因素對于發(fā)現新的臨床治療途徑會有幫助。

第二，如上所述，細胞凋亡過程可能會牽涉到多種蛋白酶的協同作用和連鎖酶解反應。近來研究表明層粘蛋白酶酶解反應可能繼PARP蛋白酶反應之后[19]。假定細胞凋亡涉及到多種蛋白酶的連鎖酶反應（瀑布效應），那么發(fā)現位于連鎖反應之首的蛋白酶將會為臨床治療提供獨特的靶目標。

第三，對細胞凋亡相關蛋白酶基因調控機制及細胞內代謝過程目前了解甚少。近年研究表明，表達腫瘤基因bcl-2的細胞其IRP的激活明顯減少[20]。實驗結果表明bcl-2可能為IRP的抑制劑。

第四，對腫瘤細胞內細胞凋亡相關蛋白酶的表達及其調控目前研究甚少。一方面，bcl-2或其它未知基因產物所誘導的蛋白酶激活抑制與腫瘤細胞不易凋亡有關。另一方面 ，腫瘤組織內某些蛋白酶基因在的過度表達和調控失常在腫瘤細胞凋亡中所起作用也應值得進一步研究探討。

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篇7

1　材料與方法

1.1　細胞株及抗體

人結腸癌細胞 DLD-1(colorectal adenocarcinoma cell line，KRASmutantG13D)及 Caco-2(colorectal adenocarcinoma cells line，KRASWT)細胞株均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由本實驗室傳代后液氮保存。用于細胞培養(yǎng)的 RPMI-1640培養(yǎng)基購自 Hyclone，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素、鏈 霉 素 及 Trypsin-EDTA(0.05%)均 購 自Gibco公司。西妥昔單抗(CETuximab，鼠/人嵌合抗EGFR抗體，IgG1)購于百時美施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb)公司。

1.2　方法

1.2.1　CIK細胞的體外擴增及鑒定　肝素抗凝管收集健康志愿者外周靜脈血 30mL，Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。將分離的 PBMC接種于T25細 胞 培 養(yǎng) 瓶 內，用 GT-T551無 血 清 培 養(yǎng) 基(Takara公司)調整細胞密度為 1109個/L。細胞培養(yǎng)瓶置于 37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，第 1天加入 1000000IU/LIFN-(PeproTech公司)及1%的自體血漿，24h后加入 300000U/L白細胞介素-2(Interleukin-2，IL-2，北京四環(huán)生物公司)和50g/L抗 CD3單克隆抗體(RD公司)繼續(xù)培養(yǎng)，每隔 3～4d補充新鮮培養(yǎng)基，調整細胞密度為1109個/L，同時補加 300000U/LIL-2，第 14～16天時開始收集細胞。

1.2.2　CIK細胞表型和 DLD-1、Caco-2細胞膜表面分子檢測　通過流式細胞檢測，按照 1106個/樣本將 CIK、DLD-1及 Caco-2細胞加入流式管中，洗細胞 2次，震蕩混勻后加入 Fc封閉抗體 anti-CD16/CD32封閉作用 30min。分別加入流式抗體FITC-鼠抗人 EGFR單抗(ebioscience)、FITC-鼠抗人 CD3單抗(BD)、PE-鼠抗人 CD56單抗(BD)、APC-鼠抗人 CD8單抗、APC-鼠抗人 CD16單抗或同型對照抗體，混勻后 4℃避光結合 30min，洗細胞 2次 去 除 未 結 合 的 抗 體，PBS重 懸 細 胞。BeckmanFC500型流式細胞儀檢測，Flowjo10.0軟件分析實驗結果，滿足 CD3+CD56+20%，CD3+CD8+60%的 CIK細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3　培養(yǎng)液上清中的細胞因子水平檢測　通過ELISA法，分別收集培養(yǎng)第 1天及第 14天的 CIK細胞培養(yǎng)上清液，分裝后 -80℃保存?zhèn)溆谩＜毎蜃訖z測：IFN-及 TGF-測定均采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明書操作;以標準品 450nm處的吸光度(OD)值做標準曲線，計算待測樣品中細胞因子的含量，每份樣本設 3個復孔。

1.2.4　CIK細胞聯合西妥昔單抗對人結直腸癌細胞的殺傷作用　通過實時無標記細胞分析儀(real time cellular analysis，RTCA，美國 ACEA公司)檢測，向 RTCA檢測板的檢測孔分別加入 100L完全培養(yǎng)液，放入 RTCA中讀取背景數據。取出 RT-CA檢測板接種預先制備的細胞懸液，DLD-1及Caco-2細胞分別以 2104及 1.5104個/孔接種，設腫瘤細胞單獨組、CIK-腫瘤細胞組及 CIK聯合西妥昔單抗-腫瘤細胞組，每組細胞設置 3個復孔，將 RTCA檢測板再次放回 RTCA，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 24h后加入西妥昔單抗(1mg/L)50L，其余孔補加 50L完全培養(yǎng)基。抗體孵育1h后按照 20∶1效靶比加入 CIK細胞 50L。將RTCA檢測板再次放回 RTCA儀，設置每隔 15min監(jiān)測并記錄細胞指數(cellindex，CI)值，連續(xù)監(jiān)測45h，選擇實驗第 45h數據計算殺傷率。按照下列公式計算：細胞殺傷率% =(對照組 CI值 -實驗組 CI值)/對照組 CI值 100%。

1.3　統計學處理

使用 Graph Pad Prism軟件來進行數據統計學處理，數據采用均數 標準差(xs)表示，符合正態(tài)分布的計量資料比較采用 t檢驗，P0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　Caco-2及 DLD-1細胞表面的 EGFR表達

本實驗中所使用的 Caco-2及 DLD-1細胞表面EGFR均高表達，分別為 81.6%及 82.9%。見圖 1。

2.2CIK細胞亞群

倒置顯微鏡下觀察 CIK細胞生長情況，誘導前細胞體積較小，呈圓形散在分布，在誘導培養(yǎng)過程中細胞體積逐漸增大，培養(yǎng)第 5天細胞開始形成細胞集落，隨著培養(yǎng)時間延長而集落增多，培養(yǎng)至第 14天時細胞體積明顯增大，CIK細胞于培養(yǎng)基中懸浮成團分布，數量顯著增多。見圖 2。與培養(yǎng)前比較，CIK細胞經過 14d的體外活化擴增后 CIK細胞亞群中 CD8+T、CD3+CD56+NKT及 CD16+CD56+NK細胞比例均顯著增高(P0.01或 P0.05)。見表 1。

2.3　CIK細胞培養(yǎng)基上清液中的 IFN-及 TGF-水平

ELISA結果顯示，與培養(yǎng)第 1天比較，CIK細胞培養(yǎng)第 14天時，培養(yǎng)基的上清液中 IFN-水平由 34.835.4ng/L增高為 2041.8697.9ng/L(P 0.01)，而 TGF- 的 水 平 由 1 293.8633.9ng/L下降為 116.726.8ng/L(P0.01)。見圖 3。

2.4　CIK細胞聯合西妥昔單抗對 DLD-1及 Caco-2細胞的殺傷作用

將經過 14d體外擴增培養(yǎng)的 CIK細胞作為效應細胞，結合有抗 EGFR單抗西妥昔單抗的腫瘤細胞作為靶細胞，按照 20∶1的效靶比將效應細胞與靶細胞共培養(yǎng)，RTCA法檢測 CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷效應。圖 4中顯示 CIK細胞對 DLD-1及Caco-2細胞株的殺傷率分別為 16.04% 0.87%及 27.67% 3.10%，而當聯合使用 1mg/L抗 EG-FR西妥昔單抗后殺傷率分別增高到 31.56% 3.55%及 35.96% 1.73%。

3　討論

篇8

關鍵詞：再擔保；信息共享；信息不對稱

中小企業(yè)在擴大就業(yè)，促進國內經濟結構合理發(fā)展中發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而由于中小企業(yè)資金實力弱、抵押品不足、信息不透明，融資難題一直制約中小企業(yè)的發(fā)展。我國從09年陸續(xù)成立再擔保機構，作為擔保行業(yè)的必要補充，再擔保機構主要為增強擔保機構的抗風險能力，緩解中小企業(yè)的融資難題。建立信息共享機制是改善信息透明度，逐步提升社會信用基礎，解決中小企業(yè)融資難困境的重要手段。

一、結合再擔保特點，明確體系建設中信息共享的必要性

（一）再擔保的作用及特點。再擔保機構是經濟發(fā)展到一定階段，國家為引導信貸資金促進實體經濟發(fā)展更多地投向中小企業(yè)，彌補擔保機構自身規(guī)模小、風險抵御能力弱而設立的。再擔保歸屬于擔保行業(yè)，具有：準入門檻高，數量較少；資本金規(guī)模大，抵御風險能力更強；成立時間短，行業(yè)監(jiān)管標準缺乏，經營模式尚在探索等特點。

（二）信息共享機制構建的必要性。

1、再擔保機構自身風險規(guī)避的需要。再擔保不能脫離擔保機構單獨存在，中小企業(yè)乃至合作擔保機構的業(yè)務規(guī)模、市場環(huán)境、經營風險、財務狀況等都對再擔保的風險控制造成直接影響，信息不共享將導致再擔保機構的自身經營風險。2、促進再保體系壯大，提供深層次服務的需要。一是有利于在再擔保體系內部建立客戶資源共享池，形成統一的風險控制標準。二是識別并及時共享信用記錄不佳的客戶信息，降低體系成員間共發(fā)性、傳遞性風險。三是通過共享的客戶資料，可以提高擔保業(yè)務運作效率。3、抵御再擔保行業(yè)競爭的需要。跨區(qū)域性的擔保機構進入再擔保領域將迫使再擔保按地域劃分各自領土的格局打破。信息共享機制的建立將會使現有的體系成員間合作更緊密，提高同行內的競爭力。4、有利于社會化信用體系的逐步建立。信息共享機制的建立，有助于中小企業(yè)信用擔保體系的建立，建立銀行等資金來源提供商與中小企業(yè)之間良好的信用關系，提高中小企業(yè)的信用觀念，從而促進整個社會信用體系的建立及完善。

二、信息共享的范圍及使用方法

（一）信息共享的范圍。信息共享機制主要為整個中小企業(yè)融資服務供應鏈服務，可以對整個供應鏈條上再擔保的上下游客戶提供服務，包含：再擔保體系成員，銀行、信托、證券等多渠道資金提供者，甚至是再擔保的各類監(jiān)督管理機構。

（二）信息共享的內容

1、建立企業(yè)、擔保機構的信用評級標準。按照中小企業(yè)的行業(yè)類型、營業(yè)額區(qū)間等條件，設立多個信用評價模型。建立包含：財務因素、外部評價、企業(yè)內部管理評價、信用預警等四方面的評估體系。采取量化模型及定性打分相結合的方式，建立較為全面的評級標準。2、建立客戶信用數據庫。通過多種手段吸引體系成員將中小企業(yè)客戶全生命周期的信息提供給共享平臺。共享平臺通過一定的權限分配，授權給體系成員使用。3、建立失信客戶數據庫。動員體系成員將自身代償及追償情況提供給信息共享平臺。共享平臺經過數據核實，在第一時間給有權限的體系成員，提醒體系成員關注個體及行業(yè)類擔保風險。4、建立定期體系發(fā)展報告制度。將體系成員共享的客戶及擔保項目信息，進行統籌規(guī)劃。結合行業(yè)的前瞻性研究，設計再擔保體系發(fā)展報告，定期公布。將再保體系內服務的各行業(yè)、各地區(qū)、各類融資渠道的擔保信息分析整理后形成分析報告，為體系內擔保機構明確自身行業(yè)定位、了解行業(yè)發(fā)展現狀、明確自身發(fā)展目標奠定基礎。

三、金融行業(yè)在信息共享方面提供的借鑒

（一）國外金融機構信息共享情況。在征信國家，通過加強客戶識別和嚴格監(jiān)管等信息方面的努力來降低信貸風險的方法已成為共識。規(guī)范中小企業(yè)的信息交流的機制采用自愿或公共權威機構強制執(zhí)行。

（二）國內銀行信息共享情況。我國銀行業(yè)間長期形成的信息壁壘，造成基礎數據體系不完備。目前銀行對客戶信用評級時所能采集到的相關信息比較有限，評級結果直接應用于信貸審批，但評級結論的實用性還有待提升。

（三）再擔保機構信息共享情況。江蘇再擔保通過搭建集中的體系成員共享平臺，實現為體系成員提供省域征信信息的查詢接口。體系成員可以免費使用江蘇再擔保的業(yè)務系統，定期通過數據報送接口報送數據。體系成員數據集中存放，但客戶資料并不共享。

廣東再擔保協調第三方專業(yè)評級機構，為體系成員做信用評級，并依此作為再擔保與之合作的基礎。利用評級結論，確定可以與擔保機構合作的業(yè)務品種。但信息共享平臺尚未搭建。

四、構建山東特色的再擔保體系信息共享平臺

（一）明確共享平臺中信息采集標準。擔保項目針對：合作地區(qū)、融資產品類別、服務金融機構、企業(yè)行業(yè)類別、大中小微企業(yè)分類、服務三農、服務高新企業(yè)等確定統一標準字典，建立成熟的，成員均認可的共享協議。

通過擔保項目保后管理情況的跟蹤，密切關注擔保合同實施后，企業(yè)的還款計劃的執(zhí)行情況，合同履約情況，應收應付款執(zhí)行情況，銀行貸款償還情況，產品質量，財務狀況變化。為擔保項目的風險出現提供預判。

（二）制度及管理保障。一是建立信息通報制度。建立包含體系成員、銀行信托公司等資金來源提供商的聯席會議制度，及時通報重大事項。促進成員及相關服務商的信息共享、數據共用。二是健全信息披露制度。定期向金融辦、中小局等監(jiān)管機構提供行業(yè)分析報告，在公司網站商披露不誠信企業(yè)名錄，把信息共享資料置于社會公眾監(jiān)督之下，防范風險于未然。三是建立信息存儲問責機制，確保共享信息的準確度。在共享信息的提供過程中，堅持“誰提供的信息誰負責”原則，嚴懲編造、提供、虛假信息及未經核實信息的行為。四是建立信息管理的密級，確保信息安全。按照體系成員與再擔保機構的合作程度，對信息實行密級授權，防范保密信息外泄，避免對體系成員業(yè)務開展造成損失。五是建立完善再擔保體系的獎懲與退出機制。對擔保覆蓋面廣、社會效益好、運行管理規(guī)范、代償率低、風險防范和合作良好的擔保機構，給予適當獎勵；對有不當行為的擔保機構以告誡或通報批評，令其限期整改，對違規(guī)情節(jié)嚴重的機構堅決清理出再擔保體系，維護再擔保體系的整體信譽。

五、結束語

再擔保作為一種新興行業(yè)，業(yè)務模式尚在探索，信息共享對再擔保公司凝練自身業(yè)務模式，實現融資規(guī)模放大的目標具有較強的保障作用。建立信息共享機制可以協助再擔保集團、體系成員提高項目風險的判斷力，對擔保業(yè)務開展、業(yè)務創(chuàng)新具有實質性提升作用。

參考文獻：

篇9

中小企業(yè)是與所處行業(yè)的大企業(yè)相比人員規(guī)模、資產規(guī)模與經營規(guī)模都比較小的經濟單位。隨著經濟的發(fā)展,中小企業(yè)日益成為國民經濟的重要力量。但是,

(三)努力促進商業(yè)性擔保機構的擴大和發(fā)展

從結構上來看,

雖然商業(yè)擔保是以盈利為目的,而中小企業(yè)貸款又呈現風險高和缺少反擔保品的特點,但是中小企業(yè)貸款擔保市場還是有足夠的吸引力吸引民間資本的進入。首先,從需求來說中小企業(yè)始終存在資金缺口。需要外源性間接融資,但中小企業(yè)的資信有限,所以離不開外部的融資擔保。中小企業(yè)擔保市場的需求是客觀存在的,市場容量也很大。其次,商業(yè)擔保機構可以采用多種風險分散機制來規(guī)避自身的擔保風險。如再擔保、參加貸款保險、反擔保條款和實行經營多元化等。政府除了積極建立再擔保機構外,還應該從工商和財稅等方面提供優(yōu)惠政策,扶持和鼓勵民間資本型中小企業(yè)擔保機構的發(fā)展。

(四)建立健全有關法律制度,營造擔保業(yè)發(fā)展的良好的運行環(huán)境

完善的法律體系是信用擔保業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的制度保障。綜觀美國、日本等發(fā)達國家的信用擔保體系,其共同點之一首先是相應的法律、法規(guī)建設非常完善。編輯整理

參考文獻:

[1]陳乃醒.中小企業(yè)信用擔保[m].天津:南開大學出版社,2004.

篇10

一、信息非對稱視角下中小企業(yè)融資障礙

根據古典經濟學理論，在以對稱信息、完全競爭、生產要素自由流動為特征完善市場條件下，主要由信貸市場的價格杠桿—利率來調節(jié)信貸資金的供給和需求，最終使信貸市場趨于均衡，信貸資源配置實現了帕累托最優(yōu)。但是，現實中很難具備的這種理想條件，非對稱信息現象是處處存在。根據非對稱理論不對稱信息可以分為事前非對稱和事后非對稱兩類。在信貸市場上，事前非對稱信息主要包括有關企業(yè)資產運營能力、償債能力、發(fā)展能力、投資項目質量等信息非對稱，導致逆向選擇。事后信息非對稱主要是指經營管理者對投資項目的決策以及經營者本身素質能力等信息非對稱，導致道德風險。信息非對稱，成為中小企業(yè)中融資的主要障礙。

（一）內部治理結構缺陷增加企業(yè)邊際信用成本 企業(yè)內部的信息結構應與其內部治理結構相匹配。多數中小企業(yè)是家族式企業(yè)，采用集權式管理模式，一般是最高管理層直接指揮操作層的員工進行生產活動，中層管理人員很少甚至不參與。基層信息零碎且分散，通常以不規(guī)范的表達形式傳遞給最高管理層。中小企業(yè)的這種信息結構在一定程度上減少內部信息利用成本，卻增大了外部投資者、債權人、供應商等外部信息使用者獲取和利用信息的成本，減少了信息對外披露的透明度。中小企業(yè)融資問題從根本取決于外部投資者和債權人等資金供給者對企業(yè)內部各種信息的信任度。因此，中小企業(yè)信息披露不規(guī)范必然會增加融資的邊際信用成本。

（二）中小企業(yè)自身特性增加銀行的交易成本 一般而言，在利息給定的情況下，影響銀行貸款決策的根本因素是銀行對客戶對象的風險識別和評估。中小企業(yè)多為個人或家族管理，規(guī)模小、經營周期短，而且基本上不需要由會計師事務所對其財務報表進行審計，一般信息內部化不透明。商業(yè)銀行貸款決定前，不得不耗費大量的時間來調查企業(yè)的財務和信用狀況以防范逆向選擇問題；發(fā)放貸款后，加大對借貸資金使用的監(jiān)管力度，以防范道德風險問題。此外，中小企業(yè)由于缺少符合銀行標準要求的抵押品和擔保人，銀行也很難提供抵押擔保貸款。因此，國有銀行才能夠防范信息非對稱可能產生的道德風險，對于中小企業(yè)的小規(guī)模融資需求需要支付額外的信用評估與監(jiān)督成本，以此防范信息非對稱，導致交易成本增加。

（三）中小企業(yè)非國有產權加劇信息非對稱風險 我國中小企業(yè)主要由鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)、城鎮(zhèn)集體企業(yè)、個體私營企業(yè)等非國有經濟組成，約占80%，其非國有產權的特性削弱了銀行對其放貸的意愿。由于我國傳統的體制因素，國有銀行、國有企業(yè)和國家財政在產權上都屬于中央政府，而中央政府并沒有建立有效的權力與約束相對稱的國有產權經營管理體制，所以，國有產權在經營管理上呈現出風險的“軟約束”。國有銀行貸款給國有企業(yè)時無須過多考慮國有企業(yè)的逆向選擇和道德風險問題，因為信息非對稱造成的風險最終會由國家財政來化解。所以國有商業(yè)銀行并不完全按照風險與收益對等的原則來確定貸款對象。當銀行貸款給非國有的中小企業(yè)時，由于產權歸屬不同，國有商業(yè)銀行不能將信息非對稱風險轉嫁給政府，完全由銀行來承擔，從而導致國有商業(yè)銀行在貸款給中小企業(yè)時出現“惜貸”現象。

二、信用擔保是解決信息非對稱的有效途徑

在信息非對稱的條件下，解決中小企業(yè)融資難問題，實質上就是解決信息非對稱問題。中小企業(yè)信用擔保發(fā)揮作用，其核心在于直接減少信息非對稱或規(guī)避和抑制逆向選擇和道德風險的發(fā)生，使得更多中小企業(yè)獲得信貸支持，同時分散了銀行貸款風險，擴大了銀行信貸規(guī)模和收益。

（一）信用擔保能夠提升中小企業(yè)信用水平與融資能力 由于自身特性因素，中小企業(yè)普遍存在著信用缺失的問題。無論自身資格條件還是抵押擔保條件都達不到銀行規(guī)定要求，中小企業(yè)很難直接從銀行獲得資金支持。管理規(guī)范的中小企業(yè)信用擔保機構具有嚴密的風險管理措施，在擔保對象的準入門檻、融資擔保規(guī)模的控制、反擔保措施的落實、擔保運作程序等方面，均有明確的管理規(guī)程，并在工作中嚴格執(zhí)行。因此，由上述機構提供介入擔保，協作銀行對其具有較高的信任度，能使中小企業(yè)信用得到提升。擔保機構除為中小企業(yè)提供融資擔保服務外，還為中小企業(yè)提供創(chuàng)業(yè)指導、信息咨詢、信用評級等方面服務，促進中小企業(yè)加強信用管理，樹立信用意識，營造良好企業(yè)信用環(huán)境。

（二）信用擔保有利于銀行分散風險、降低管理成本 由于中小企業(yè)資產規(guī)模較小、經營管理能力較弱、缺乏市場競爭力，另一方面金融機構對中小企業(yè)信貸激勵機制沒有建立起來，商業(yè)銀行出于資產的質量和貸款的安全性等要求，更傾向于將資金投放于大型企業(yè)。管理規(guī)范、運作專業(yè)的中小企業(yè)信用擔保機構介入中小企業(yè)貸款業(yè)務后，對受保中小企業(yè)、企業(yè)業(yè)主和主要經營者從道德、責任、財務、市場、政策、過程等方面實施全方位的考核和監(jiān)控，與銀行注重企業(yè)財務報表信貸考核體系形成優(yōu)勢互補，提高了對信貸風險識別、評估和控制能力。同時，信用擔保機構方面作為中小企業(yè)貸款風險的直接承擔者，使銀行的信貸風險得到轉移，增強了銀行貸款的信心。

（三）信用擔保促進了政府對中小企業(yè)的政策扶持作用 與大企業(yè)相比，中小企業(yè)在管理、信息、資金、技術、人才等方面都處于弱勢地位。由于中小企業(yè)在促進地方經濟發(fā)展和解決就業(yè)等方面都發(fā)揮著重要作用，國家和地方出臺多項優(yōu)惠政策，從稅收、用地、用工等方面對中小企業(yè)進行扶持，多面促進和支持中小企業(yè)的發(fā)展。能夠獲得足夠的資金支持是各項對中小企業(yè)扶持政策充分發(fā)揮作用的前提條件。信用擔保可以緩解中小企業(yè)融資難的問題，有利于各項政府政策的扶持功能的充分發(fā)揮。

（四）信用擔保有利于優(yōu)化社會信用環(huán)境 信用是市場經濟的基礎。市場化程度越高，對信用的要求就越高。現代金融、商品交換都是構建在信用之上的。企業(yè)作為我國市場經濟主體的重要組成部分，其信用水平直接影響著市場經濟秩序，企業(yè)信用等級越高，整個市場經濟的信用等級也會越高。信用擔保的出現，為企業(yè)贏得較高的信用等級獲得長期的資金支持，同時對優(yōu)化社會的信用環(huán)境起到了重要的引導作用，是提升整個社會信用水平的必然選擇。

三、中小企業(yè)信用擔保機制構建思路

（一）多層次的信用擔保體系 信用擔保機構作為市場經濟重要的參與主體，是中小企業(yè)信用體系建設的重要組成部分。根據我國中小企業(yè)自身特點，建立一個多層次、多渠道的信用擔保體系。依據《擔保法》和有關法律規(guī)定，分別建立企業(yè)法人、事業(yè)法人和社團法人三類法律形式三種擔保機構：（1）以政府為主體信用擔保基金，在政府機構的監(jiān)管下實行市場化運作，其基金主要來源于地方政府財政預算撥款、社會發(fā)行債券集資、中小企業(yè)閑置資金。（2）地方政府、金融機構和本地企業(yè)共同出資組建的擔保公司。由地方財政部門推薦中小企業(yè)，并對金融機構做出承諾保證責任，由擔保公司為當地的中小企業(yè)提供擔保。（3）會員制的擔保機構，由若干中小企業(yè)聯合組成信用共同體，實行封閉式基金運作形式，按“風險共擔，利益共享”的原則運作。

（二）多元化的信用評級機制 要建立以中小企業(yè)、政府相關部門、擔保機構、再擔保機構、中介機構和金融機構為主體的信用評級機制，其主要職能為信用登記、信用采集、信用評估和信用。首先，由政府相關部門與再擔保公司組織聘請權威評級機構對貸款擔保機構實施信用評級，根據評定的等級對擔保機構實行差異化管理。其次，政府有關部門組織信用評級機構，每年定期對有信貸需求的中小企業(yè)開展信用評級，銀行金融機構可以向符合信貸標準的中小企業(yè)提供融資服務；對信用等級較低的中小企業(yè)，通過信用培育幫助其提高信用水平。最后，在擔保機構、再擔保公司、銀行、企業(yè)、政府之間的建立信息互通機制，解決融資中信息非對稱問題。

（三）擔保機構的資金補償機制 可以借鑒國外通行做法，建立中小企業(yè)信用擔保體系風險補償基金。基金主要來源是政府每年在預算內安排一定的資金設立扶持擔保機構發(fā)展專項資金，為擔保公司對民營及中小企業(yè)開展擔保業(yè)務提供適當的經濟補償。也可以利用自身的發(fā)展推動中小企業(yè)更大的發(fā)展，按照一定比例從征自中小企業(yè)稅收中提取一部分資金專門用于擔保機構的資金補償。各級政府還可以通過發(fā)行專門用于補償政府中小企業(yè)擔保資金的專項國債。此外，為促進擔保機構規(guī)范運作和可持續(xù)發(fā)展，從擔保實力、規(guī)范運作、風險控制、無形資產、行業(yè)管理評價等方面制定中小企業(yè)信用擔保機構擔保績效評價指標體系。

（四）分散與規(guī)避風險的機制 擔保是高風險行業(yè)，相關部門應設計了一套風險分散機制，即擔保機構、銀行和企業(yè)在風險共擔、利益共享的基礎上共同協定責任比例。一是規(guī)范擔保機構自身運作。按合理的比例提取未到期責任準備金及風險準備金，用于防范擔保賠付。同時拓寬業(yè)務范圍，探索與銀行在中小企業(yè)貿易融資、融資租賃、票據貼現等業(yè)務領域的擔保合作，做大做強擔保業(yè)務，提高自身盈利水平；二是對中小企業(yè)實行風險約束，強化業(yè)主和管理者的責任，避免道德風險，在擔保條款中要求主要股東、管理者提供個人財產抵押；三是建立完善的信息披露機制，中小企業(yè)都要向有關部門匯報信貸保證計劃執(zhí)行情況，并審查計劃預算執(zhí)行情況。

（五）外部監(jiān)管機制 首先，由國有資產監(jiān)督管理委員會、財政、銀行等部門組成擔保監(jiān)督委員會，對擔保機構進行監(jiān)督和政策扶持。擔保機構應采取公司制的形式，要規(guī)范運作，防范風險。同時將政策性中小企業(yè)擔保機構統一納入中小企業(yè)信用擔保體系，并實行市場化運作。其次，建立信用擔保行業(yè)協會，加強行業(yè)協作與自律。協會要依據有關法律、法規(guī)和政策的規(guī)定，制定統一的業(yè)務準則，規(guī)范執(zhí)業(yè)行為，監(jiān)督擔保機構依法運作。同時，協會通過搭建平臺，通過培訓、研討等方式加強擔保行業(yè)協作、信息交流，樹立中小企業(yè)信用擔保機行業(yè)的良好社會形象和社會公信力。

（六）法律保障機制 要借鑒國外的成功經驗，完善我國中小企業(yè)信用擔保的法律法規(guī)。整合現有的《中小企業(yè)促進法》、《擔保法》和《公司法》，盡快出臺擔保行業(yè)的專門法律法規(guī)，搭建起中小企業(yè)信用擔保體系的基本框架，確定信用擔保活動的基本規(guī)則，使其更好地服務于中小企業(yè)。同時，完善中小企業(yè)信貸法、中小企業(yè)促進法等與信用擔保有關的配套法律，為信用擔保機構處理企業(yè)信息披露、債權保護、欺詐處理等方面提供法律依據和訴訟渠道，促進擔保機構的整體發(fā)展。另外，還應加快有關社會信用體系方面的法律法規(guī)建設，內容包括信用等級的評定、資信評估等，以利于中小企業(yè)信用擔保體系的發(fā)展。

參考文獻：

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